SiewertⅡ型食管胃結(jié)合部腺癌中TRIB3表達(dá)及預(yù)后分析

朱小娟 時(shí)振國(guó) 亢崇照 侯 鵬 葛東峰 趙芳宗 李丹丹 高社干

食管胃結(jié)合部腺癌(adenocarcinoma ofesophagogastric junction, AEG)是指腫瘤中心處于食管胃結(jié)合部上下5cm范圍內(nèi)的腺癌,是一類(lèi)比較特殊的疾病[1, 2]。AEG最常用的分型為Siewert分型,分別為3種類(lèi)型:(1)Siewert Ⅰ型:腫瘤的中心位于食管胃結(jié)合部以上1～5cm距離,即食管下段腺癌。(2)Siewert Ⅱ型:腫瘤的中心位于食管胃結(jié)合部上1cm到下2cm的距離,即賁門(mén)癌。(3)Siewert Ⅲ型:腫瘤中心位于食管胃結(jié)合部下2～5cm的距離,即賁門(mén)下癌或胃底癌。其中,Siewert Ⅱ型在我國(guó)最常見(jiàn),在全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因中排名第4位,且大多數(shù)患者就診時(shí)已是局部晚期或出現(xiàn)全身性轉(zhuǎn)移,預(yù)后相對(duì)較差[3～6]。因此,早期診斷對(duì)于提高Siewert Ⅱ型AEG患者預(yù)后顯得尤為重要。

假激酶Tribbles同源物3(tribbles homology 3, TRIB3)作為一個(gè)新的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)誘導(dǎo)基因,參與細(xì)胞代謝、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞存活、增殖和分化等多種生物過(guò)程的調(diào)節(jié)[7]。TRIB3可通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄因子-4-同源蛋白(activating transcription factor 4-C/EBP homologous protein, ATF4-CHOP)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻斷ATF4-CHOP途徑可降低TRIB3的表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn),TRIB3的表達(dá)與管腔型乳腺癌患者的無(wú)病生存率增加和對(duì)治療的更好反應(yīng)相關(guān)[9]。因此,TRIB3很有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn),而TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的研究尚未見(jiàn)大量報(bào)道。本研究通過(guò)Western blot法及免疫組化法檢測(cè)TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG與對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況,并分析其與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后之間的關(guān)系,為Siewert Ⅱ型AEG的診斷、治療及預(yù)后判斷提供一定的理論基礎(chǔ)。

對(duì)象與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象:收集2010年1月～2013年12月于河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院R0切除的Siewert Ⅱ型AEG術(shù)后的石蠟標(biāo)本55例,其中男性44例,女性11例;患者年齡42～80歲,中位年齡63歲;參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer, AJCC)第8版的TNM分期標(biāo)準(zhǔn):Ⅰ期5例,Ⅱ期11例,Ⅲ期39例;分化程度:高分化12例,中分化31例,低分化12例;組織學(xué)類(lèi)型:潰瘍型35例,蕈傘型2例,隆起型7例,浸潤(rùn)型11例;其中無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移13例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例。另隨機(jī)選取12例保存于-80℃冰箱的AEG癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織用于Western blot法檢測(cè)。納入標(biāo)準(zhǔn):①患者術(shù)前均行頭顱、頸胸腹盆CT或MRI掃描、全身骨掃描等檢查;②術(shù)前未行放、化療及其他針對(duì)腫瘤的治療;③均經(jīng)術(shù)后病理確診;④臨床病理資料及隨訪數(shù)據(jù)完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及合并較嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者;②臨床數(shù)據(jù)不完整。本研究經(jīng)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào):2022-03-B125),該研究已征得患者或授權(quán)親屬知情同意。

2.主要試劑:兔抗人TRIB3多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;SP試劑盒、枸櫞酸修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色劑均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司;二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所,十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)所用溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

3.實(shí)驗(yàn)方法:免疫組化采用SP法,具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照,磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。免疫組化的結(jié)果由兩名病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片判定,每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野,TRIB3在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)為棕黃色顆粒,主要定位于細(xì)胞質(zhì),偶見(jiàn)細(xì)胞核染色。按著色強(qiáng)度分為不著色、淡黃色、棕黃色及棕褐色,并分別記分為0、1、2、3分;觀察陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比,≤5%為0分,6%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,76%～100%為4分。2項(xiàng)相乘所得分即為陽(yáng)性等級(jí):0～1分為陰性(-),2～4分為弱陽(yáng)性(+),5～8分為陽(yáng)性(++),9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)[10]。Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá):取保存于-80℃冰箱的Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織提取蛋白,按BCA試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。蛋白定量、變性后,在上樣孔內(nèi)加入目的蛋白樣品和預(yù)染分子marker,電泳、轉(zhuǎn)膜,用5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉,加入兔抗人TRIB3多克隆抗體(1∶1000稀釋) 4℃孵育過(guò)夜,快速封閉緩沖液(Rapid Blocking Buffer (instant powder, TBST)洗膜;加二抗室溫孵育2h,用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè),膠片顯影。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參照,應(yīng)用Image J灰度分析軟件對(duì)目的蛋白TRIB3和內(nèi)參的條帶進(jìn)行灰度分析、比較。重復(fù)測(cè)量3次,取平均值。

4.隨訪:通過(guò)門(mén)診復(fù)診和電話隨訪,隨訪時(shí)間截至2022年3月31日,患者總體生存期定義為從術(shù)后第1天開(kāi)始到最后一次隨訪或任何原因造成的死亡。

結(jié) 果

1.Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中TRIB3的表達(dá):在免疫組化中,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中的表達(dá)主要定位在細(xì)胞質(zhì),偶見(jiàn)細(xì)胞核染色(圖1);其中,AEG中TRIB3表達(dá)的陽(yáng)性率為27.3%(15/55),其中強(qiáng)陽(yáng)性(+++)6例(10.9%),陽(yáng)性(++)5例(9.1%),弱陽(yáng)性(+)4例(7.3%),陰性(-)40例(72.7%),顯著低于癌旁組織的89.1%(49/55),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=43.193,P<0.01),詳見(jiàn)圖1和圖2。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織(P<0.01),詳見(jiàn)圖3和圖4。

圖1 TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG及癌旁組織中的表達(dá)(SP法,×400)A.TRIB3在AEG癌組織中陰性;B.TRIB3在AEG癌組織中弱陽(yáng)性;C.TRIB3在AEG癌組織中陽(yáng)性;D.TRIB3在AEG癌組織中強(qiáng)陽(yáng)性;E.TRIB3在AEG癌旁組織中陰性;F.TRIB3在AEG癌旁組織中弱陽(yáng)性;G.TRIB3在AEG癌旁組織中陽(yáng)性;H.TRIB3在AEG癌旁組織中強(qiáng)陽(yáng)性

圖2 TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

圖4 Western blot法檢測(cè)Siewert Ⅱ型AEG癌組織及癌旁組織中TRIB3的表達(dá)水平

2.Siewert Ⅱ型AEG患者臨床病理特征與TRIB3表達(dá)的關(guān)系:TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG組織中的表達(dá)與AEG的分化程度、臨床TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)(P<0.05),而與患者的年齡、性別及病理形態(tài)無(wú)關(guān)(P>0.05),詳見(jiàn)表1。

表1 Siewert Ⅱ型AEG癌組織中TRIB3的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

3.TRIB3表達(dá)與Siewert Ⅱ型AEG患者生存的關(guān)系:所有患者均完成隨訪,55例患者的中位隨訪時(shí)間為116(107,134)個(gè)月。Kaplan-Meier分析顯示,TRIB3表達(dá)陽(yáng)性患者的5、10年總生存率分別為86.7%和71.5%;TRIB3陰性患者的5、10年總生存率分別為62.5%、28.6%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.177,P=0.007),詳見(jiàn)圖5。

圖5 TRIB3蛋白陰性和陽(yáng)性SiewertⅡ型AEG患者生存曲線

4.Siewert Ⅱ型AEG患者TRIB3表達(dá)的預(yù)后分析:單因素(HR=0.290, 95%CI: 0.110～0.761,P=0.012)和多因素(HR=0.263, 95%CI: 0.091～0.758,P=0.013)COX回歸分析結(jié)果顯示,TRIB3的表達(dá)可作為SiewertⅡ型AEG患者預(yù)后判斷的重要指標(biāo),是影響AEG患者總體生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,詳見(jiàn)表2。

表2 Siewert Ⅱ型AEG患者總體生存率的單因素和多因素COX回歸分析

討 論

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),腫瘤微環(huán)境內(nèi)也存在ERS,TRIB3作為一種應(yīng)激傳感器,可對(duì)各種腫瘤微環(huán)境或生態(tài)位豐富的應(yīng)激源做出反應(yīng),包括氨基酸或葡萄糖缺乏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白質(zhì)積累和氧化損傷等[11～13]。研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因TRIB3在ERS期間表達(dá)增加,其在神經(jīng)元凋亡中起重要作用[14];同樣,在帕金森病(Parkinson′s disease, PD)中,TRIB3過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)神經(jīng)元死亡[15]。而Wu等[16]研究表明,下調(diào)TRIB3可以促進(jìn)細(xì)胞死亡,TRIB3在細(xì)胞凋亡中起著抗凋亡的作用。因此,TRIB3失調(diào)與預(yù)后的好壞有關(guān),當(dāng)TRIB3與許多關(guān)鍵信號(hào)成分相互作用并調(diào)節(jié)其活性時(shí),它可以以上下游依賴(lài)的方式作為腫瘤抑制基因或癌基因[17]。

目前,關(guān)于TRIB3在癌癥中的確切作用存在爭(zhēng)議。Lin等[18]研究證明,辣椒素通過(guò)上調(diào)癌細(xì)胞中TRIB3的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞死亡。TRIB3的腫瘤抑制作用與ERS和Akt信號(hào)通路有關(guān),TRIB3引起的磷酸化Akt減少,導(dǎo)致線粒體外膜Bax表達(dá)增強(qiáng),從而進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。而不同觀點(diǎn)的研究則表明,TRIB3在食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)組織和細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá),在ESCC組織活檢中,TRIB3高表達(dá)的患者生存率更差[20]。Yu等[21]研究證明,TRIB3的高表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及與乳腺癌患者的不良預(yù)后呈正相關(guān)。因此,TRIB3在腫瘤進(jìn)展中可能為分化相關(guān)基因,在癌癥進(jìn)展中的作用存在著特異性。

為更好地了解TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的作用,本研究分別通過(guò)Western blot法和免疫組化法檢測(cè)TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的表達(dá),一致的結(jié)果顯示,TRIB3在Siewert Ⅱ型AEG中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,這提示食管胃結(jié)合部黏膜在早期受到致癌因素的影響后,可能存在強(qiáng)烈的ERS,AEG中的TRIB3的表達(dá)缺失,可能促進(jìn)了食管胃結(jié)合部黏膜的癌變及其腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。由此可見(jiàn),TRIB3可能在Siewert Ⅱ型AEG的形成階段發(fā)揮著重要的保護(hù)性作用。

此外,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的隨訪,本研究分析了TRIB3與SiewertⅡ型AEG患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TRIB3的表達(dá)與腫瘤患者的TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性,而與患者的病理形態(tài)、性別及年齡無(wú)關(guān)。生存分析發(fā)現(xiàn),TRIB3陽(yáng)性表達(dá)的患者總體生存期明顯優(yōu)于陰性的患者。單因素COX回歸分析結(jié)果顯示,患者的TNM、分化程度等因素與其預(yù)后無(wú)關(guān),分析其原因可能由于本研究納入的患者均為R0切除,從而導(dǎo)致由腫瘤分期、分化程度造成的個(gè)體化預(yù)后差異顯著下降。多因素COX回歸分析結(jié)果顯示,TRIB3可作為SiewertⅡ型AEG患者的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。因此,TRIB3表達(dá)陽(yáng)性的患者有更低的死亡風(fēng)險(xiǎn),而對(duì)于TRIB3表達(dá)缺失的患者需加強(qiáng)隨訪,以便及早發(fā)現(xiàn)腫瘤的進(jìn)展,及時(shí)采取更加有效的治療,對(duì)改善SiewertⅡ型AEG患者的預(yù)后有重要意義。然而,本研究也有相應(yīng)的局限性,主要是樣本量相對(duì)較小,下一步筆者團(tuán)隊(duì)將增加樣本量,深入研究TRIB3在AEG中的作用機(jī)制,進(jìn)一步明確TRIB3對(duì)Siewert Ⅱ型AEG的診斷和預(yù)后價(jià)值。

綜上所述,TRIB3有望成為Siewert Ⅱ型AEG的潛在靶點(diǎn)及預(yù)后判斷的重要生物學(xué)標(biāo)志物。因此,深入研究TRIB3在AEG中的表達(dá)及機(jī)制,旨在為AEG提供新的治療方法。