基于超高壓技術(shù)的牛骨蛋白綠色提取工藝初探

楊 浩,張 揚(yáng),高建萍,康躋耀,孔英俊,張貴鋒,張萬忠

(1.沈陽化工大學(xué) 制藥與生物工程學(xué)院,沈陽 110142;2.中國科學(xué)院過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實驗室,北京 100190)

牛骨中含有多種營養(yǎng)物質(zhì),其中,牛骨蛋白具有很高的營養(yǎng)價值[1]。牛骨中提取的蛋白具有抗高血壓、保護(hù)骨健康、抗菌、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等功效[2],如牛骨膠原肽通過消耗氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增加[3-4],發(fā)揮抗氧化功效。從天然牛骨中提取的具有多種功效的蛋白已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè),需求逐年增加,因而牛骨蛋白提取工藝的研究日漸被重視。

目前,以骨為原料的蛋白提取方法主要包括酸法、堿法和酶法[5]。在3種方法的提取過程中,必須首先破壞骨的結(jié)構(gòu)才能提取蛋白。因為在骨結(jié)構(gòu)中,羥基磷灰石以及膠原通過鈣交聯(lián)形成纖維結(jié)構(gòu)[6],該結(jié)構(gòu)致密,需在膠原纖維部分被破壞造成鈣流失的條件下,蛋白才可以從骨組織中釋放[7]。酸法是采用一定濃度的酸浸泡控溫使鈣質(zhì)流失,破壞骨無機(jī)成分進(jìn)行提取,蛋白得率可達(dá)2.24%[8],但會對設(shè)備產(chǎn)生腐蝕并污染環(huán)境[9];堿法是用氫氧化鈣溶液控溫使膠原明膠化,破壞骨纖維進(jìn)行提取[10],但與肽鍵相連的α-氫原子會發(fā)生酸堿反應(yīng)使氨基酸消旋產(chǎn)生有害物質(zhì)[11],已被酸法和酶法取代。酸法和堿法都面臨預(yù)處理和提取過程中消耗大量酸或堿、高能耗、污染環(huán)境且前處理復(fù)雜等問題。酶法是應(yīng)用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶制劑通過酶切非螺旋區(qū)破壞骨纖維之間的交聯(lián)進(jìn)行提取,但由于酶切位點(diǎn)的特定性和膠原分子三螺旋結(jié)構(gòu)不易被酶解的特點(diǎn),提取的蛋白分子量不均勻,不利于吸收[12]。以上3種方法各具優(yōu)缺點(diǎn),但骨蛋白提取過程的環(huán)境污染問題是三者共性問題,需要進(jìn)一步改進(jìn)。

超高壓技術(shù)(Ultra high pressure,UHP)是利用超過100 MPa的液壓,使生物高分子的氫鍵作用紊亂、立體結(jié)構(gòu)喪失,從而在不影響一級結(jié)構(gòu)的條件下釋放活性物質(zhì)[13]。當(dāng)前超高壓技術(shù)在動物源蛋白提取中主要起輔助作用,常用于豬皮、魚皮等結(jié)締軟組織[14-16],需要與其他如pH、酶等條件協(xié)同作用,但以骨為原料的超高壓提取方法并不多見。李紅霞等[17]通過超高壓前處理豬骨,木瓜蛋白酶提取,得到少量膠原蛋白及大量游離羥脯氨酸。針對骨組織,超高壓技術(shù)可以在靜力條件下促進(jìn)骨纖維表面剝落,破壞骨結(jié)構(gòu)從而釋放蛋白。同時,超高壓提取全程無污染,極大降低了環(huán)境污染處理成本。因而,本文以牛骨蛋白提取率為評價標(biāo)準(zhǔn),通過保壓時間、作用壓力及環(huán)境pH值[18-19]3個影響指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面分析選取最佳提取條件,研究牛骨蛋白的超高壓提取工藝,為新型牛骨蛋白提取工藝研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

牦牛骨粉購自青海雪牛生物工程有限公司;BCA試劑盒購自北京蘭博利德有限公司;其他試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超高壓設(shè)備UHP購自天津華泰森淼超高壓裝備工程技術(shù)有限公司;酶標(biāo)儀購自無錫華衛(wèi)德朗有限公司;凱氏定氮儀購自山東格林凱瑞有限公司;凍干機(jī)購自北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脫鈣方法

用0.72 mol/L的鹽酸按照1∶10浸酸料液比室溫攪拌8 h充分脫鈣[20];完成脫鈣后調(diào)節(jié)pH值至7.0,送入凍干機(jī)凍干2 d,得到脫鈣骨粉。

1.2.2 蛋白濃度測定

(1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:取20 mg蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BCA),加入1 mL蛋白標(biāo)準(zhǔn)稀釋液,充分溶解,并繼續(xù)稀釋至終濃度為500 μg/mL。

(2)加樣:分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。將500 μg/mL蛋白溶液按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96孔板標(biāo)準(zhǔn)孔中,用去離子水補(bǔ)充至20 μL;樣品孔中依次加入20 μL待測樣品,每個實驗組設(shè)置3次重復(fù)。每孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃條件下孵育30 min,酶標(biāo)板上覆膜,37 ℃溫浴1 h。

(3)測定:于562 nm波長測定吸光度值。

(4)計算:各孔吸光度值減去未加500 μg/mL蛋白溶液的吸光度,得到的差值為縱坐標(biāo),以蛋白濃度為橫坐標(biāo),得到標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到樣品的蛋白濃度。

1.2.3 蛋白提取率計算

提取液中蛋白量占脫鈣牛骨粉蛋白量的百分比即為蛋白提取率。

式中,v1為提取液體積,mL;c1為提取液中蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;m0為原料質(zhì)量,mg;c0為原料中蛋白量的百分比。

1.2.4 超高壓制備工藝

(1)單因素實驗條件篩選。

保壓時間的影響:稱取1 g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為4個樣本,每個樣本均加入10 mL去離子水;壓力150 MPa,各組樣品保壓時間分別為10、30、60、90 min。提取完成后,測定提取液蛋白濃度,計算提取率,分析保壓時間對提取率的影響趨勢。

作用壓力的影響:稱取1g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為5個樣本,每個樣本均加入10 mL去離子水;保壓時間為60 min,各組樣品作用壓力分別為100、125、150、175、200 MPa。提取完成后,測定提取液蛋白濃度,計算提取率,分析作用壓力對提取率的影響趨勢。

環(huán)境pH的影響:稱取1g脫鈣骨粉置于密封袋中,分為4個樣本,每個樣本均保持保壓時間60 min,作用壓力150 MPa;各組樣品的環(huán)境pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0。提取完成后,測定提取液蛋白濃度,計算提取率,分析環(huán)境pH對提取率的影響趨勢。

(2)響應(yīng)面優(yōu)化實驗及參數(shù)選擇。在單因素實驗基礎(chǔ)上,將蛋白提取率作為評價指標(biāo),應(yīng)用Design Expert 13軟件設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化實驗,確定超高壓輔助提取牛骨蛋白的最優(yōu)工藝條件。因素水平及編碼見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素及水平編碼值

(3)多次提取實驗。按照保壓時間60 min、作用壓力150 MPa、pH 7.0去離子水進(jìn)行第1次提取。提取后固體殘留烘干,按質(zhì)量均分為兩組a和b,分別依次加入5 mL去離子水和5 mL 0.5%(酶液比)中性蛋白酶水溶液,進(jìn)行第2次提取。第2次提取后固體殘留在同樣條件下進(jìn)行第3次提取。

2 結(jié)果與分析

2.1 超高壓輔助骨粉提取蛋白的單因素實驗

2.1.1 保壓時間對骨粉蛋白提取率的影響

作用壓力為150 MPa,提取液pH 7.0,保壓時間分別為10、30、60和90 min時,各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為21.093、29.733、30.947和24.733 mg;圖1為各組的蛋白提取率,依次為26.4%、37.2%、38.7%和31.2%。由圖1可知隨著保壓時間的增加,蛋白提取率在10～60 min上升,在90 min下降,這與骨粉中骨素析出有關(guān)[21]。骨素是骨結(jié)構(gòu)中不可溶的蛋白鹽類衍生物[22]。隨著保壓時間的延長,骨素的析出隨之增加,逐漸堵塞骨結(jié)構(gòu)的孔通道,影響后續(xù)蛋白的釋放,因而蛋白提取率出現(xiàn)先增高后降低的現(xiàn)象。根據(jù)實驗結(jié)果,保壓時間選擇60 min。

圖1 保壓時間對蛋白提取率的影響

2.1.2 作用壓力對骨粉蛋白提取率的影響

保壓時間為60 min,提取液pH 7.0,作用壓力分別為100、125、150、175和200 MPa時,各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為25.613、26.934、30.947、30.013和29.48 mg;圖2為各組的蛋白提取率,依次為32%、33.7%、38.7%、37.5%和36.9%。由圖2可知蛋白提取率在100～150 MPa升高,在150～300 MPa降低。隨著壓力升高,骨結(jié)構(gòu)的通道孔徑也在擴(kuò)大,加速了蛋白自骨纖維網(wǎng)絡(luò)上的脫落;但同時也加速不可溶骨素的析出,一部分水溶性蛋白與溶劑分子之間的斥力會在壓力作用下增大,降低溶解性能[23]。當(dāng)壓力超過150 MPa后,出現(xiàn)蛋白提取率降低現(xiàn)象,故作用壓力選擇150 MPa。

圖2 作用壓力對蛋白提取率的影響

2.1.3 環(huán)境pH對蛋白提取率的影響

保壓時間為60 min,作用壓力為150 MPa,pH值分別為5.0、6.0、7.0和8.0時,各組提取液中蛋白質(zhì)總量依次為28.16、30.8、30.947和29.76 mg;圖3為各組的蛋白提取率,依次為35.2%、37.6%、38.7%和37.2%。由圖3可知,提取率在pH 7.0時達(dá)到最高。這可能與牛骨中蛋白溶解性有關(guān)。在作用壓力150 MPa、保壓時間60 min,環(huán)境pH 7.0時酸溶性蛋白與堿溶性蛋白有部分被提取,所以該條件下蛋白提取率最高。在酸性環(huán)境下酸溶性蛋白提取率增加而堿溶性蛋白提取率隨之降低,在堿性條件下堿溶性蛋白提取率增加而酸溶性蛋白提取率降低,故環(huán)境pH值選擇7.0。

圖3 環(huán)境pH對蛋白提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實驗優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面實驗確定最佳超高壓輔助提取最佳工藝參數(shù)

在單因素實驗基礎(chǔ)上,使用Design Expert 13軟件,根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計,研究保壓時間(A)、作用壓力(B)和pH(C)共3個因素對牛骨粉蛋白提取率的影響,響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

根據(jù)實驗結(jié)果多元回歸分析,建立方程:

蛋白提取率=38.7+0.212 5A+0.95B-0.612 5C-0.3AB+0.125AC+0.2BC-3.51A2-4.59B2-5.26C2

響應(yīng)面實驗回歸模型方差分析如表3所示。由表3可知超高壓輔助提取蛋白回歸模型P<0.05,表明該響應(yīng)面模型顯著,可以明確表示牛骨蛋白在超高壓下提取與保壓時間、作用壓力以及pH之間的數(shù)量關(guān)系規(guī)律。模型中B2、C2的P值均小于0.01,差異達(dá)到極顯著,A2的P=0.012 3≈0.01<0.05,差異不顯著,誤差較小。經(jīng)查驗R2=0.930 2,表明有93.02%的響應(yīng)值可以用該模型進(jìn)行解釋,模型適用于本實驗理論解釋[24-26]。

表3 響應(yīng)面實驗回歸模型方差分析

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖4直觀顯示牛骨粉蛋白提取率與各個因素之間的相互關(guān)系。等高線的疏密程度用來反映不同因素對牛骨粉蛋白提取率的影響程度,等高線變化越密集,說明該因素對牛骨粉蛋白提取率影響越明顯。

(a)保壓時間(A)與作用壓力(B) ;(b)保壓時間(A)與pH(C);(c)作用壓力(B)與pH(C)。

由圖4(a)可得,當(dāng)pH(C)因素處于0水平位置,保壓時間在30～60 min時,蛋白提取率與保壓時間正相關(guān),60 min后,隨保壓時間增加提取率降低;作用壓力在100～150 MPa范圍內(nèi),蛋白提取率與作用壓力正相關(guān),超過150 MPa,蛋白提取率與作用壓力成反比關(guān)系。保壓時間60 min、作用壓力為150 MPa時蛋白提取率最高。由圖4(b)可得,當(dāng)作用壓力(B)因素處于0水平位置,保壓時間在30～90 min時,蛋白提取率先升高再降低;pH值在6～7范圍內(nèi),蛋白提取率與pH值正相關(guān),pH值超過7時,蛋白提取率與pH值成反比關(guān)系。保壓時間60 min、環(huán)境pH值為7時蛋白提取率最高。由圖4(c)可得,當(dāng)保壓時間(A)因素處于0水平位置,作用壓力在100～150 MPa范圍內(nèi),蛋白提取率先升高再降低;環(huán)境pH值在6～8范圍內(nèi),蛋白提取率與pH值先呈正比再呈反比關(guān)系。保壓時間60 min、pH值為7時蛋白提取率最高。

2.2.3 工藝優(yōu)化與驗證

分析二次回歸方程,可得到超高壓輔助牛骨粉蛋白提取率最優(yōu)條件:保壓時間為53.777 min,作用壓力為188.857 MPa,pH值為6.654,該條件下牛骨粉蛋白的理論提取值為36.058%。對最佳工藝進(jìn)行實驗驗證,根據(jù)現(xiàn)實工業(yè)生產(chǎn),將預(yù)測條件優(yōu)化為保壓時間54 min,作用壓力189 MPa,環(huán)境pH值6.7。結(jié)果得到在該優(yōu)化條件下,蛋白提取率35.62%,與理論模型預(yù)測值吻合度達(dá)98.8%,因此,該響應(yīng)面具有可參考性應(yīng)用價值。

2.3 多次提取實驗結(jié)果

多次提取的蛋白提取率結(jié)果見表4。結(jié)果表明,通過增加提取次數(shù),可以有效地將牛骨中的蛋白進(jìn)一步釋放,提高蛋白提取率,3次提取后提取率可達(dá)54.2%。結(jié)合中性蛋白酶可以釋放一部分難溶蛋白,提高蛋白提取率,最高可達(dá)59.3%。

表4 多次提取蛋白提取率

3 結(jié)論

本研究以市售牛骨粉為原料,采用超高壓輔助pH提取法對骨粉內(nèi)的蛋白進(jìn)行提取。根據(jù)單因素實驗結(jié)果選出對蛋白提取率有顯著影響的因素(保壓時間、作用壓力和pH值),進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面實驗,最終得到超高壓輔助pH提取法提取骨粉蛋白最適條件為保壓時間54 min,作用壓力189 MPa,pH 6.7,在此提取條件下,蛋白提取率可達(dá)35.62%。

通過響應(yīng)面優(yōu)化方法,建立利用超高壓提取牛骨蛋白的方法,篩選最佳牛骨蛋白超高壓提取條件,證實超高壓技術(shù)可以在溫和環(huán)境下有效提取牛骨蛋白,在pH 7時提取率可達(dá)38.7%,經(jīng)檢測牛骨蛋白含量為8.00%,本方法單次提取的得率可達(dá)3.10%,將提取次數(shù)增加至3次,得率可達(dá)4.34%,結(jié)合中性酶提取可將得率提升至4.74%。酸法提取牛骨蛋白的得率為2.20%～2.24%,酶法的得率為2.03%～3.32%[8,27-28],本方法的單次得率高于酸法,與酶法得率相當(dāng),增加提取次數(shù)或結(jié)合中性酶法提取可使得率高于現(xiàn)有方法,具有應(yīng)用推廣意義。

超高壓提取過程的能耗主要是升壓過程中的電力消耗,升壓過程不超過1 min,后續(xù)保壓過程能耗很低,按照廠家提供的處理200 kg的大型設(shè)備計算,1 h的提取過程用電不超過10 kW。超高壓提取方法的成本主要是設(shè)備投資,按設(shè)備折舊年限15年計,1噸牛骨蛋白的設(shè)備成本為35 178.4元,加上生產(chǎn)消耗的水電等,成本不超過5萬元/t,目前牛骨蛋白市場價格為7萬元/t,方法具有經(jīng)濟(jì)可行性。隨著工藝優(yōu)化、設(shè)備改進(jìn)、生產(chǎn)規(guī)?；?超高壓提取方法的成本會逐漸降低,而且整個過程無需添加酸或堿,可有效降低污染處理成本,有利于提高經(jīng)濟(jì)效益,為牛骨蛋白的綠色提取提供實驗依據(jù)。