鴨源呼腸孤病毒Sigma A蛋白的原核表達及免疫活性檢測

朱英奇，陳宗艷，李傳峰，孟春春，王桂軍，劉光清*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

2011年上半年，中國太湖流域的許多養(yǎng)鴨場陸續(xù)發(fā)生一種新的鴨病毒性傳染病，臨床主要表現(xiàn)為發(fā)病雛鴨軟腳，排白色稀糞，生長發(fā)育遲緩，發(fā)病率約為20%～60%，病死率在80%以上，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了較為嚴重的經(jīng)濟損失[1]。經(jīng)鑒定造成該次疫情的病原是一種不同于番鴨呼腸孤病毒（Muscovy duck reovirus,MDRV）的新型呼腸孤病毒（Duck reovirus，DRV）[2]。

與禽源呼腸孤病毒（Avian reovirus，ARV）相似，該病毒基因組由分節(jié)段的10個基因片段組成。其核酸SDS-PAGE電泳圖式與ARV相似，與MDRV差異較大；但中片段、小片段遷移率與ARV和MDRV均有較大差異[3]。病毒編碼10個蛋白，包括構成衣殼結構的8個結構蛋白和2個非結構蛋白。其中，Sigma A蛋白由S2基因編碼，含有417個氨基酸殘基，分子量為46.2 ku，是夠成內(nèi)衣殼的主要成分[4]。Sigma A蛋白具有結合dsRNA的功能[5]，Martnez-Costas等認為其通過阻斷宿主細胞內(nèi)病毒dsRNA依賴性蛋白激酶（PKR）的激活，從而阻斷干擾素的抗病毒效應[6]。目前對呼腸孤病毒S節(jié)段編碼蛋白的研究主要集中于Sigma B和Sigma C蛋白，Sigma A蛋白的功能有待進一步研究。

本研究對DRV的Sigma A基因進行了克隆和分析，并將其進行原核表達，為進一步研究Sigma A蛋白功能等奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 病毒株、菌株、載體及實驗動物 大腸桿菌DH5α、原核表達載體pET-32a（+）由本實驗室保存；大腸桿菌BL21（DE3）購自天根生化科技（北京）有限公司；4月齡雌性新西蘭白兔購自上海斯萊克實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑 TRIzol RNA提取試劑購自Invitrogen公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、ExTaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）有限公司；His-Tagged Protein Purification Kit購自北京康為世紀生物科技有限公司；HRP標記的羊抗兔IgG（HRP-IgG）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗DRV全病毒血清由本實驗室制備保存；弗氏佐劑購自Sigma公司。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)DRV S2基因序列（GQ664689）設計一對擴增Sigma A完整ORF的特異性引物，SigmaA-F：5'-ACTACGAATTCATGGCGCG TGCCGTGTAC-3'（EcoRⅠ）；SigmaA-R：5'-CCGAC TCGAGTTAGACGGTAAAGTG-3'（XhoⅠ）。預期擴增片段為1 251 bp，引物由上海杰李生物技術有限公司合成。

1.4 目的基因的擴增與克隆 參考文獻[7]的方法提取DRV TH-11株病毒基因組，RT-PCR擴增SigmaA ORF片段，PCR擴增條件為：94℃5 min；94℃45 s、58℃45 s、72℃1m in 30 s，30個循環(huán)；72℃10 Min。產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后克隆至原核表達載體pET-32a（+）中，構建的重組表達質(zhì)粒pET-SigmaA由上海杰李生物技術有限公司測序。

1.5 重組蛋白的誘導表達 將pET-SigmaA轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）中，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG進行誘導表達，并分別在誘導前及誘導后第2 h、4 h、6 h取出1m L菌液進行SDS-PAGE，以確定最佳誘導時間。超聲破碎誘導6 h后的菌體細胞，進行SDS-PAGE分析Sigma A蛋白的表達。

1.6 重組蛋白的純化及反應原性檢測 采用鎳離子親和純化柱進行純化。以純化的Sigma A重組蛋白為抗原，兔抗DRV TH11全病毒血清為一抗，以羊抗兔HRP-IgG為二抗進行western blot分析，檢測Sigma A蛋白的反應原性。

1.7 多克隆抗體的制備及其效價測定 將純化蛋白免疫新西蘭白兔，初次免疫后每間隔兩周進行1次免疫，共3次。第4次免疫一周后采血，用全病毒作為包被抗原建立的間接ELISA方法測抗體效價。

1.8 多克隆抗體間接免疫熒光（IFA）檢測 將DRV接種于鴨胚成纖維細胞（DEF），培養(yǎng)2 d，加入4%多聚甲醛固定細胞，以制備的多克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG為二抗，同時設未接種病毒的細胞為陰性對照，進行IFA鑒定。

2 結果與討論

2.1 Sigm a A基因的克隆 用引物SigmaA-F和SigmaA-R擴增出DRV TH11株的Sigma A基因，其大小約為1 200 bp（圖1），與預期結果相符。將純化的PCR產(chǎn)物用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后，克隆于pET-32a（+）中，獲得pET-SigmaA。該重組質(zhì)粒經(jīng)酶切與測序鑒定，表明獲得DRV Sigma A基因。

2.2 Sigma A蛋白表達與純化 將pET-SigmaA轉(zhuǎn)化至BL21（DE3），用IPTG進行誘導，經(jīng)優(yōu)化，確定IPTG的最佳誘導濃度為0.5 mmol/L。用IPTG誘導6 h后，進行SDS-PAGE電泳。結果顯示，重組Sigma A蛋白獲得了表達，分子量大小約為66 ku（圖2）。而且在菌體上清和包涵體中均有蛋白表達。用 6×His-Tagged Protein Purification Kit純化重組蛋白，采用western blot進行鑒定，表明重組Sigma A蛋白可以與兔抗DRV陽性血清呈特異性反應（圖2），證明純化后的重組Sigma A蛋白具有良好反應原性。

圖1 DRV Sigma A基因的RT-PCR擴增結果Fig.1 Amplification result of DRV Sigma A gene by RT-PCR

圖2 SDS-PAGE（A）和western blot（B）鑒定、分析重組蛋白Fig.2 Identification of the recombinant protein bySDS-PAGE（A）and western blot（B）

2.3 多克隆抗體制備及其效價檢測 以純化的重組Sigma A蛋白免疫新西蘭白兔，初次免疫后每間隔兩周進行1次加強免疫，共3次。第四次免疫一周后采血，用間接ELISA測抗體效價，其效價在1∶20 000 以上。

2.4 多克隆抗體的IFA檢測 DRV感染DEF細胞后，采用IFA檢測到多克隆抗體與細胞中病毒Sigma A蛋白特異性結合，產(chǎn)生綠色熒光；而陰性對照組的細胞無熒光信號（圖3）。

ARV Sigma A蛋白是主要內(nèi)衣殼蛋白，具有阻斷干擾素抗病毒的功能，在ARV的病毒粒子結構的穩(wěn)定和致病機理上具有重要作用[8]。本研究采用RT-PCR技術擴增出了DRV-TH11株完整的Sigma A編碼基因，將其插入原核表達載體pET-32a（+）中，在大腸桿菌種獲得了高效表達，通過對誘導條件進行優(yōu)化，表達的融合蛋白主要存在于上清中。重組蛋白經(jīng)6×His-Tagged Protein Purification Kit純化后經(jīng)western blot檢測表明重組蛋白具有良好的抗原性。以純化的蛋白作為免疫原，制備了高效價、特異性結合的多克隆抗體。為今后進一步研究Sigma A蛋白功能以及檢測方法等奠定了基礎。

圖3 多克隆抗體的IFA鑒定結果Fig.3 Detection of anti-SigmaA serum in DRV infected DEF cell by IFA

[1]Chen Zong-yan,Zhu Ying-qi,Li Chuang-feng,et al.Outbreak-associated Novel Duck reovirus,China,2011[J].Emerg Infect Dis,2012,18（7）:1209-1211.

[2]陳宗艷，朱英奇，王世傳，等.一株鴨源呼腸孤病毒（TH11株）的分離與鑒定[J].中國動物傳染病學報，2012，20（1）：10-15.

[3]陳少鶯，陳仕龍，林鋒強，等.新型鴨呼腸孤病毒的分離與鑒定[J].病毒學報，2012，28（3）：224-230.

[4]Martnez-Costas J,Grande A,Varela R,et al.Protein architecture of avian reovirus S1133 and identification of the cell attachment protein[J].JVirol,1997,71（1）:59-64.

[5]Yin H S,Shien JH,Lee L H.Synthesis inEscherichia coliof avian reovirus core proteinσA and its dsRNA-binding activity[J].Virology,2000,266（1）:33-41.

[6]Martnez-Costas J,Gonzalez-Lopez C,Vakharia V N,et al.Possible involement of the double-stranded RNA-binding core proteinσA in the resistance of avian reovirus to interferon[J].J Virol,2000,74（3）:1124-1131.

[7]劉光清，倪征，張玉穎，等.兔病毒性出血癥病毒JX/97株衣殼蛋白基因的序列測定與分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術學報，2006，14（2）：191-196.

[8]Xu W,Patrick MK,Hazelton P R,et al.Avian reovirus temperature-sensitive mutant tsA12 has a lesion in major core proteinσA and is defective in assembly[J].JVirol,2004,78（20）:11142-11151.