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    電針調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路激活帕金森大鼠腦組織自噬改善行為學(xué)反應(yīng)機(jī)制

    2023-12-21 09:36:12王飛李亞楠張小蕾胡夢(mèng)妮李含章馬駿
    中國臨床解剖學(xué)雜志 2023年6期
    關(guān)鍵詞:西羅莫司帕金森

    王飛,李亞楠,張小蕾,胡夢(mèng)妮,李含章,馬駿*

    1.武漢市第一醫(yī)院中醫(yī)部,武漢 430022; 2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430022

    帕金森病是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,多發(fā)于老年人,近年來該疾病趨于年輕化,成為影響中老年人健康的主要疾病之一[1]。深部腦刺激(deep brain stimulation,DBS)手術(shù)可以改善晚期帕金森患者的運(yùn)動(dòng)癥狀和生活質(zhì)量[2]。然而,該手術(shù)僅用于藥物不能充分控制癥狀的患者,大多數(shù)患者術(shù)后仍需服藥。因此,亟需開發(fā)特異性的治療手段、輔助藥物。已知多條通路參與調(diào)控該疾病,磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋 白 激 酶 B(protein kinase B,AKT)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信號(hào)通路的激活參與調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的多個(gè)生理活動(dòng),如抑制細(xì)胞死亡、緩解細(xì)胞自噬等[3]。該通路可加速神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化,過度激活則會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳遞異常,造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,引發(fā)阿爾茲海默癥[4]。通過調(diào)控該通路,抑制通路蛋白表達(dá)和激活,可顯著促進(jìn)細(xì)胞自噬反應(yīng),提升酪氨酸羥化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)含量,降解多余α-突觸核蛋白(αsynuclein,α-syn),從而保護(hù)神經(jīng)元,緩解帕金森病[5]。針灸作為傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)的重要治療手段,可延緩神經(jīng)遞質(zhì)傳遞,緩解神經(jīng)疼痛,廣泛應(yīng)用于神經(jīng)疼痛治療,對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的治療效果,越來越成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[6,7]。針灸對(duì)于帕金森病具有良好療效,但作用機(jī)理有待明確[8]。本研究構(gòu)建帕金森大鼠模型,探究電針治療通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路影響帕金森大鼠腦組織的自噬和行為學(xué)反應(yīng)作用機(jī)制,為帕金森病的臨床治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1 主要試劑與儀器 魚藤酮(貨號(hào)ST80190120)購于詩丹德(上海)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司,西羅莫司(批準(zhǔn)文號(hào)H20130698)購于輝瑞愛爾蘭藥品公司,線粒體提取試劑盒(貨號(hào)MP-007)購于英文特生物技術(shù)有限公司,檸檬酸抗原修復(fù)液(貨號(hào)SJH0712)購于如吉生物(上海)科技有限公司,H2O2(貨號(hào)H112520)購于aladdin 公司,兔抗鼠GAPDH 抗體(貨號(hào)ab9485)、兔抗鼠TH 抗體(貨號(hào)ab137869)、兔抗鼠α-syn 抗體(貨號(hào)ab212184)、兔抗鼠PI3K 抗體(貨號(hào)ab133595)、兔抗鼠AKT 抗體(貨號(hào)ab38449)、兔抗鼠mTOR 抗體(貨 號(hào)ab134903)、兔 抗 鼠p-PI3K 抗 體(貨 號(hào)ab207484)、兔抗鼠p-mTOR 抗體(貨號(hào)ab109268)、兔抗鼠微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)B-II/LC3B-I 抗體(貨號(hào)ab63817)、兔抗鼠Beclin1 抗體(貨號(hào)ab207612)購于Abcam 公司,兔抗鼠p-AKT 抗體(貨號(hào)9271T)購于CST 公司,電針治療儀(6805-A,武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司),線粒體呼吸檢測(cè)儀(Oxytherm,漢莎科學(xué)儀器有限公司),熒光定量PCR 儀(7500,ABI 公司),凝膠成像系統(tǒng)(CA-268,上海精密儀器儀表有限公司)。

    1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及建模 由華中科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心購得清潔級(jí)SD 大鼠60 只,6 周齡,體質(zhì)量(200±25)g,SCXK(鄂)2021-0009。麻醉所有大鼠,配置魚藤酮溶液(2 g/L,葵花油溶解)[9],隨機(jī)選取48 只于頸背部皮下注射魚藤酮溶液1 mL,余12 只作為對(duì)照組注射等劑量葵花油,每日1 次,連續(xù)注射4 周。末次注射12 h 后,觀察大鼠行動(dòng)能力,行動(dòng)偏向一側(cè)、身體持續(xù)震顫、動(dòng)作遲緩且活動(dòng)能力較弱判定為構(gòu)模成功。將帕金森大鼠模型分為帕金森組、電針組、西羅莫司組、電針+PI3K 激活組,每組12 只。電針組、電針+PI3K 激活組大鼠選取穴位“太沖”、“風(fēng)府”進(jìn)行電針治療,選用0.5 寸毫針,針灸深約5 mm,接通正負(fù)極,電流強(qiáng)度1 mA,持續(xù)通電15 min,1 次/日;西羅莫司組大鼠腹腔注射西羅莫司1 mg/kg;電針+PI3K 激活組腹腔注射PI3K 激活劑Recilisib 5 mg/kg;對(duì)照組、帕金森組、電針組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水。持續(xù)處理14 d。

    1.2 研究方法

    1.2.1 動(dòng)物行為學(xué)評(píng)定 各組大鼠末次治療12 h 后通過斜板實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)定。斜板實(shí)驗(yàn):準(zhǔn)備一塊平整的木板,木板上放置橡膠墊(厚約0.5 cm),依次將大鼠置于橡膠墊中心位置,確保大鼠不抓撓依附木板邊緣,將木板傾斜角緩慢提升至30°,隨后逐漸增大傾斜角,如果大鼠能在木板上停留5 s以上,則再次提升角度,直至大鼠停留時(shí)間短于5 s,記錄此刻的斜板角度,每只大鼠連續(xù)重復(fù)3 次,取平均值作為斜板停留最大角度。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):利用特制的曠場(chǎng)分析箱進(jìn)行試驗(yàn),箱底部區(qū)域?yàn)闄M五排豎五排的方格,每個(gè)方格大小25 cm×25 cm。將大鼠放置于箱底中央格子中,記錄3 min 內(nèi)大鼠跨越格子數(shù)(3 爪以上跨入即算)和站立次數(shù)(前肢離地1 cm 以上)[10]。

    1.2.2 腦組織線粒體活性檢測(cè) 各組隨機(jī)選取6 只大鼠,麻醉后迅速處死,剖開腦部,分離腦組織,勻漿器打磨至勻漿狀態(tài),按照線粒體提取試劑盒說明書提取線粒體,線粒體呼吸檢測(cè)儀檢測(cè)state3、state4 呼吸速率,計(jì)算線粒體呼吸控制比(mitochondrial respiration controlling rate,RCR),RCR=state3 呼吸速率/state4 呼吸速率×100%。采用熒光素酶標(biāo)記法檢測(cè)ATP 合成酶活性,配置反應(yīng)體系,ADP 激活反應(yīng),記錄發(fā)光強(qiáng)度,確定ATP 合成量。

    1.2.3 免疫組化檢測(cè)腦黑質(zhì)TH、α-syn 蛋白表達(dá) 各組剩余6 只大鼠麻醉后迅速處死,剝離腦組織分離黑質(zhì)區(qū),部分切下經(jīng)液氮處理后研磨至粉凍存?zhèn)溆?,部分置?%多聚甲醛中固定。固定24 h 后,常規(guī)脫水包埋制作石蠟切片,脫蠟至水,檸檬酸抗原修復(fù)液加熱處理修復(fù)組織抗原,滴加H2O2室溫孵育5 min,PBS清洗3 次,山羊血清封閉液封閉10 min,滴加一抗(TH抗體、α-syn 抗體,1:200),4 ℃孵育過夜,PBS 清洗3次,滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗,室溫孵育15 min,PBS 清洗3 次,滴加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液,室溫孵育15 min,PBS 清洗3 次,滴加DAB 溶液,完全顯色后清水洗凈,蘇木素染色復(fù)染,PBS 清洗直至返藍(lán),酒精梯度脫水后封片置于顯微鏡下觀察。

    1.2.4 Western blot 檢 測(cè) 自 噬 及PI3K/AKT/mTOR 通 路相關(guān)蛋白表達(dá)及磷酸化 取出1.2.3 中凍存的腦組織粉末,滴加蛋白裂解液后充分混合,使蛋白充分裂解提取總蛋白,按照試劑盒說明書檢測(cè)提取蛋白質(zhì)量,取定量與上樣緩沖溶液混合加熱變性,加入凝膠孔道中,進(jìn)行電泳跑膠,轉(zhuǎn)膜后脫脂牛奶封閉2 h,加入一抗(GAPDH 抗體、PI3K 抗體、p-PI3K 抗體、AKT 抗體、p-AKT 抗體、mTOR 抗體、p-mTOR 抗體、LC3B 抗體、Beclin1 抗體,1:1000),4 ℃孵育過夜。TBST 清洗3次,加入羊抗兔二抗(1:800),室溫孵育45 min,TBST清洗3 次,將發(fā)光試劑A 液和B 液混合均勻,倒于膜上,靜置1 min 后吸干多余水分,利用光密度掃描系統(tǒng)(Syngene)分析條帶灰度。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 電針治療對(duì)帕金森大鼠行為學(xué)反應(yīng)影響

    斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)統(tǒng)計(jì),與對(duì)照組相比,帕金森組大鼠顯著降低(P<0.05);與帕金森組相比,電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高(P<0.05);與電針組相比,電針+PI3K 激活組大鼠顯著降低(P<0.05);西羅莫司組與電針組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見圖1。

    圖1 各組大鼠斜板停留最大角度(A)、跨格次數(shù)(B)、站立次數(shù)(C)統(tǒng)計(jì)圖* P<0.05,與對(duì)照組相比 #P<0.05,與帕金森組相比 ※P<0.05,與電針組相比n=12Fig.1 Comparison of maximum angle of sloping plate stay (A), times of crossing lattice (B), and times of standing (C) of rats in each group Compared with control group, *P<0.05; Compared with Parkinson group, #P<0.05; Compared with electropuncture group, ※P<0.05 n=12

    2.2 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織病理學(xué)影響

    大鼠腦組織RCR、ATP 合成酶活性、黑質(zhì)內(nèi)TH 平均光密度檢測(cè),與對(duì)照組相比,帕金森組大鼠顯著降低,α-syn 平均光密度顯著升高(P<0.05);與帕金森組相比,電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高,α-syn 平均光密度顯著降低(P<0.05);與電針組相比,電針+PI3K激活組大鼠顯著降低,α-syn 平均光密度顯著升高(P<0.05);西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異(P>0.05),見圖2~3。

    圖2 各組大鼠腦組織RCR、ATP 合成酶活性統(tǒng)計(jì)圖* P<0.05,與對(duì)照組相比 #P<0.05,與帕金森組相比 ※P<0.05,與電針組相比n=6Fig.2 Comparison of RCR and ATP synthase activity in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P<0.05; Compared with Parkinson group, #P<0.05; Compared with electropuncture group, ※P<0.05 n=6

    圖3 各組大鼠黑質(zhì)TH、α-syn 表達(dá)A:TH 免疫組化染色結(jié)果B:TH 平均光密度統(tǒng)計(jì)圖C:α-syn 免疫組化染色結(jié)果D:α-syn 平均光密度統(tǒng)計(jì)圖*P<0.05,與對(duì)照組相比 #P<0.05,與帕金森組相比 ※P<0.05,與電針組相比n=6Fig.3 Expression of TH and α-syn in substantia nigra of rats in each group A: Results of TH immunohistochemical staining; B: Statistical diagram of TH average optical density value; C: Results of α-syn immunohistochemical staining; D: Statistical diagram of average optical density values of α-syn Compared with control group, *P<0.05; Compared with Parkinson group, #P<0.05; Compared with electropuncture group, ※P<0.05 n=6

    2.3 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織自噬反應(yīng)影響

    大鼠腦組織Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I檢測(cè),與對(duì)照組相比,帕金森組大鼠顯著升高(P<0.05);與帕金森組相比,電針組、西羅莫司組大鼠顯著升高(P<0.05);與電針組相比,電針+PI3K 激活組大鼠顯著降低(P<0.05);西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異(P>0.05),見圖4。

    圖4 各組大鼠腦組織LC3B-I、LC3B-II、Beclin1 蛋白表達(dá)量*P<0.05,與對(duì)照組相比 #P<0.05,與帕金森組相比 ※P<0.05,與電針組相比n=6Fig.4 Protein expressions of LC3B-I, LC3B-II and Beclin1 in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P<0.05; Compared with Parkinson group, #P<0.05; Compared with electropuncture group, ※P<0.05 n=6

    2.4 電針治療對(duì)帕金森大鼠腦組織PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白磷酸化影響

    大鼠腦組織p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值檢測(cè),與對(duì)照組相比,帕金森組大鼠顯著升高(P<0.05);與帕金森組相比,電針組、西羅莫司組大鼠顯著降低(P<0.05);與電針組相比,電針+PI3K 激活組大鼠顯著升高(P<0.05);西羅莫司組與電針組大鼠相比無顯著差異(P>0.05),見圖5。

    圖5 各組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表達(dá)量*P<0.05,與對(duì)照組相比 #P<0.05,與帕金森組相比 ※P<0.05,與電針組相比n=6Fig.5 Protein expressions of PI3K,AKT, mTOR, p-PI3K, p-AKT and p-mTOR in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P<0.05; Compared with Parkinson group, #P<0.05; Compared with electropuncture group, ※P<0.05 n=6

    3 討論

    帕金森病的發(fā)作受遺傳和多種環(huán)境因素影響,患者腦組織內(nèi)線粒體代謝異常,細(xì)胞自噬不足,導(dǎo)致αsyn 大量積累,破壞神經(jīng)功能,使患者產(chǎn)生強(qiáng)烈的震顫,造成肌強(qiáng)直,嚴(yán)重者肢體扭曲,生活不能自理[11]。了解帕金森病的發(fā)展機(jī)制、尋找有效的治療措施至關(guān)重要。檢測(cè)行為學(xué)功能是評(píng)估該病的重要指標(biāo)。本研究應(yīng)用斜板實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大鼠模型構(gòu)建成功,帕金森大鼠產(chǎn)生行為學(xué)障礙,斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著降低,具有帕金森病的典型癥狀[12]。

    電針治療為常見中醫(yī)藥治療手段,在緩解疼痛方面具有良好的療效,專家推測(cè)其對(duì)于帕金森病具有一定的治療效果[13]。研究發(fā)現(xiàn),電針治療可緩解帕金森大鼠的神經(jīng)功能障礙,改善大鼠的認(rèn)知功能[14]。藥物配合電針治療被臨床驗(yàn)證具有良好的效果[15]。但電針治療的作用機(jī)理有待進(jìn)一步明確。本研究選用對(duì)于帕金森具有良好緩解效果的西羅莫司作為陽性對(duì)照[16],結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針治療和西羅莫司處理后,大鼠的斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著升高,表明電針治療后帕金森大鼠的行為學(xué)功能得到改善,但作用途徑有待明確。

    帕金森是由腦組織線粒體活性異常,引發(fā)ATP 合成受阻,自噬活性降低,TH 含量減低,造成α-syn 蛋白沉積,導(dǎo)致神經(jīng)元受損[17]。通過該途徑相關(guān)指標(biāo)發(fā)現(xiàn),帕金森大鼠腦組織內(nèi)RCR、ATP 合成酶活性、TH含量顯著降低,α-syn、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著升高,與既往研究一致。電針治療和西羅莫司處理后,RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著升高,α-syn蛋白表達(dá)量顯著降低,表明電針治療可顯著改善腦組織線粒體活性,激活自噬,提高TH 表達(dá),加速降解αsyn,從而緩解帕金森,但作用機(jī)理有待進(jìn)一步明確。

    PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路激活可加速細(xì)胞因子生長(zhǎng),抑制自噬,是常見的自噬調(diào)控通路。川芎嗪可通過抑制該通路相關(guān)蛋白激活,從而加速自噬,緩解糖尿病大鼠的腎損傷[18]。PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路在帕金森病中同樣發(fā)揮作用。姜黃素可通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路,激活自噬的同時(shí)改善帕金森病[19]。研究發(fā)現(xiàn),電針治療可抑制PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路相關(guān)蛋白激活,緩解骨骼肌萎縮大鼠的神經(jīng)損傷[20],推測(cè)電針治療影響帕金森大鼠病情與調(diào)控PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),帕金森組大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著升高,電針治療和西羅莫司處理后,大鼠腦組織PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著降低,證實(shí)電針治療很可能通過調(diào)控PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化影響帕金森病情。為進(jìn)一步驗(yàn)證,本實(shí)驗(yàn)在電針治療的同時(shí)激活PI3K,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度顯著升高,同時(shí)大鼠腦組織內(nèi)RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表達(dá)量、LC3B-II/LC3B-I 顯著降低,α-syn 蛋白表達(dá)量顯著升高,斜板停留最大角度、跨格次數(shù)、站立次數(shù)顯著降低,進(jìn)一步驗(yàn)證相關(guān)假設(shè)。

    綜上所述,電針治療可通過抑制PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化,增強(qiáng)線粒體活性,增加TH 含量,激活腦組織自噬,緩解α-syn 蛋白沉積,從而改善帕金森大鼠運(yùn)動(dòng)行為功能。但電針治療是否通過其他通路間接參與調(diào)控帕金森病,還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以明確。

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