橡膠炭疽菌HD-1的鑒定及拮抗藥劑篩選

褚凌龍,婁嘉雯,劉文波,靳鵬飛,繆衛(wèi)國(guó)

(海南大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院 熱帶農(nóng)林生物災(zāi)害綠色防控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,海口 570228)

巴西橡膠樹(shù)Heveabrasiliensis是一種較為典型的熱帶雨林植物,它所分泌的膠乳是重要的工業(yè)原料[1]。由炭疽菌引起的橡膠樹(shù)炭疽病是我國(guó)橡膠樹(shù)生產(chǎn)上最為嚴(yán)重的病害之一[2]。橡膠樹(shù)炭疽病主要由炭疽菌屬Colletotrichum的膠孢炭疽菌復(fù)合菌群C.gloeosporioidesspecies complex引起,是我國(guó)常見(jiàn)的炭疽菌總?cè)?寄主范圍廣泛,主要通過(guò)角質(zhì)層下內(nèi)部侵染和細(xì)胞內(nèi)半活體營(yíng)養(yǎng)性侵染兩種方式對(duì)寄主的葉片、葉柄和嫩梢進(jìn)行侵染[3]。隨著氣候的變化,病原菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性逐漸增強(qiáng),并且橡膠樹(shù)的抗病能力有所下降,導(dǎo)致橡膠樹(shù)炭疽病頻繁發(fā)生,對(duì)膠乳的生產(chǎn)行業(yè)產(chǎn)生了許多不利的影響[4]。

到目前為止,區(qū)分炭疽菌屬的真菌,是以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)為主體,對(duì)炭疽的種類進(jìn)行初步鑒定,并結(jié)合純培養(yǎng)學(xué)、寄主專一性等來(lái)明確菌株的確切的種[5]。在形態(tài)學(xué)鑒定方面,主要通過(guò)對(duì)菌株的菌落形態(tài)、分生孢子的形態(tài)和大小、附著胞,以及菌核的有無(wú)等方面進(jìn)行觀察,對(duì)菌株進(jìn)行鑒定,而炭疽屬的真菌,絕大多數(shù)的菌株都具有廣泛的寄主,沒(méi)有嚴(yán)格的轉(zhuǎn)移寄生性[6]。在分子生物學(xué)鑒定方面[7],目前使用ITS、ACT、CHS-1、GAPDH、GS等基因,通過(guò)單個(gè)基因或者多個(gè)基因聯(lián)合建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近來(lái)確定菌株的分類地位。國(guó)際上將炭疽菌主要?jiǎng)澐譃閹讉€(gè)類群:尖孢炭疽復(fù)合種TheC.acutatumspecies complex、白蠟樹(shù)炭疽復(fù)合種TheC.spaethianumspecies complex、毀滅炭疽復(fù)合種TheC.dstructivumspecies complex、束狀炭疽復(fù)合種TheC.demaliumspecies complex、膠孢炭疽復(fù)合種TheC.gloeosporioidesspecies complex、博寧炭疽復(fù)合種TheC.boninesespecies complex、禾生炭疽復(fù)合種TheC.graminicolaspecies complex、平頭炭疽復(fù)合種TheC.truncatumspecies complex和圓孢炭疽復(fù)合種TheC.orbiscularespecies complex等9個(gè)復(fù)合種和部分獨(dú)立的種[8]。

目前,田間對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病的防治主要從3個(gè)方面進(jìn)行:農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治。其中,化學(xué)防治是橡膠樹(shù)炭疽病的主要防治方法,但是多年來(lái)防治方法較為單一、藥劑少,導(dǎo)致病原菌已出現(xiàn)耐藥性[9-12]。我國(guó)目前登記用于炭疽病防治的藥劑中,根據(jù)殺菌劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)可大致分為11類,主要為咪唑類、三唑類、甲氧基丙烯酸酯類、二硫代氨基甲酸鹽類等。其中,以苯醚甲環(huán)唑?yàn)榇淼娜蝾悮⒕鷦┖鸵远嗑`為代表的苯并咪唑類殺菌劑是防治橡膠樹(shù)炭疽病的主要藥劑[13]。三唑類和咪唑類殺菌劑都屬于脫甲基化酶抑制劑(DMI)類殺菌劑,通稱為唑類,如咪鮮胺。這一類的化合物可以通過(guò)對(duì)CYP51酶的活性進(jìn)行抑制,從而導(dǎo)致炭疽菌合成麥角甾醇的前體物質(zhì)在菌體細(xì)胞中不斷累積,對(duì)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行破壞,產(chǎn)生一定的毒害作用,最終導(dǎo)致菌體細(xì)胞死亡[14-16]。研究表明DMI類殺菌劑對(duì)炭疽病的防效差異較大[13],C.gloeosporioides復(fù)合種對(duì)所有被測(cè)DMI藥劑均敏感;但在2個(gè)親緣關(guān)系極為相近的同屬C.acutatum復(fù)合種中,C.fioriniae也對(duì)所有被測(cè)DMI藥劑敏感,C.nymphaeae卻對(duì)粉唑醇和腈苯唑表現(xiàn)為抗性;此外,C.truncatum對(duì)大多數(shù)DMI類藥劑表現(xiàn)為抗性或者不敏感[11]。炭疽病菌對(duì)DMI類藥劑存在天然抗性,頻繁使用藥劑也會(huì)導(dǎo)致病菌敏感性下降。采自浙江省葡萄上的膠孢炭疽菌菌株對(duì)戊唑醇已產(chǎn)生了中等抗性[17]。

生物防治因具有高效、低毒、環(huán)保的特點(diǎn)而備受矚目,已報(bào)道的可防治炭疽病的生防菌種類較多,其中,以芽孢桿菌和放線菌被研究得最為廣泛。樊蘭艷[18]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1所產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)以及脂肽類物質(zhì)能夠有效抑制橡膠炭疽菌;枯草芽孢桿菌BD0310能夠很好地控制茶葉炭疽菌[19];從文心蘭葉片中分離出的菌株EB75經(jīng)鑒定為一株解淀粉芽孢桿菌,通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該菌株對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率為58.79%,其發(fā)酵原液對(duì)膠孢炭疽菌的抑制率達(dá)到了77.69%,即使高溫處理后仍具有41.26%的抑制率[20];竺利紅等[21]研究表明,不同稀釋倍數(shù)的貝萊斯芽孢桿菌SM905發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌具有一定的抑制作用,其5倍稀釋液對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)到97.89%,經(jīng)處理后的氣生菌絲表現(xiàn)為空洞、畸形、色素積累,菌絲生長(zhǎng)稀疏、膨大。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)和ITS單基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的方式對(duì)一株從海南省儋州市橡膠園采集的橡膠樹(shù)葉片上分離得到的橡膠炭疽菌HD-1進(jìn)行初步鑒定,并且對(duì)該菌株的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,測(cè)定并比較了4種傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥和生防菌B.velezensisHN-2發(fā)酵上清液正丁醇提取物對(duì)該菌株的EC50,本研究為田間橡膠樹(shù)炭疽病的防控提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來(lái)源

橡膠炭疽菌HD-1和貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)HN-2由海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院分子植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基具體見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基

1.2 方法

1.2.1 菌株HD-1形態(tài)學(xué)觀察

(1)菌落、菌絲觀察。將菌株HD-1接種于PDA平板上,培養(yǎng)3 d后,在菌落邊緣取6 mm菌餅,接種至新的PDA平板中央,28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d,觀察菌落形態(tài),利用生長(zhǎng)速率法計(jì)算平均生長(zhǎng)速率。從菌落邊緣挑取菌絲,放在滴加了適量水的載玻片上,在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲的形態(tài)及特征。

(2)孢子、附著胞觀察。取新鮮的菌落邊緣菌餅,于100 mL的PDB培養(yǎng)基中,180 r/min,28 ℃振蕩培養(yǎng)5 d后,將密封的錐形瓶放于光照下靜置3 d,期間對(duì)菌液進(jìn)行鏡檢,觀察孢子是否生成,待有大量孢子生成后,過(guò)濾菌絲,6 000 r/min離心5 min,棄上清液,計(jì)算孢子濃度,調(diào)整濃度為106mL-1。使用光學(xué)顯微鏡觀察孢子的形態(tài)特征并測(cè)量孢子大小,進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)。吸取30 μL的孢子懸浮液(106mL-1)滴加在無(wú)菌的單凹載玻片上,置于鋪有潮濕的無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中,28 ℃保濕培養(yǎng),每隔0.5 h取出載玻片蓋上蓋玻片后在顯微鏡下觀察附著胞的形狀并記錄。

1.2.2 菌株HD-1分子生物學(xué)鑒定

(1)菌株HD-1的基因組DNA提取。將菌株HD-1接種至PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)5 d,刮取菌絲,使用植物基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]進(jìn)行基因組DNA的提取。

(2)序列擴(kuò)增。使用菌株HD-1的基因組DNA為模板,引物ITS1和ITS4(表2)對(duì)基因ITS進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 ITS引物

PCR(25 μL)體系:2×TaqPCR MasterMix Ⅱ[天根生化科技(北京)有限公司)]12.5 μL;HD-1 DNA 1 μL;引物ITS1/4 1 μL;ddH2O 9.5 μL。

PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃復(fù)性30 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)為30次;72 ℃再延伸10 min。

(3)測(cè)序及分析。取5 μL PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),確定條帶正確后將PCR產(chǎn)物送華大基因科技股份有限公司測(cè)序;將測(cè)序所得序列以及GenBank上下載的各菌株序列用MEGA 7.0軟件進(jìn)行處理,序列對(duì)準(zhǔn)后切齊,然后用最大似然估計(jì)法(Maximum likelihood)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),以自舉法(bootstrap method)進(jìn)行檢測(cè),共循環(huán)500次。

1.2.3 菌株HD-1生物學(xué)特性

(1)不同培養(yǎng)基對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。將6 mm菌餅接種于上述含有不同瓊脂培養(yǎng)基的平板中央,每個(gè)處理重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

(2)不同pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。用1 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)PDA培養(yǎng)基的pH值至4、5、6、7、8、9、10共7組處理,將6 mm菌餅接種于上述含有不同pH的PDA的平板中央,每個(gè)處理重復(fù)3次,28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

(3)不同碳源、氮源對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響。用果糖、葡萄糖、山梨醇、半乳糖、麥芽糖和甘露醇對(duì)察氏瓊脂培養(yǎng)基中的蔗糖進(jìn)行等碳量替換,用硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、牛肉浸膏、蛋白胨、脯氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸對(duì)察氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉進(jìn)行等氮量替換,制成含有不同碳源、氮源的培養(yǎng)基平板,將6 mm菌餅接種于上述平板中央,每個(gè)處理重復(fù)3次,28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

(4)致病性測(cè)定。取淡綠期的橡膠樹(shù)葉片,使用75%乙醇進(jìn)行葉片表面消毒。使用滅菌牙簽將葉片刺出大小約為3 mm×3 mm的傷口,取6 mm新鮮的菌餅接種于傷口上,使用等大的PDA培養(yǎng)基瓊脂塊作為對(duì)照,于28 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng),定期觀察。

1.2.4 室內(nèi)毒力測(cè)定

(1)藥劑。25%咪鮮胺水乳劑,山東禾益生物科技有限公司;10%苯醚甲環(huán)唑水乳劑,陜西湯普森生物科技有限公司;40%錳鋅·三唑酮可濕性粉劑,四川國(guó)光農(nóng)化股份有限公司;75%三環(huán)唑可濕性粉劑,上海滬聯(lián)生物藥業(yè)(夏邑)股份有限公司;HN-2正丁醇提取物由本實(shí)驗(yàn)室提取。將各藥劑配制成不同濃度的母液,并使用0.22 μm的細(xì)菌過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。

(2)室內(nèi)毒力測(cè)定。使用生長(zhǎng)速率法,測(cè)定5種藥劑對(duì)菌株HD-1的室內(nèi)毒力。在PDA培養(yǎng)基中加入不同體積的藥劑母液,充分混勻,制成含有不同藥劑的平板。每種藥劑設(shè)置5個(gè)不同的含量,取6 mm的菌餅接種于各個(gè)平板中央,28 ℃培養(yǎng)5 d,使用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。按照公式計(jì)算抑菌率。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel計(jì)算方差與平均值,通過(guò)SPSS 21計(jì)算不同藥劑的EC50值,采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05),使用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行科研繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

菌株HD-1在PDA上28 ℃培養(yǎng)5 d后菌落直徑為(74.44±1.66) mm。菌落在1～4 d內(nèi)呈白色,5 d后中央由白色變?yōu)榛抑梁谏玔圖1(a)],背面產(chǎn)生黑色沉淀[圖1(b)];菌落邊緣整齊,呈圓形,顏色較淺,白色至淺灰色;菌落正面著生氣生菌絲,淺灰色。菌絲茂密,直徑為(4.98±0.75) μm[圖1(c)]。分生孢子無(wú)色、無(wú)彎曲、光滑、橢圓形、基部鈍圓或稍尖,大小約(0.93±0.10) μm×(0.38±0.06) μm[圖1(d)]。附著胞圓至橢圓形,邊緣光滑、規(guī)則,偶爾有不規(guī)則狀[圖1(e)]。

(a)菌落正面(5 d);(b)菌落反面(5 d);(c)菌絲;(d)分生孢子;(e)附著胞。

2.2 菌株HD-1致病性檢測(cè)

結(jié)果顯示,刺傷4 d后發(fā)病,發(fā)病部位呈現(xiàn)黑色輪紋狀,邊緣有黃色暈圈產(chǎn)生,與田間癥狀一致,見(jiàn)圖2。對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行分離仍能得到所接種的菌株,通過(guò)柯赫氏法則確定該菌株為橡膠炭疽病的病原菌。

2.3 菌株HD-1分子生物學(xué)鑒定

通過(guò)測(cè)序得到菌株HD-1的ITS基因的部分片段大小為573 bp。將測(cè)序所得序列在NCBI-nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì),使用MEGA 7.0對(duì)HD-1-ITS及下載的各菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建。如圖3所示,該菌株與膠孢炭疽菌復(fù)合菌群中的C.fructicola聚為一個(gè)分支,綜上結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察,將菌株HD-1鑒定為果生刺盤孢菌C.fructicola。

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 菌株HD-1生物學(xué)特性

2.4.1 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

在測(cè)定的10種培養(yǎng)基中(圖4),最適HD-1生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是PDA,在第5天時(shí)菌落平均直徑為(74.44±1.66) mm,平均生長(zhǎng)速率為14.89 mm/d;在LB上菌落直徑為(73.94±1.04) mm,平均生長(zhǎng)速率為14.79 mm/d,但菌絲生長(zhǎng)稀疏;在MBM、CD、NYG和YEPD上菌落直徑分別為(71.57±1.45)、(69.14±0.75)、(61.56±2.80)和(59.38±4.31) mm,平均生長(zhǎng)速率分別為14.31、13.83、13.31和11.88 mm/d;HD-1在CM、SDA和SDAY上生長(zhǎng)相對(duì)較差,菌落直徑分別為(57.71±1.49)、(52.45±0.77)和(50.73±3.45) mm,生長(zhǎng)速率分別為11.54、10.49和10.15 mm/d;HD-1在PSA上生長(zhǎng)最不好,菌落平均直徑為(43.73±0.64) mm,平均生長(zhǎng)速率8.75 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。

2.4.2 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響

菌株HD-1在pH 4.0～10.0的范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)(圖5),pH值在7.0～10.0時(shí),菌落大小相近,且菌絲生長(zhǎng)都較為密集,最適pH值為8.0,其菌落直徑為(70.37±1.44) mm,平均生長(zhǎng)速率為14.07 mm/d,這一結(jié)果說(shuō)明該菌株對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。

2.4.3 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖6,菌落生長(zhǎng)5 d后,在山梨醇和甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上菌落直徑顯著大于其他碳源,分別為(59.41±1.19) mm和(58.53±1.69) mm,平均生長(zhǎng)速率分別為11.88和11.71 mm/d;在含有麥芽糖、果糖和蔗糖培養(yǎng)基上分別為(49.39±1.32)、(48.77±2.77)和(48.53±1.22) mm,平均生長(zhǎng)速率分別為9.88、9.75、9.71 mm/d,無(wú)顯著差異;HD-1對(duì)葡萄糖的利用相對(duì)較差,菌落直徑為(46.64±1.69) mm,平均生長(zhǎng)速率為9.33 mm/d;以半乳糖為碳源的菌落直徑僅(28.66±1.12) mm,平均生長(zhǎng)速率為5.73 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。

2.4.4 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響

如圖7,菌落生長(zhǎng)5 d后,在以牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑為(68.60±0.53) mm,平均生長(zhǎng)速率達(dá)到13.72 mm/d,明顯高于其他氮源;以硝酸鉀、脯氨酸和甘氨酸作為氮源則生長(zhǎng)較差,分別為(52.58±2.25)、(51.64±1.38)和(52.68±1.92) mm,平均生長(zhǎng)速率為10.52、10.33和10.54 mm/d;以胰蛋白胨作為氮源的菌落生長(zhǎng)較差,為(48.38±1.01) mm,平均生長(zhǎng)速率為9.68 mm/d;以硫酸銨、氯化銨和谷氨酰胺為氮源不利于HD-1生長(zhǎng),菌落直徑分別為(41.79±2.25)、(42.95±2.36)、(41.67±2.66) mm,平均生長(zhǎng)速率分別為8.36、8.59、8.33 mm/d。

數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,不同小寫(xiě)字母表示經(jīng)Duncan檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)。

2.4.5 室內(nèi)毒力測(cè)定

5種不同藥劑對(duì)菌株HD-1毒力測(cè)定結(jié)果(表3)顯示,咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、三環(huán)唑、錳鋅·三唑酮和HN-2正丁醇提取物的EC50值分別為0.12、19.31、102.50、415.76和56.77 μg/mL。如圖8所示,在含有HN-2正丁醇提取物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株HD-1,菌落背面出現(xiàn)了明顯的黑化現(xiàn)象,同時(shí)對(duì)菌絲進(jìn)行顯微觀察,可以明顯觀察到菌絲膨大成球狀,而在含有三環(huán)唑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株HD-1,菌落背面呈現(xiàn)深紅色。

圖8 不同藥劑處理的菌落圖片及菌絲觀察

表3 藥劑對(duì)菌株HD-1的室內(nèi)毒力

3 討論

由橡膠炭疽菌引起的橡膠樹(shù)炭疽病是一種常見(jiàn)的病害,會(huì)影響橡膠樹(shù)的產(chǎn)膠量,嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹(shù)死亡,造成經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定和形態(tài)學(xué)觀察,初步鑒定菌株HD-1為果生刺盤孢菌C.fructicola。林春花等[22]對(duì)在云南、海南、廣東和廣西等4處墾區(qū)的橡膠樹(shù)病葉上分離得到的病原菌進(jìn)行鑒定,有22株膠孢炭疽菌和15株尖孢炭疽菌;有研究表明,果生刺盤孢菌不僅可以侵染橡膠樹(shù),還可以在多個(gè)寄主植物上分離得到,例如油茶、臭椿、楓香和草莓等[23]。

使用生長(zhǎng)速率法,測(cè)定不同培養(yǎng)基、pH、碳源和氮源對(duì)該菌生長(zhǎng)的影響。在測(cè)定的培養(yǎng)基中,該菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況最好;在測(cè)定的pH范圍內(nèi),最適生長(zhǎng)的pH值為8;在測(cè)定的碳源、氮源中,菌株HD-1對(duì)山梨醇和牛肉浸膏的利用最好。不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響與菌種有關(guān),姚英等[24]認(rèn)為馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基最有利于膠孢炭疽菌CB-2的生長(zhǎng),而在PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑顯著降低。雷嬌嬌等[25]的實(shí)驗(yàn)中,菌落的直徑大小由SNA培養(yǎng)基、OA培養(yǎng)基到PDA培養(yǎng)基依次遞減;這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同之處可能是由菌株差異、生理差異、培養(yǎng)基中其他成分的含量不同所造成的。在pH方面,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果與陳貴華[26]的研究結(jié)果相符,他認(rèn)為酸堿度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響不大,pH值在4～10的范圍內(nèi)菌絲均能較好生長(zhǎng)。不同菌株對(duì)pH的適應(yīng)能力也有所不同:舒娟[27]對(duì)果生刺盤孢菌HN47-2和GZ15-1的研究發(fā)現(xiàn),這兩種菌株生長(zhǎng)最適pH值為5;對(duì)油茶上分離出的代表性果生刺盤孢菌DHYC14研究發(fā)現(xiàn),該菌株喜弱酸性環(huán)境,生長(zhǎng)最適pH值為5～7[28]。在碳源和氮源方面,對(duì)閩楠上分離的膠孢炭疽菌的研究發(fā)現(xiàn),分別以麥芽糖和酵母浸膏為碳源和氮源時(shí)菌落直徑最大[24];李戌清等[29]研究的三葉青株系則在以山梨醇為碳源,牛肉浸膏為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好,而氯化銨對(duì)菌絲生長(zhǎng)有一定的抑制作用。

同一藥劑對(duì)同一復(fù)合種內(nèi)的不同菌株也有不同的毒力,于秀敏等[30]使用6種不同的殺菌劑對(duì)一株膠孢炭疽菌進(jìn)行了毒力測(cè)定,結(jié)果顯示25%咪鮮胺的抑菌效果最好,其EC50僅有0.117 5 μg/mL。有研究表明[31]在9種殺菌劑對(duì)柱花草炭疽病的毒力測(cè)定中,咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抑菌效果最好,其EC50在0.032 3～0.735 2 μg/mL,三唑酮的抑菌效果最差,EC50為285.219 8 μg/mL。在周子騫等[32]對(duì)膠孢炭疽菌的毒力測(cè)定實(shí)驗(yàn)中,苯醚甲環(huán)唑的EC50為0.84 μg/mL,代森錳鋅的毒力則較差,EC50為4 830.14 μg/mL,這可能是由于菌株產(chǎn)生了抗藥性,而本實(shí)驗(yàn)中由代森錳鋅和三唑酮復(fù)配的藥劑錳鋅·三唑酮的EC50卻達(dá)到415.76 μg/mL,這可能與菌株的寄主、分離部位不同有關(guān)。咪鮮胺作為咪唑類殺菌劑,通過(guò)抑制麥角甾醇生物合成起到抑菌效果,對(duì)病原菌的抑制作用最強(qiáng),EC50為0.12 μg/mL;苯醚甲環(huán)唑、HN-2正丁醇提取物、三環(huán)唑和錳鋅·三唑酮的抑菌效果依次下降,錳鋅·三唑酮的EC50達(dá)到415.76 μg/mL;生物防治由于其自身的優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用于植物病害的防治中,高宇等[33]對(duì)B.malacitensisZ-5菌株的抑菌物質(zhì)進(jìn)行鑒定,其主要成分為脂肽抗生素C14Surfactin B,C14～C17Iturin A,C14、C15、C17Iturin B等;竺利紅等[21]針對(duì)貝萊斯芽孢桿菌SM905對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)其5倍稀釋的發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌的抑制活性達(dá)到了97.89%,且經(jīng)過(guò)處理的氣生菌絲會(huì)表現(xiàn)為畸形、空洞、色素積累,且萌發(fā)后的菌絲稀疏、膨大,這些研究都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。趙雅等[34]對(duì)貝萊斯芽孢桿菌HN-Q-8的發(fā)酵液活性成分分析后,鑒定其活性物質(zhì)成分為豐源素(Fengycin)和表面活性素(Surfactin)。通過(guò)MALDI-TOF-MS對(duì)HN-2正丁醇提取物進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可能有伊枯草菌素A(C14、C15、C18Iturin A)、伊枯草菌素B(C13-14Iturin B)、桿菌霉素F(C14、C17Bacillomycin F)、桿菌霉素D(C14-15Bacillomycin D)、抗霉枯草菌素(C15Mycosubtilin)、表面活性素A(C13-14Surfactin A)、表面活性素B(C13-15Surfactin B)、表面活性素C(C13-14Surfactin C)和豐源素A(C14-16Fengycin A),這表明B.velezensisHN-2不僅可以產(chǎn)生表面活性素和伊枯草菌素,還可以產(chǎn)生桿菌抗霉素(Bacillomycin)和抗霉枯草菌素(Mycosubtilin),HN-2的抑菌粗提物在低濃度下就可以起到較好的抑菌效果,EC50僅為56.77 μg/mL。

值得注意的是,在含有HN-2正丁醇提取物的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的HD-1的菌絲,通過(guò)顯微觀察可以發(fā)現(xiàn)其菌絲明顯膨大,這與以往研究所證明的貝萊斯芽孢桿菌通過(guò)使病原菌菌絲畸形起到抑菌作用相符合,并且在本實(shí)驗(yàn)中所使用的三環(huán)唑?qū)儆诩?xì)胞黑色素生物合成抑制劑,所以經(jīng)過(guò)三環(huán)唑處理后的該菌菌落反面并非呈現(xiàn)灰色而是深紅色,然而通過(guò)平板實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)生防菌HN-2處理后的菌落呈深黑色。

4 結(jié)論與展望

研究對(duì)菌株HD-1進(jìn)行了鑒定,確定了其種類,研究了其生物學(xué)特性,并測(cè)定了5種藥劑對(duì)其的室內(nèi)毒力,為防治橡膠樹(shù)炭疽病提供一定的理論數(shù)據(jù)支持。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在含有HN-2正丁醇提取物的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的HD-1菌株出現(xiàn)了黑色素過(guò)量積累的現(xiàn)象,我們推測(cè)HN-2正丁醇提取物可能對(duì)菌株HD-1是一種可以誘導(dǎo)黑色素合成的逆境物質(zhì),并且可能會(huì)通過(guò)影響菌體中的某個(gè)通路或者某個(gè)基因來(lái)影響黑色素的合成,并且發(fā)生在菌絲上的膨大現(xiàn)象也可能與貝萊斯芽孢桿菌抑菌機(jī)理相關(guān),我們將對(duì)這其中的作用機(jī)理進(jìn)行探究。生防菌HN-2對(duì)菌株HD-1有良好的活性,說(shuō)明該菌株可以作為一種生防菌劑,具有良好的開(kāi)發(fā)利用前景。