一種地西泮殘留量的測定方法

■ 文｜中山市小欖鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務(wù)中心 王承德 羅淑賢 羅敏意 陳偉堅(jiān) 焦卉慧 賴思楚

地西泮（diazepam）又名安定，主要用于抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗癲癇和抗驚厥。在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，添加地西泮可提高水產(chǎn)品的生長速度；在運(yùn)輸過程中，添加地西泮可降低應(yīng)激反應(yīng)，提高存活率。然而，地西泮具有神經(jīng)毒性，可致嗜睡、頭昏、乏力，不正當(dāng)使用地西泮可產(chǎn)生藥物殘留，人類食用地西泮殘留的動物性產(chǎn)品，可產(chǎn)生地西泮的耐藥性。為此，我國已明令禁止地西泮用于動物飼養(yǎng)及產(chǎn)品生產(chǎn)過程，在動物性食品中不得檢出地西泮及其鹽和酯。

目前，地西泮的測定方法有液相色譜法（LC法）、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS法）、高效液相色譜-質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS法）、超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS法）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA法）等。HPLC-MS/MS法和UPLC-MS/MS法因靈敏度好、準(zhǔn)確率高，已成為地西泮殘留量測定的主要方法。

本文通過優(yōu)化提取和凈化等樣品前處理步驟，篩選出合適的液相條件和質(zhì)譜條件，建立了地西泮殘留量測定的HPLC-MS/MS方法。該方法適用于日常大批量水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測，也為其他類藥物殘留測定方法的建立提供參考。

一、材料與方法

1.材料與試劑

50mL螺旋蓋聚丙烯離心管；均質(zhì)子；10mL玻璃離心管；250mL具塞錐形瓶；0.22μm尼龍針式過濾器。

1 0 0 m g/L 地西泮、1 0 0 m g/L地西泮 -D 5 標(biāo)準(zhǔn)溶液，甲酸、乙腈、 乙酸銨均為色譜純，QuEChERSdSPEEMR-Lipid凈化管，其余試劑均為分析純。

2.儀器與設(shè)備

QQQ6430液相色譜 -串聯(lián)質(zhì)譜儀，AL204/01電子天平，T18basic 勻 漿 機(jī)，Q T-2 旋 渦 混合器，JIDI-16R臺式高速冷凍離心機(jī)，D C-2 4 氮吹儀，MILLIQIQ7000超純水機(jī)。

3.實(shí)驗(yàn)方法

（1）樣品提取

準(zhǔn)確稱取5g（±0.01g）均質(zhì)水產(chǎn)品，置于 5 0 m L 塑料離心管中，向其中加入 2 顆均質(zhì)子后加入100μL500ng/mL地西泮-D5內(nèi)標(biāo)工作液，再加入2mLNa2EDTAMcllvaine緩沖液，渦旋震蕩1min后加入10mL1.5%甲酸乙腈，馬上搖勻，防止蛋白質(zhì)結(jié)塊，震蕩提取20min，4℃10000r/min離心5min，待凈化。

（2）樣品凈化

用3.5mL5mmol/L的乙酸銨溶液活化QuEChERS凈化管，將提取液一次性轉(zhuǎn)移入其中，震蕩20min，4℃10000r/min離心5min。上清液加入4g無水硫酸鈉和1g氯化鈉，震蕩20min，4℃10000r/min離心5min，吸取乙腈層2mL至10mL玻璃試管內(nèi)，35℃氮吹至干后加入10%乙腈水定容至1mL，過0.22μm濾膜，供HPLC-MS/MS測定。

（3）樣品測定

①液相色譜條件

色譜柱：C18柱，2.1mm×150mm，3.5-Micron；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水；流速：0.4mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；梯度洗脫程序（見表1）。

表1 液相色譜梯度洗脫梯度程序

②質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧 ESI，正離子模式；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM；電噴霧電壓：4000V；霧化氣壓力：40psi；輔助氣流速：9 L/min；離子源溫度：3 5 0 ℃；其他質(zhì)譜參數(shù)（見表2），特征離子質(zhì)量色譜圖（見圖1）。

圖1 地西泮和地西泮-D5特征離子質(zhì)量色譜圖

表2 地西泮和地西泮-D5 的質(zhì)譜參數(shù)

二、結(jié)果與討論

1.提取溶液的選擇

比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液等4種提取溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明：甲醇極性較強(qiáng)，提取產(chǎn)物雜質(zhì)多；乙腈和乙酸乙酯的提取產(chǎn)物雜峰干擾少，但提取效率較低；Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液的提取產(chǎn)物雜峰干擾少，且提取效率較高。因此，本試驗(yàn)選用Na2EDTAMcllvaine緩沖液作為提取溶液。

2.凈化試劑的選擇

魚肉基質(zhì)成分復(fù)雜，富含蛋白質(zhì)、脂肪等生物大分子，因此，凈化試劑的選擇尤為重要，直接關(guān)系到試驗(yàn)結(jié)果的好壞。本試驗(yàn)比較了中性氧化鋁小柱、HLB 固相萃取小柱、C18固相萃取小柱、QuEChERS凈化管等4種凈化試劑。試驗(yàn)結(jié)果表明：QuEChERS凈化管較其他3種凈化試劑的凈化效果好，產(chǎn)物的雜質(zhì)干擾少。因此，本試驗(yàn)最終確定了QuEChERS凈化管作為凈化試劑。

3.線性關(guān)系、檢出限和定量限

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中地西泮和地西泮-D5峰面積的比值為縱坐標(biāo)，以對應(yīng)的質(zhì)量濃度比為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。地西泮在0.05～1.0μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。線性回歸方程為y=1.303428x-0.022498，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

地西泮特征離子峰響應(yīng)值＞3倍信噪比（S/N）時的添加濃度為方法檢出限，特征離子峰響應(yīng)值＞10倍信噪比（S/N）時的添加濃度為方法定量限。結(jié)果表明，本方法檢出限為0.05μg/kg、定量限為0.16μg/kg。

4.回收率和精密度

稱取 2.0g不含地西泮的水產(chǎn)品于 5 0 m L 塑料離心管中，添加低、中、高3個水平（2.0、5.0、10.0ng）的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個添加水平重復(fù)6次。結(jié)果表明，平均加標(biāo)回收率在96.4%～99.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.742%～2.90%，方法具有良好的回收率和精密度（見表3），符合獸藥殘留檢測要求。

表3 地西泮的平均加標(biāo)回收率及精密度/%

5.實(shí)際樣品測定

采用本文建立的HPLC-MS/MS方法測定50份市售水產(chǎn)品，均未檢出地西泮。

制備加標(biāo)水產(chǎn)樣品進(jìn)行測定，樣品中地西泮能被有效分離，基本無雜峰干擾，回收率高，說明本方法運(yùn)用到實(shí)際樣品測定中能得到較好的實(shí)驗(yàn)效果。

三、結(jié)論

本文建立了水產(chǎn)品中地西泮殘留量的HPLC-MS/MS測定方法。該方法操作簡便、回收率高、準(zhǔn)確靈敏，適用于水產(chǎn)品地西泮殘留量的測定，可作為水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管的檢測方法進(jìn)行推廣應(yīng)用。