匹莫齊特對金黃色葡萄球菌的體外和體內(nèi)抗菌研究

陳 體,段 瑤,張曉潔,佘鵬飛,李穎佳

(1.中南大學湘雅三醫(yī)院檢驗科,湖南 長沙 410013; 2.中南大學湘雅二醫(yī)院精神衛(wèi)生研究所,湖南 長沙 410011; 3.國家精神心理疾病臨床醫(yī)學研究中心,湖南 長沙 410011)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,SA)是一種凝固酶和過氧化氫酶均陽性的最常見革蘭陽性球菌。SA通?？蓪е缕つw軟組織感染、菌血癥和骨關(guān)節(jié)感染等疾病,如治療不當,可造成嚴重后果,甚至死亡。隨著青霉素類抗生素的不合理使用,SA的耐藥率不斷增加[1]。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)是指含有mecA基因或者對苯唑西林耐藥的SA[2]。MRSA感染較甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)感染具有更高的病死率,是二十一世紀面臨的最重要問題之一。MRSA在醫(yī)療環(huán)境和相關(guān)感染患者中分離率極高,占臨床分離SA的45.9%[3]。由于MRSA廣泛的耐藥性,世界衛(wèi)生組織(WHO)不斷呼吁研發(fā)新型抗菌藥物來應對耐藥問題[4]。針對難治性MRSA感染的有效藥物研究可以減少患者對糖肽類抗生素如萬古霉素和替考拉寧的依賴性,從而減緩耐藥菌的產(chǎn)生。達托霉素是自2003年以來美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,FDA)唯一批準上市的天然抗生素,被認為是治療MRSA相關(guān)菌血癥的一線藥物,但2020年Thitiananpakorn等[5]發(fā)現(xiàn),MRSA對達托霉素和萬古霉素存在交叉耐藥。因此,新型抗菌藥物的研發(fā)已成為亟待解決的問題。

匹莫齊特是FDA批準的一種二苯基丁哌啶類抗精神病藥。1963年Janssen等[6]首次發(fā)現(xiàn),匹莫齊特可用于治療慢性精神病、Torette綜合征和耐藥性抽動。近年來有研究[7-8]發(fā)現(xiàn),匹莫齊特可有效治療結(jié)核分枝桿菌和傷寒沙門菌引起的感染,還能通過作用于泛素特異性蛋白酶1有效治療彌漫性大B細胞淋巴瘤。然而,尚未有研究報道匹莫齊特對SA的抗菌作用,本文對此進行了研究,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及儀器 恒溫搖床購自上海圣科儀器設備有限公司,恒溫孵育箱購自美國賽默飛公司,冷凍切片機購自德國徠卡公司,激光共聚焦顯微鏡購自日本蔡司公司,酶標儀購自美國Bio-Tek公司,麥氏比濁儀購自法國梅里埃公司,50 mL離心管和96孔無菌細胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司,全自動組織勻漿儀購自武漢谷歌生物有限公司,匹莫齊特、慶大霉素(gentamycin,GEN)、萬古霉素(vancomycin,VAN)、多西環(huán)素(doxycycline,DOX)、青霉素G(penicillin G,P)、克拉霉素(clarithromycin,CLA)、左氧氟沙星(levofloxacin,LEV)和促溶劑Cremophor EL均購自美國MedChemExpress公司,SYTO9/PI熒光染料購自美國賽默飛公司,CCK-8試劑盒購自美國MedChemExpress公司。

1.1.2 試驗菌株與動物 SA標準菌株USA 300和ATCC 43300購自美國標準菌種保存庫(American type culture collection,ATCC),表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis,SE)標準菌株RP62A由上海交通大學瞿滌贈送,銅綠假單胞菌標準菌株P(guān)AO1和大腸埃希菌ATCC 25922均購自ATCC菌種保存庫,SA臨床菌株于2019年分離自中南大學湘雅三醫(yī)院住院患者痰標本。所有菌株均接種于甘油磁珠中于-80℃保存,并于羊血瓊脂平板上連續(xù)傳代兩次后,挑取單個菌落進行試驗。6周齡雌性無病原菌級ICR小鼠購自湖南斯萊克景達有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 微量肉湯稀釋試驗 將對數(shù)生長期的菌液制備成濃度相當于0.5麥氏單位(McFarland,McF),用Mueller-Hinton (MH)肉湯稀釋200倍后備用。用MH肉湯將匹莫齊特稀釋至64 μg/mL,再進行倍比稀釋,使藥物濃度依次為64、32、16、8、4、2 μg/mL,分別加到96孔無菌細胞培養(yǎng)板中,每孔50 μL,再加入50 μL稀釋好的菌液。將96孔細胞培養(yǎng)板放置濕盒,37℃培養(yǎng)16～18 h后讀取最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC),即孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度。同時檢測并記錄630 nm處的OD值,即為細菌的相對生長濁度。從1×MIC至最高濃度孔中分別吸取5 μL培養(yǎng)液至羊血瓊脂平板上,37℃過夜孵育,以血瓊脂平板上生長的菌落數(shù)小于0.1%的接種菌量對應肉湯管中的最低濃度為最低殺菌濃度(minimal bactericidal concentration,MBC),即能夠殺滅培養(yǎng)基內(nèi)99.9%細菌的最低抗菌藥物濃度[9]。

1.2.2 匹莫齊特對生物膜的抑制和清除試驗 (1)生物膜抑制試驗:將匹莫齊特用胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptone Soya Broth,TSB)進行倍比稀釋,于96孔無菌細胞培養(yǎng)板每孔加入50 μL。挑取SA單個純菌落于TSB中,37℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。將菌懸液調(diào)為0.5 McF并用TSB稀釋至約1×106CFU/mL,每孔加入50 μL。將96孔細胞培養(yǎng)板放置濕盒中,37℃靜置孵育24 h,棄上清液,用生理鹽水漂洗3次去除未與孔壁結(jié)合的浮游菌。于酶標儀檢測630 nm處的OD值,即為生物膜的相對量。(2)生物膜清除試驗:將24 h振蕩培養(yǎng)的菌懸液用新鮮TSB 1∶200稀釋后,于96孔無菌細胞培養(yǎng)板中每孔加入200 μL。放置濕盒中,37℃靜置孵育24 h,棄上清液,用生理鹽水漂洗去除未與孔壁結(jié)合的細菌。將匹莫齊特用TSB肉湯進行倍比稀釋后,每孔加入100 μL,繼續(xù)靜置孵育24 h,用生理鹽水漂洗去除未結(jié)合細菌,并于酶標儀檢測630 nm處的OD值[9]。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)觀察生物膜 (1)生物膜抑制試驗觀察:將無菌蓋玻片放置于6孔板中,每孔加入1 mL含有不同濃度藥物的TSB培養(yǎng)基,再加入1 mL培養(yǎng)24 h的菌懸液,使其終濃度約為1×106CFU/mL。濕盒中37℃靜置培養(yǎng)24 h后,用生理鹽水去除未與蓋玻片結(jié)合的細菌,分別滴加20 μL濃度為10 μmol的SYTO9和PI熒光染液。避光孵育15 min后,用生理鹽水漂洗去除多余染液,并于CLSM觀察生物膜的熒光著色情況。(2)生物膜分散試驗觀察:將無菌蓋玻片放置6孔板中,每孔加入2 mL 1×106CFU/mL的菌懸液,37℃靜置培養(yǎng)24 h構(gòu)建生物膜。用生理鹽水去除未與蓋玻片結(jié)合的細菌,再分別加入2 mL含有不同濃度藥物的TSB肉湯。繼續(xù)37℃靜置孵育24 h后,用生理鹽水去除未與蓋玻片結(jié)合的細菌,進行SYTO9/PI染色,其余同上[10]。

1.2.4 棋盤稀釋法測定匹莫齊特與抗菌藥物的聯(lián)合抗菌效果 使用96孔無菌細胞培養(yǎng)板,用MH肉湯將匹莫齊特進行倍比稀釋,其他待測抗菌藥物最高從2×MIC濃度開始稀釋,均采用8個稀釋度,各取50 μL分別排列在平板的行與列上。在無菌微孔板中接種對數(shù)生長期SA ATCC 43300使終濃度約為5×105CFU/mL,37℃培養(yǎng)16～18 h后判斷結(jié)果,無細菌生長的最低藥物濃度為MIC。通過計算協(xié)同抑菌指數(shù)(fractional inhibitory concentration,FIC)判斷相互作用。FIC=聯(lián)合用藥時甲藥MIC/單獨應用甲藥時MIC+聯(lián)合應用乙藥時MIC/單獨應用乙藥時MIC,FIC指數(shù)≤0.5、>0.5～1、>1～2和>2時分別表示協(xié)同、相加、無關(guān)和拮抗作用[11]。

1.2.5 CCK-8檢測細胞毒性 使用DMEM高糖培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青霉素和鏈霉素雙抗(P/S),5% CO2,37℃體外培養(yǎng)HEK-293T細胞。待細胞匯合度達到80%后,使用胰蛋白酶消化貼壁細胞,待細胞消化完成后用DEME培養(yǎng)基終止消化,1 000 r/min離心5 min收集細胞,再使用DMEM培養(yǎng)基重懸細胞沉淀,并進行細胞計數(shù)。以每孔10 000個細胞的密度接種于96孔無菌細胞培養(yǎng)板中,每孔50 μL。再分別加入倍比稀釋的匹莫齊特,使其終濃度分別為64、32、16、8、4、2 μg/mL。將96孔細胞培養(yǎng)板置于二氧化碳溫箱孵育24 h。每孔再分別加入CCK-8溶液10 μL,37℃孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h,使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的吸光度[12]。

1.2.6 匹莫齊特體內(nèi)抗菌活性及毒性研究[13]將35只清潔級6～8周ICR雌性小鼠(體重約25 g)隨機分成5組,分別為對照組、匹莫齊特組、VAN組、DOX組、匹莫齊特+DOX組,每組7只小鼠。觀察小鼠的精神狀態(tài),生理狀態(tài),飲水和飲食情況,適應7 d后背部皮膚去毛備用。離心收集對數(shù)生長期SA ATCC 43300,用生理鹽水調(diào)成3 McF的菌液,每只小鼠背部皮下注射接種200 μL的菌液。感染30 min后,每組背部皮下分別注射劑量為30 mg/kg的相應藥物,對照組僅注射DMSO溶劑,觀察小鼠的精神、生理狀態(tài),以及飲水和飲食情況有無變化,如有明顯變化詳細記錄,感染24 h后觀察背部膿腫大小并拍照。采用心臟采血法采集小鼠血液,分離血清進行丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、尿素氮(urea nitrogen,Urea)和肌酸激酶(creatine kinase,CK)檢測,評價小鼠肝、腎及心肌功能。同時將小鼠背部膿腫部位剪下放入無菌試管中,每組7只小鼠膿腫組織,留取一個組織進行hematoxylin-eosin(HE)染色和革蘭染色,其余6個組織剪碎,添加1 mL生理鹽水,超聲破碎處理后進行細菌計數(shù)。HE和革蘭染色:取新鮮膿腫組織置于4%的多聚甲醛固定24 h,再沉糖48 h后用包埋劑進行包埋處理,將冷凍好的包埋組織進行冰凍切片及HE染色、革蘭染色,顯微鏡觀察組織切片[13]。

2 結(jié)果

2.1 匹莫齊特對SA的抑菌活性 藥敏試驗結(jié)果顯示,匹莫齊特對SA(包括MRSA和MSSA)具有良好的抗菌活性,MIC為8～16 μg/mL。匹莫齊特對SE也具有抗菌活性,MIC為16 μg/mL,但匹莫齊特對這些細菌的MBC均>32 μg/mL,且對常見的革蘭陰性菌,如銅綠假單胞菌和大腸埃希菌均無抗菌活性,見表1。2 μg/mL亞抑菌濃度的匹莫齊特對MRSA標準菌株也具有顯著的抑制活性,可分別使SA ATCC 43300(見圖1A)和USA 300(見圖1B)的菌量從(100±3.99)%、(100±3.80)%減少到(79.81±0.84)%、(69.58±8.54)%(q值分別為6.47、6.17,均P<0.05)。且隨著匹莫齊特的濃度增高,其抗菌活性越強,具有明顯的劑量依賴性。

注:****表示與對照組比較,P<0.000 1;A為SA ATCC 43300;B為USA 300。

表1 細菌對匹莫齊特的敏感試驗結(jié)果

2.2 匹莫齊特抗SA生物膜的作用 匹莫齊特抗生物膜活性的定量檢測結(jié)果顯示,4 μg/mL的匹莫齊特可明顯抑制MRSA生物膜的形成,使SA ATCC 43300和USA 300的生物膜形成量從(100±13.49)%、(100±6.43)%(見圖2A)分別降至(62.06±10.13)%(q=2.99,P<0.05)、(81.98±4.84)%(q=2.64,P<0.05)(見圖2B)。且隨著匹莫齊特濃度增高,對生物膜抑制效果越強。同時,8 μg/mL和16 μg/mL的匹莫齊特還能明顯清除已形成的生物膜,分別使SA ATCC 43300和USA 300的生物膜總量從(100±18.27)%、(100±6.72)%(見圖2C)減少至(55.60±9.80)%(q=3.89,P<0.05)、(9.11±1.14)%(q=23.98,P<0.05)(見圖2D)。進一步采用CLSM觀察生物膜的形態(tài)發(fā)現(xiàn),對照組生物膜結(jié)構(gòu)完整,主要呈現(xiàn)綠色熒光。采用8 μg/mL的匹莫齊特處理SA ATCC 43300菌株24 h后能有效抑制SA生物膜形成,有效降低綠色熒光強度且增加死菌(紅色熒光)比例(見圖3A)。對照組中已形成的生物膜幾乎布滿蓋玻片,以綠色熒光為主,幾乎未見紅色死菌(見圖3B)。而8 μg/mL匹莫齊特處理USA 300菌株后,生物膜結(jié)構(gòu)明顯破壞,總量明顯減少,紅色熒光比例增加。

注:A和B分別為匹莫齊特對SA ATCC 43300、USA 300的生物膜抑制作用;C和D分別為匹莫齊特對SA ATCC 43300、USA 300的生物膜分散作用;與對照組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1。

注:A為生物膜抑制作用;B為生物膜分散作用。

2.3 匹莫齊特與抗菌藥物聯(lián)合抗菌效果 分別選取不同種類的常用抗菌藥物與匹莫齊特進行聯(lián)合藥敏試驗,結(jié)果顯示匹莫齊特與VAN、CLA和P聯(lián)合均表現(xiàn)為無關(guān)作用,FIC值為2。匹莫齊特與GEN、LEV聯(lián)合為拮抗作用,FIC值均>2。但匹莫齊特與DOX聯(lián)合具有明顯的協(xié)同抗菌作用,FIC為0.5。見圖4。因此,后續(xù)動物模型中,選擇匹莫齊特與DOX聯(lián)用評估體內(nèi)抗菌活性。

圖4 棋盤稀釋法檢測匹莫齊特與常用抗菌藥物對MRSA SA ATCC 43300的聯(lián)合抗菌效果

2.4 匹莫齊特毒性及體內(nèi)抗菌活性檢測結(jié)果 CCK-8試驗發(fā)現(xiàn),匹莫齊特半數(shù)抑制濃度>64 μg/mL,細胞毒性極低。隨后,通過構(gòu)建小鼠膿腫模型,發(fā)現(xiàn)30 mg/kg的匹莫齊特雖然單用效果不佳,但其與30 mg/kg DOX聯(lián)用后,可顯著降低膿腫的大小(見圖5A),表現(xiàn)出有效的協(xié)同作用。匹莫齊特+DOX組還能明顯降低膿腫組織中的細菌載量,使活菌量從(8.25±0.13)對數(shù)值CFU/膿腫減少到(3.31±0.81)對數(shù)值CFU/膿腫(q=3.74,P<0.05)(見圖5B)。膿腫組織切片革蘭染色結(jié)果顯示,與未加藥的對照組比較,匹莫齊特+DOX組膿腫中的聚集細菌顯著減少(見圖5C);膿腫組織切片HE染色結(jié)果顯示,對照組具有明顯的炎性細胞浸潤,而匹莫齊特+DOX組可有效降低組織中的炎性浸潤(見圖5C)。與未加藥的對照組相比,匹莫齊特+DOX組對肝功能生化指標ALT、腎功能生化指標Urea和心肌功能生化指標CK的表達量均無明顯影響(均P>0.05,見圖6),說明抗菌劑量的匹莫齊特具有良好的體內(nèi)耐受性。

注:A為匹莫齊特單用或與DOX聯(lián)用后小鼠皮下膿腫的代表性圖片,紅色箭頭表示膿腫的位置,未標記的圖片表示未見膿腫組織,標尺為2.5 mm;B為膿腫菌載量計數(shù);C為HE染色和革蘭染色觀察膿腫病理改變,標尺為20 μm;*表示與對照組比較,P<0.05。

注:匹莫齊特+DOX組體內(nèi)毒性檢測結(jié)果,其中 ALT、Urea和CK分別代表肝、腎和心肌功能生化指標。

3 討論

難治性SA感染是臨床診療中的棘手問題,目前尚無針對SA生物膜有效的抗菌藥物,因此,新型抗菌藥物的研發(fā)亟不可待。老藥新用具有研發(fā)成本低和研發(fā)效率高等優(yōu)點,已成為當下的研究熱點。本研究通過系列試驗發(fā)現(xiàn),哌啶類抗精神病藥匹莫齊特具有有效的抗菌活性,其對SA的MIC為8～16 μg/mL。每毫升微克級別的匹莫齊特還能明顯抑制SA生物膜的形成,并能清除已形成的生物膜。此外還發(fā)現(xiàn),匹莫齊特與DOX聯(lián)用具有體外和體內(nèi)協(xié)同抗菌性及極低的細胞和體內(nèi)毒性。

SA生物膜是細菌的高耐藥表型突變。生物膜狀態(tài)下的SA,其耐藥性要比相應的浮游菌高10～1 000倍不等,成為復發(fā)性感染常見原因之一[14]。生物膜內(nèi)部常形成持留菌,持留菌是細菌的一種休眠體,不分裂增殖且胞內(nèi)代謝活性極低,對常見抗菌藥物均耐藥。持留菌可出現(xiàn)在生長的平臺期或生物膜內(nèi)部,當細菌周圍微環(huán)境發(fā)生改變時,持留菌可隨著營養(yǎng)物質(zhì)的獲得而轉(zhuǎn)變成增殖活躍態(tài)的細菌,從而引起感染反復[15]。近年來,研發(fā)針對生物膜的新型抗菌藥物已成為研究熱點。本研究發(fā)現(xiàn)哌啶類藥物匹莫齊特具有明顯的生物膜抑制和清除作用,對耐藥菌的殺菌特點使其比傳統(tǒng)抗菌藥物更具實用價值。類似的研究有:Lee等[16]發(fā)現(xiàn)治療特發(fā)性血小板減少性紫癜類藥物艾曲波帕對MRSA具有明顯的體外和體內(nèi)抗菌活性;Oliveira等[17]發(fā)現(xiàn)非甾體類抗炎藥物布諾芬能有效抑制SA生物膜的形成,并能進一步破壞細菌細胞膜,引起胞內(nèi)內(nèi)容物流出;再如,乙醛脫氫酶1型抑制劑雙硫侖對SA及其多重耐藥菌具有明顯的體外和體內(nèi)抗菌活性。雙硫侖還能清除SA已形成的生物膜,其胞內(nèi)殺菌能力和抗菌藥物后效應均優(yōu)于VAN[18]。

匹莫齊特具有極低的細胞毒性和良好的體內(nèi)耐受性。大鼠試驗中,匹莫齊特口服用藥的半數(shù)致死劑量高達1 100 mg/kg,小鼠的半數(shù)致死劑量高達228 mg/kg[19]。但仍有少量研究[20]報道,匹莫齊特單日服用劑量超過20 mg/d時可引起精神病患者猝死。但與其他抗精神病類藥物相比,匹莫齊特的不良反應仍然較小。本研究中,小鼠單次注射匹莫齊特的劑量為30 mg/kg,無論是單獨使用還是與抗生素DOX聯(lián)合使用,小鼠的精神、生理狀態(tài)及飲水和飲食情況與對照組比較,差異均無統(tǒng)計學意義。本研究發(fā)現(xiàn),處理時間段匹莫齊特小鼠肝、腎和心肌功能未出現(xiàn)明顯改變,說明當匹莫齊特作為抗菌藥物使用時,其有效治療劑量在處理時段對小鼠的體內(nèi)毒性較小。雖然匹莫齊特長期并多次給藥是否會對機體產(chǎn)生明顯毒性還需后期進一步研究,但考慮到SA主要以皮膚軟組織等局部感染為主[1],因此,可將匹莫齊特作為局部感染用藥或外用,以減少不良反應。此外,后續(xù)還可進一步對匹莫齊特聯(lián)用抗菌藥物進行優(yōu)化,探索最佳給藥劑量和給藥頻率,以降低匹莫齊特的用量。總而言之,匹莫齊特在臨床使用中具有高安全性、低不良反應發(fā)生概率、藥價便宜和可獲得性高等優(yōu)點。因此,具有極大的研發(fā)潛力,便于后期進一步改造優(yōu)化,以提高其抗菌活性并減少不良反應。

本研究中,匹莫齊特顯示出與DOX有效的體外和體內(nèi)協(xié)同抗菌效果?？咕幬锫?lián)用具有諸多優(yōu)點,如降低單種藥物的使用劑量即可達到最佳治療效果;增強藥物對MRSA的抗菌效果;有效降低細菌的耐藥性產(chǎn)生頻率等[21]。因此,低劑量的匹莫齊特還可作為DOX的佐劑,增強其抗菌效果和臨床實用性。

綜上所述,匹莫齊特對SA及其生物膜具有明顯的殺菌活性。匹莫齊特的細胞毒性低,且30 mg/kg的匹莫齊特還具有明顯的體內(nèi)抗菌活性。但本研究存在一定局限性,如匹莫齊特作為抗菌藥物使用時的體內(nèi)毒理學數(shù)據(jù)尚需要明確,匹莫齊特與DOX聯(lián)用時的體內(nèi)藥代動力學改變尚需進一步研究,匹莫齊特的作用機制尚未闡明等。此外,考慮到匹莫齊特本身用于治療精神病類疾病,因此,匹莫齊特可能更適用于精神病患者合并SA相關(guān)感染的治療。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。