單精子SNP單體型在1例Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病患者胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)中的應(yīng)用＊

周永紅 謝雨莉 付志紅 韓嬋琳 焦淑靜 李雪梅 鄧天勤,*

1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院生殖醫(yī)學(xué)中心 (廣東 深圳 518028)

2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院新生兒疾病篩查中心 (廣東 深圳 518028)

3.蘇州億康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司 (江蘇 蘇州 215021)

Ⅱ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 2，NF2)是由于22q12染色體上的NF2基因(OMIM ：607379)的突變導(dǎo)致的一種常染色體顯性遺傳疾病，其發(fā)病率為1/25000[1]，約半數(shù)的新發(fā)病例是源于家族性遺傳[2]。該病特征性臨床表現(xiàn)為雙側(cè)聽神經(jīng)瘤，見于90%的患者，臨床表現(xiàn)主要為耳鳴、聽力下降等癥狀及多種神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[3-4]。對(duì)有NF2的家族病史的夫妻，通過單基因病胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(preimplantation genetic testing for monogenetic disease，PGT-M)來阻斷致病基因的傳遞。為了保證結(jié)果的精確度和可靠性，防止因基因脫扣(allele dropout，ADO)和基因重組等因素造成的漏診或誤診，臨床上普遍采用致病基因變異點(diǎn)直接檢測(cè)和基于二代測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)的遺傳多態(tài)位點(diǎn)構(gòu)建連鎖分析[5]。針對(duì)家系不全或新發(fā)突變患者，利用單精子作為連鎖分析依據(jù)[6]。

在本研究中，利用基因芯片技術(shù)檢測(cè)單精子(s i n g l e nucleotide polymorphism，SNP)，對(duì)一例因NF2基因c.861delC新發(fā)突變引起的NF2男性患者，構(gòu)建以單精子SNP單體型的連鎖分析的檢測(cè)策略，為該夫婦提供精確有效的PGT-M檢測(cè)，研究結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象先證者，男性，31歲，因雙側(cè)聽神經(jīng)纖維瘤術(shù)后，聽力完全喪失。在行全外顯子檢測(cè)，結(jié)果顯示NF2基因c.861delC的雜合變異，該突變是移碼變異，其父母未攜帶突變。參考美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)的遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[7]，此變異為可能致病(PVS1+PM2)。為了防止致病基因的遺傳，患者在我院遺傳咨詢后，決定采用基于單精子SNP單體型的連鎖分析的檢測(cè)策略的PGT-M，本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)：LLYJ2022-056-030)。

1.2 方法

1.2.1 變異位點(diǎn)引物設(shè)計(jì)和體系建立 SNP位點(diǎn)選擇和檢測(cè)體系設(shè)計(jì)；單精子獲取和WGA擴(kuò)增；家系樣本和單精子突變位點(diǎn)檢測(cè)；單精子CNV建庫、NGS和分析家系樣本以及單精子樣本的SNP的擴(kuò)增，文庫的制備；以及ASA基因芯片的檢測(cè)、SNP連鎖分析；胚胎PGT-M的檢測(cè)(包括診斷與篩選)等流程，所有這些步驟均參照鄧天勤[8]的實(shí)驗(yàn)方式進(jìn)行改編。

1.2.2 產(chǎn)前診斷 在孕中期，抽取10毫升的羊水，按照試劑盒操作說明提取gDNA，同步進(jìn)行排除母源性的污染、突變位點(diǎn)檢測(cè)及染色體核型分析，通過Sanger測(cè)序方法檢測(cè)胎兒是否攜帶NF2基因c.861delC的突變情況。

2 結(jié) 果

2.1 單精子的WGA檢測(cè)結(jié)果一共獲取50份標(biāo)記為SHK1-50的單精子且進(jìn)行了WGA擴(kuò)展。電泳結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物主要分布在200到2000bp區(qū)域，其濃度范圍在13-25ng/μl之間，展示出典型的擴(kuò)散狀條帶，這與WGA擴(kuò)增的質(zhì)量控制預(yù)期一致。單精子WGA擴(kuò)增電泳驗(yàn)證的結(jié)果見圖1。然而，42號(hào)泳道的SHK40單精子樣本的WGA擴(kuò)增并未成功，其它的7號(hào)、10號(hào)、17號(hào)、18號(hào)、24號(hào)、35號(hào)、36號(hào)、52號(hào)泳道也可能由于挑取轉(zhuǎn)管等因素造成擴(kuò)增失敗。除此之外，其余41份的精子樣本均成功進(jìn)行了擴(kuò)增。

圖1 部分單精子WGA擴(kuò)增電泳驗(yàn)證圖。圖2 夫婦及單精子突變位點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果。圖3 SHK37、SHK48染色體拷貝數(shù)結(jié)果。圖3A：SHK37。圖3B：SHK48。圖4 隱馬爾科夫家系SNP連鎖圖?！觯耗行?，攜帶突變；女性，不攜帶突變；性別未知，不攜帶突變；性別未知，攜帶突變。圖5 羊水 Sanger 測(cè)序結(jié)果。

2.2 夫婦及單精子的突變位點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果男方攜帶的是胚系突變，而女方為野生型，此外，單精子SHK41和SHK44攜帶NF2基因c.861delC突變；單精子SHK37和SHK48不攜帶NF2基因c.861delC突變。

2.3 單精子的CNV結(jié)果是基于是否為23,X或23,Y染色體，如圖3可見，SHK37染色體的拷貝數(shù)顯示為23,X，而在SHK48染色體的拷貝數(shù)為23,Y。

2.4 夫妻以及單精子SNP分析我們選擇男方雜合和女方純合SNP位點(diǎn)行連鎖分析?？偣灿?0個(gè)可利用的SNP位點(diǎn)，聯(lián)合單精子SHK37、SHK41、SHK44、SHK48的SNP結(jié)果，選擇30個(gè)SNP位點(diǎn)的單體型結(jié)果，對(duì)于構(gòu)建單體型是足夠的。分析精子攜帶突變位點(diǎn)上游2M及下游1M SNP位點(diǎn)，突變型單精子SNP位點(diǎn)共有17個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生ADO，ADO率為8.29%；野生型單精子SNP共有11個(gè)位點(diǎn)產(chǎn)生ADO，ADO率為5.37%，均符合PGT-M指南對(duì)于SNP位點(diǎn)分析要求。圖4揭示了部分在隱馬爾科夫SNP單體型連鎖圖中可應(yīng)用的上游與下游位點(diǎn)。上游的變異位點(diǎn)被標(biāo)示為藍(lán)色的rs序數(shù)，而游層的變異位點(diǎn)被標(biāo)注為黃色的rs序數(shù)。

2.5 胚胎的檢測(cè)(包括診斷和篩選)總共獲得5枚囊胚，檢測(cè)結(jié)果表明4枚胚胎未攜帶父源性突變(ZT01、ZT02、ZT03、ZT04)，其中的3枚胚胎為46, XN胚胎(ZT01、ZT02、ZT04)，其中ZT02號(hào)胚胎出現(xiàn)c.868處檢出C>T雜合突變，可能為新發(fā)突變或單細(xì)胞擴(kuò)增引入的錯(cuò)配。在rs323073SNP的位置產(chǎn)生了ADO，G/A的分析結(jié)果為A/A，ADO的比例在0-2.13%范圍內(nèi)，與PGT-M的解讀標(biāo)準(zhǔn)相符合。通過全面的分析，我們確定ZT01號(hào)和ZT04號(hào)的這兩枚胚胎為可移植。每枚胚胎在1M范圍內(nèi)的平均SNP可用位點(diǎn)數(shù)量超過30個(gè)，而且胚胎的突變檢測(cè)位點(diǎn)和SNP單體型的分析結(jié)果是一致的。

2.6 產(chǎn)前診斷及隨訪2022年2月22日移植ZT01胚胎，并成功妊娠。在孕期18周，在我院母胎醫(yī)學(xué)中心行羊水穿刺，羊水樣本用于提取DNA，行染色體核型和Sanger序列分析以判斷胎兒是否存在染色體異常和攜帶致病基因突變。結(jié)果顯示，胎兒的染色體核型及結(jié)構(gòu)未見異常，且未攜帶NF2基因c.861delC突變(如圖5所示)，成功地阻斷新發(fā)突變的遺傳。女方于2022年11月30孕39周分娩一女嬰，體重3.35Kg，身長50cm，出生時(shí)無異常。

表1 胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

NF2是一種染色體顯性遺傳的疾病，其遺傳子代的概率為50%。NF2基因的突變不同可能會(huì)引發(fā)臨床生物學(xué)行為的不同[9]，而NF2基因的突變也可能會(huì)導(dǎo)致Merlin蛋白異常，從而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤[10]。PGT-M誤診最常見的原因之一是ADO，ADO發(fā)生率為10%～20%[11]，為降低誤診風(fēng)險(xiǎn)常規(guī)需進(jìn)行連鎖分析。因NF2患者50%是新發(fā)突變，這對(duì)PGT-M提出了挑戰(zhàn)，無法進(jìn)行連鎖分析。

PGT-M的常規(guī)檢測(cè)方案是直接致病基因突變位點(diǎn)檢測(cè)和遺傳性的多態(tài)位點(diǎn)(例如短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeat，STR)或SNP)進(jìn)行鏈鎖分析，以避免擴(kuò)增失敗和ADO等因素引發(fā)的誤診。本研究單體型分析沒有使用STR，而采用SNP位點(diǎn)構(gòu)建單體型，是為了避免同源重組導(dǎo)致誤診及STR難于大規(guī)模檢測(cè)。在PGT領(lǐng)域，主要運(yùn)用的技術(shù)是陣列比較基因組雜交芯片(aCGH)和SNP芯片。SNP芯片的優(yōu)勢(shì)在于它能夠檢測(cè)單倍體和多倍體的變異，并為胚胎指紋識(shí)別、親子鑒定和單親二體的檢測(cè)提供必要的數(shù)據(jù)。本研究應(yīng)用ASA基因芯片技術(shù)檢測(cè)精子SNP，以突變型和野生型精子的SNP數(shù)據(jù)構(gòu)建SNP單體型的連鎖分析，對(duì)胚胎進(jìn)行篩選和診斷。分別對(duì)5枚胚胎進(jìn)行了CNV、SNP單體型和突變的檢測(cè)，結(jié)果顯示有2枚可移植胚胎。孕中期行產(chǎn)前診斷明確胎兒染色體核型及結(jié)構(gòu)未見異常，并未攜帶致病基因突變，成功地阻斷NF2疾病相關(guān)的突變基因的傳遞。2001年報(bào)道第一例經(jīng)PGT成功阻斷遺傳性腫瘤綜合癥(Li-Fraumeni綜合征)垂直傳遞[12]；2002年Abou-Sleiman等[13]首次報(bào)道PGT在NF2應(yīng)用，采用突變位點(diǎn)直接檢測(cè)和SNP的連鎖分析，獲4枚可以移植胚胎，ADO率為2.8%，未妊娠。同年Yury等[14]報(bào)道NF2患者通過PGT生育1個(gè)未攜帶NF2致病基因的小孩，其應(yīng)用熒光PCR技術(shù)構(gòu)建單精子SNP單體型的連鎖分析，獲8枚可移植胚胎，但未提供AOD。Spits等[15]對(duì)一例因NF2基因C.1612C>T突變的NF2患者，應(yīng)用單細(xì)胞雙重PCR構(gòu)建單精子STR突變單體型的PGT檢測(cè)策略，AOD率為2.0%，經(jīng)歷5個(gè)臨床周期，胚胎未能著床成功，但患者自然妊娠，最終證實(shí)胎兒未攜帶C.1612C>T突變。國內(nèi)基于NGS平臺(tái)建立針對(duì)家系不全并單基因疾病和染色體異常的采用突變位點(diǎn)檢測(cè)、CNV和單精子SNP單體型連鎖分析的一體化PGT檢測(cè)策略，應(yīng)用于1例NF2基因新發(fā)突變合并染色體平衡易位NF2患者，獲1枚未攜帶致病基因的染色體平衡易位胚胎，但夫婦放棄移植[16]，而本研究采用基因芯片方法，構(gòu)建精子SNP單體型。單精子SNP單體型并不僅限于新發(fā)的單基因疾病的應(yīng)用，如SMN1基因純合缺失的脊髓性肌肉萎縮癥[17]、COL1A1基因雜合突變的成骨不全癥[18]、FGFR3基因新發(fā)變異的軟骨發(fā)育不全[19]以及常染色體顯性遺傳多囊腎[20]等；它還被應(yīng)用于染色體結(jié)構(gòu)異常對(duì)的羅伯遜易位男性患者的治療，從而成功篩選出健康的胚胎[21]。

若無家族史或無先證者，尤其是新發(fā)突變的常染色體顯性遺傳單基因疾病的男性患者，可采用基因芯片技術(shù)構(gòu)建單精子SNP單體型，并結(jié)合CNV和突變位點(diǎn)的檢測(cè)策略篩選胚胎，從而提高了PGT-M的準(zhǔn)確性，阻斷致病基因的垂直傳遞。