基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究瓜子金抗腦缺血損傷的效應(yīng)機(jī)制*

顧瑛媛,張春菲,張浩洪,吳 招,鄒楠婷,莫慶艷,巨鳴謙,萬(wàn)春平△

(1.常州市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 常州 213003;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,云南 昆明 650021)

腦缺血(cerebral ischemia,CI)是一種臨床上常見(jiàn)的急性腦血管疾病,患者會(huì)發(fā)生類(lèi)似于腦出血或腦梗塞的臨床表現(xiàn),長(zhǎng)期的腦缺血可能會(huì)引發(fā)持久性或進(jìn)行性的神經(jīng)功能和認(rèn)知功能障礙[1]。腦缺血是致殘的主要原因,是世界范圍內(nèi)僅次于心血管疾病和癌癥的第三大死亡原因,其發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而上升[2]。大腦對(duì)缺血反應(yīng)非常迅速,僅僅幾秒鐘的時(shí)間大腦功能就會(huì)受損,但仍是可逆的。持續(xù)幾分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間的腦缺血可能會(huì)引發(fā)一系列連鎖反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞損失或是其他結(jié)構(gòu)發(fā)生變化導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的缺陷[3]。臨床治療缺血性腦損傷的原則之一是盡早恢復(fù)血液再灌注,這將有助于減輕缺血性腦損傷,使某些不可逆損傷至少在功能上得到恢復(fù)。但是,腦缺血后再灌注也可能會(huì)引起腦損傷,導(dǎo)致腦水腫、腦出血和神經(jīng)元死亡,這種現(xiàn)象稱為腦缺血/再灌注損傷(I/R)[4]。因此積極研發(fā)減輕腦I/R損傷治療方法,是降低患者死亡率和致殘率的重要手段。

瓜子金為遠(yuǎn)志科(polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的全草。具有祛痰止咳,活血消腫,解毒止痛功效,用于咳嗽痰多,咽喉腫痛;外治跌打損傷,疔瘡癤腫,蛇蟲(chóng)咬傷等癥[5-8]。瓜子金中的主要成分包括皂苷類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物,另外還有口山酮類(lèi)化合物、多糖等。研究已表明,瓜子金及活性成分具有神經(jīng)保護(hù)作用,對(duì)缺血再灌注損傷具有顯著的治療作用,但確切的抗缺血損傷的作用靶點(diǎn)及活性成分尚未明確。因此本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)鑒定其活性成分成分,預(yù)測(cè)其潛在的作用靶點(diǎn)及機(jī)制,為民間常用草藥瓜子金進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1 軟件與網(wǎng)站 數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件主要包括:化源網(wǎng)(https://www.chemsrc.com/)、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmcp.php)、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uni-prot.org/)、STRING數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)、VENN圖軟件、Cytoscape3.8.0軟件、R4.1.1軟件等。

1.2 瓜子金的活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 前期根據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研尋找瓜子金中所含的化學(xué)成分[5-11],利用化源網(wǎng)查詢其各個(gè)化學(xué)成分的CAS號(hào),TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索所有化學(xué)成分,以口服生物利用度≥30%和類(lèi)藥性≥0.18[13]為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行相關(guān)活性成分篩選。通過(guò) TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選活性成分對(duì)應(yīng)靶標(biāo),將篩選的靶標(biāo)成分與UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配,得到靶標(biāo)基因。再利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建瓜子金活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.3 腦缺血相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與腦缺血相關(guān)基因。為了使結(jié)果更加全面準(zhǔn)確,所使用檢索詞cerebral ischemia進(jìn)行檢索,獲取與腦缺血相關(guān)基因。

1.4 瓜子金活性成分靶點(diǎn)與腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 瓜子金活性成分靶點(diǎn)基因和腦缺血相關(guān)基因兩者利用R語(yǔ)言韋恩圖進(jìn)行合并,得到兩者合并的VENN圖,圖中交集的部分即瓜子金活性成分治療腦缺血的靶點(diǎn)基因,導(dǎo)出基因-疾病TSV文件。利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建瓜子金活性成分-疾病-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果制作藥物-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視圖。

1.5 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的分析 將瓜子金活性成分與腦缺血共同靶基因?qū)隨tring 數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置連接評(píng)分最小值為 0.900,得到蛋白互作關(guān)系導(dǎo)出TSV文件。利用R語(yǔ)言計(jì)算各主要蛋白之間的互作次數(shù)和核心靶點(diǎn),篩選出前30個(gè)核心靶點(diǎn)作PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因可視化圖。

1.6 GO功能富集分析與KEGG通路富集分析 GO 富集分析包括生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分,闡明在生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞成分方面哪些基因的代表性過(guò)高或過(guò)低[14-15]。首先將共同靶基因轉(zhuǎn)換成 entrezID,在R軟件安裝“Bioconductor”包,輸入藥物和疾病靶點(diǎn)文件,將其基因名轉(zhuǎn)換為entrezID,根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID,以P<0.05進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的 GO 和 KEGG 功能富集分析,結(jié)果均以條形圖和氣泡圖形式展示。

2 結(jié)果

2.1 瓜子金活性成分及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)篩選條件,從 TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中共獲得瓜子金4個(gè)活性成分,結(jié)果如表1。通過(guò) TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)和Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)校正去重,共獲得144個(gè)化合物相關(guān)潛在靶點(diǎn),利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建瓜子金活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 腦缺血相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選 通過(guò)OMIM、TTD、TCMSP、ETCM、DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與腦缺血相關(guān)基因,通過(guò)條件篩選其中OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中得到192個(gè)相關(guān)基因靶點(diǎn),TDD數(shù)據(jù)庫(kù)得到4個(gè),TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)得到6個(gè),ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)得到58個(gè),DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)得到118個(gè),GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)得到1550個(gè),篩除相同的基因靶點(diǎn)得到總的腦缺血相關(guān)基因靶點(diǎn)有1671個(gè)。

2.3 瓜子金活性成分靶點(diǎn)與腦缺血相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將瓜子金活性成分靶點(diǎn)基因與腦缺血相關(guān)基因用R語(yǔ)言韋恩圖進(jìn)行合并,制作出VENN圖,交集的靶點(diǎn)基因共有105,結(jié)果見(jiàn)圖2。推測(cè)這些可能為瓜子金治療腦缺血的基因靶點(diǎn)。通過(guò) Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建瓜子金活性成分-疾病-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),結(jié)果見(jiàn)圖3。圖中黃色代表藥物與疾病共同基因,藍(lán)色代表瓜子金的有效成分,并對(duì)該網(wǎng)絡(luò)圖中的每個(gè)節(jié)點(diǎn)的 Degree 進(jìn)行分析?？傻贸銮?位核心成分為常春藤皂苷元(hederagenin)、槲皮素( quercetin)、山奈酚(kaempferol)、1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮(Gentisein)分別能與15、132、55、5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)連接,其中對(duì)治療腦缺血具有重要的意義,具體見(jiàn)表1,選取 Degree≥3 的活性成分進(jìn)行展示。

圖3 瓜子金活性成分-疾病-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),網(wǎng)絡(luò)圖中的最小互助得分為>0.900,共涉及105個(gè)節(jié)點(diǎn),374條邊,平均度為 7.12,結(jié)果見(jiàn)圖4。利用R語(yǔ)言計(jì)算各主要蛋白之間的互作次數(shù),并據(jù)此找到核心靶點(diǎn),篩選出前30個(gè)核心靶點(diǎn)作PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因可視化,結(jié)果見(jiàn)圖5。左側(cè)為前30個(gè)核心基因名稱,X軸代表其節(jié)點(diǎn)數(shù)目,共獲得AKT1、IL-6、TNF、IL1B、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS等核心蛋白。

圖4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖6 GO富集分析柱狀圖(前20)

圖7 GO富集分析氣泡圖(前20)

2.6 KEGG通路分析 對(duì)105個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析,顯示參與 KEGG代謝通路共有163條,篩選前20 條發(fā)現(xiàn)通路主要與AGE-RAGE信號(hào)通路、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、Toll樣受體信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、乙肝、PI3K-Akt信號(hào)通路和C型凝集素受體信號(hào)通路等相關(guān),結(jié)果見(jiàn)圖8～圖10。相關(guān)通路涉及到炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與免疫調(diào)節(jié)等多個(gè)環(huán)節(jié),提示瓜子金可能通過(guò)調(diào)控該信號(hào)通路從而起到治療作用及調(diào)節(jié)多種代謝通路共同發(fā)揮治療腦缺血的作用。

圖8 KEGG通路分析柱狀圖(前20)

圖9 KEGG通路分析氣泡圖(前20)

3 討論

瓜子金為遠(yuǎn)志科(polygalaceae)遠(yuǎn)志屬(polygala)植物瓜子金(polygalajaponicaHoutt.)的干燥全草,《中國(guó)藥典》2015 年版一部收載用藥,瓜子金又名瓜子草、來(lái)麻回、散血丹、小遠(yuǎn)志、金鎖匙、地藤草[6-8]?！肮献咏稹笔且环N廣泛分布于中國(guó)南方的多年生草本植物。全草在民間醫(yī)學(xué)中被用作祛痰、消炎和抗菌藥物,主要含有黃酮、皂苷和類(lèi)固醇等活性成分[16]。研究表明,遠(yuǎn)志屬植物瓜子金的藥理活性包括:抗抑郁、抗炎作用、改善學(xué)習(xí)記憶和減輕認(rèn)知障礙、抗腫瘤、抗肝癌和抑制乙肝病毒及保肝作用、抗血和凝血作用、保護(hù)心腦血管、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠作用及神經(jīng)保護(hù)作用等[17]。臨床上主要用于治療骨髓炎、關(guān)節(jié)炎、失眠癥等疾病。已有研究表明,瓜子金皂苷己對(duì)缺血再灌注損傷的神經(jīng)細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用[18],然而確切的作用機(jī)制尚未明確,有待進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)證實(shí),從瓜子金中所含9個(gè)皂苷成分和41個(gè)黃酮類(lèi)成分中篩選得到4個(gè)活性化合物,分別是常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚、1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮,在腦缺血中相關(guān)靶點(diǎn)有1671個(gè),瓜子金活性成分與疾病共作用靶點(diǎn)有105個(gè),通過(guò)對(duì)交集基因進(jìn)PPI互作分析發(fā)現(xiàn),AKT1、IL6、TNF、IL1β、CASP3、TP53、JUN、MMP9、PTGS2、CXCL8、EGFR、HIF1A、PPARG、MYC、HSP90AA1、IL10、CCND1、FOS、IFNG等為關(guān)鍵基因。進(jìn)一步分析這些靶點(diǎn)和交集基因,瓜子金可顯著抑制炎癥反應(yīng)和介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)作用,以上核心成分可能作為瓜子金治療腦缺血的主要藥效群。KEGG通路富集結(jié)果中,其通路包括AGE-RAGE信號(hào)通路、血脂和動(dòng)脈粥樣硬化、Toll樣受體信號(hào)通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、IL-17 信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Th17 細(xì)胞分化、乙肝、PI3K-Akt信號(hào)通路和C型凝集素受體信號(hào)通路等。血脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化以及流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化與腦缺血發(fā)病密切相關(guān),已作為短暫性腦缺血發(fā)作的重要危險(xiǎn)因素[19-20],而AGE-RAGE信號(hào)通路一組特異性組合,通過(guò)激發(fā)多種細(xì)胞因子的形成與釋放,導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)、血管的病理改變。同時(shí)導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路,使血流調(diào)節(jié)受損,導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜血流灌注減少[21]。腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路和Th17 細(xì)胞分化為治療腦缺血的關(guān)鍵炎癥通路。腫瘤壞死因子(TNF)作為關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子,參與細(xì)胞凋亡、炎癥和免疫,誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng),IL-17家族可激活MAPK,NF-κB和C/EBPs途徑中的抗細(xì)胞因子和趨化因子,在免疫炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、免疫細(xì)胞的趨化遷移等發(fā)揮關(guān)鍵作用[22-23]。PI3K-Akt信號(hào)通路參與細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、細(xì)胞增殖、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及糖原代謝,同時(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路參與星形膠質(zhì)細(xì)胞Cx43的調(diào)節(jié)可能會(huì)對(duì)腦缺血損傷引起的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡具有神經(jīng)保護(hù)作用[24]。Toll樣受體信號(hào)通路中Toll樣受體TLRs廣泛分布在免疫細(xì)胞尤其非特異免疫細(xì)胞以及某些體細(xì)胞表面,它是生物一種模式識(shí)別受體,通過(guò)識(shí)別病原相關(guān)分子模式PAMPs來(lái)啟動(dòng)免疫反應(yīng)。研究表明,Toll樣受體4(TLR4)通過(guò)其信號(hào)通路誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子,是腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一,可能成為預(yù)防腦缺血再灌注損傷的新靶點(diǎn)[25]。

綜上所述,本論文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)了瓜子金的活性成分及其在腦缺血治療中的潛在靶點(diǎn),發(fā)現(xiàn)瓜子金中的常春藤皂苷元、槲皮素、山奈酚和1,3,7-三羥基-9H-氧雜蒽-9-酮可能通過(guò)調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路與Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路以及藥物結(jié)合、質(zhì)膜區(qū)響應(yīng)與神經(jīng)元影響等生物功能進(jìn)而影響機(jī)體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生存、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡進(jìn)程,從而發(fā)揮對(duì)腦缺血的治療作用,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用瓜子金治療腦缺血中提供了新的視角和線索,也為深入的機(jī)制研究和臨床應(yīng)用提供了方向。但數(shù)據(jù)庫(kù)中納入的信息有一定的局限性,還需進(jìn)一步通過(guò)疾病動(dòng)物模型和臨床進(jìn)行論證。