結(jié)、直腸癌中錯(cuò)配修復(fù)蛋白MLH1、PMS2、SH2、MSH6的表達(dá)及與其臨床病理特征的關(guān)系分析

李永強(qiáng)

結(jié)直腸癌是我國(guó)常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,在我國(guó)近年來的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌普遍惡性程度較高,特別是中晚期,臨床相當(dāng)一部分患者對(duì)治療的反應(yīng)效果欠佳,遠(yuǎn)期生存率不盡如人意。據(jù)目前研究所知,結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟多階段的進(jìn)展過程,與遺傳因素密切相關(guān)并與一系列的基因調(diào)控緊密關(guān)聯(lián)。在此過程當(dāng)中,錯(cuò)配修復(fù)基因即MMR (mismatch repair,MMR)起到關(guān)鍵作用。錯(cuò)配修復(fù)基因即MMR,是一類腫瘤相關(guān)基因,具有修復(fù)DNA堿基錯(cuò)配,增加DNA復(fù)制忠實(shí)性,維持基因組穩(wěn)定性的功能。有研究資料顯示,約15%的結(jié)直腸癌是經(jīng)由MSI途徑引發(fā)的[1]。目前臨床上通常由免疫組化方法檢測(cè)四個(gè)常見MMR亞基蛋白即:MLH1,PMS2,MSH2,MSH6,其中任一蛋白完全缺失均可判讀為錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷即dMMR。DNA 復(fù)制過程中發(fā)生錯(cuò)配累積,而錯(cuò)配修復(fù)基因 MLH1、PMS2、MSH2、MSH6 可編碼錯(cuò)配修復(fù)蛋白修正這些錯(cuò)誤。相反,如果錯(cuò)配修復(fù)基因MMR的表達(dá)缺失可導(dǎo)致DNA復(fù)制后錯(cuò)配修復(fù)功能的喪失,從而導(dǎo)致細(xì)胞微衛(wèi)星DNA序列不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)的發(fā)生,此MSI與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系,包括超過 90% 的 Lynch 綜合癥和15%的散發(fā)性結(jié)直腸的發(fā)生由此路徑導(dǎo)致[2]。因此,臨床上弄清楚錯(cuò)配修復(fù)基因及其缺失在結(jié)直腸癌中表達(dá)對(duì)于臨床工作有著重要的意義。2016 年《腫瘤病理診斷規(guī)范(結(jié)直腸癌)》 中也指出,有條件的單位建議對(duì)結(jié)直腸癌組織進(jìn)行 MMR 基因檢測(cè),以指導(dǎo)臨床治療和評(píng)價(jià)預(yù)后[3]。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取我院2017年2月至2022年2月五年期間結(jié)直腸癌患者共632例,所有患者均經(jīng)病理檢查確診,每例患者的病理結(jié)果均經(jīng)我院病理科資深醫(yī)師雙人復(fù)診,并且采用免疫組織化學(xué)方法(IHC)對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因的四個(gè)亞基蛋白進(jìn)行檢測(cè)。其中男性374例,女性258例。年齡32～78歲,中位年齡62.7歲。

1.2 方法

所有標(biāo)本經(jīng)過10%中性甲醛固定,蠟塊包埋、切片、烤片后石蠟切片脫蠟、水化,常規(guī)使用乙醇進(jìn)行梯度脫水、透明,封片。應(yīng)用鼠抗人MLH1、PMS2、MSH2、MSH6單克隆抗體進(jìn)行免疫組化測(cè)定,所有單克隆抗體均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

已知MLH1、PMS2、MSH2、MSH6均位于細(xì)胞核,使用PBS液作為陰性對(duì)照,并可將腫瘤周圍正常的上皮組織、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核染色作為內(nèi)對(duì)照。選取有代表性的區(qū)域,光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)高倍視野,對(duì)染色強(qiáng)度進(jìn)行辨識(shí),無色或淡黃色為低表達(dá),判為陰性;棕黃及棕褐色為高表達(dá),判為陽性。四種蛋白亞基MLH1、PMS2、MSH2、MSH6中一種或一種以上陰性即可判定為錯(cuò)配修復(fù)基因缺失,即dMMR(deficient mismatch repair)。若四種亞基蛋白全部陽性即判定為錯(cuò)配修復(fù)基因完整,即pMMR(proficient mismatch repair)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0做數(shù)據(jù)分析,使用Pearson卡方檢驗(yàn)、Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)錯(cuò)配修復(fù)基因亞基蛋白MLH1、PMS2、MSH2、MSH6各組間的相關(guān)性以及各MMR亞基蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌病理以及臨床特征之間的關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)各亞基蛋白表達(dá)情況以及相互之間關(guān)系

MLH1、PMS2、MSH2、MSH6四種錯(cuò)配基因的亞基蛋白均位于腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核,在胞質(zhì)中可呈弱陽性,但不作為陽性判斷。在所有的632例結(jié)、直腸癌患者中錯(cuò)配修復(fù)基因陽性即PMMR者為552例,占87.4%。伴有錯(cuò)配基因亞基蛋白缺失即dMMR者為80例,缺失率為12.6%。其中MLH1陽性者605例,蛋白缺失者共27例,缺失率為4.3%。MSH2蛋白缺失者15例,缺失率為2.4%。PMS2蛋白陽性者576例,缺失者56例,缺失率為8.9%。MSH2蛋白陽性者617例,蛋白缺失者15例,缺失率為2.4%。MSH6蛋白陽性者603例,缺失者29例,缺失率為4.5%。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),MLH1與PMS2共同表達(dá)缺失者27例,缺失率為4.3%,MSH2與MSH6共同表達(dá)缺失者15例,缺失率2.4%。所有患者中未發(fā)現(xiàn)四種亞基蛋白全部缺失者,見表1。

表1 MMR蛋白在結(jié)直腸癌中的表達(dá)狀況(例,%)

進(jìn)一步分析得知MLH1陽性者605例,577例同時(shí)伴有PMS2為陽性。27例MLH1陰性者M(jìn)SH2亦表現(xiàn)出PMS2蛋白陰性,即PMS2蛋白缺失者27例。經(jīng)Spearman統(tǒng)計(jì)分析顯示MLH1缺失與PMS2缺失具有相關(guān)性(γ=0.631,P<0.001),見表2。同理可得MSH2陽性者617例,其中493例同時(shí)伴有MSH6蛋白缺失,即MSH6蛋白陽性者493例。同樣經(jīng)Spearman統(tǒng)計(jì)分析顯示MSH2缺失與MSH6缺失具有相關(guān)性(γ=0.824,P<0.001),見表3。

表2 MLH1表達(dá)缺失與PMS2表達(dá)缺失的相關(guān)性/例

表3 MSH2表達(dá)缺失與MSH6表達(dá)缺失的相關(guān)性/例

2.2 錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)亞基蛋白與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

將所有結(jié)直腸癌分為dMMR和pMMR兩組,兩組患者在發(fā)病年齡、腫瘤部位、腫瘤的細(xì)胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及臨床分期存在差異,差異具有顯著性(P<0.05)。具體表現(xiàn)為dMMR組患者發(fā)病年齡更輕,腫瘤多位于左半結(jié)腸,腫瘤細(xì)胞分化相對(duì)較好,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少見。而在性別、腫瘤大小、癌胚抗原及Ca19-9等腫瘤標(biāo)志物升高與否等方面無明顯差異(P>0.05),見表4。

表4 MMR蛋白表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系/例

3 討論

近十年來人們?cè)谂R床實(shí)踐中逐漸認(rèn)識(shí)到結(jié)、直腸癌根據(jù)錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)各種分子分型與其臨床特點(diǎn)、病理特征、腫瘤生物學(xué)行為以及對(duì)化療藥物的選擇、耐藥情況和預(yù)后都有著密切關(guān)系。

當(dāng)前最常用的篩查結(jié)直腸癌 MMR 表達(dá)有無缺失的方法有三 種:免疫組化、PCR法和二代基因測(cè)序 NGS。其中PCR法耗時(shí)長(zhǎng),操作復(fù)雜,二代基因測(cè)序價(jià)格昂貴,均不利于臨床廣泛開展。而免疫組化法以其準(zhǔn)確率高,檢測(cè)快速,操作方便,價(jià)格相對(duì)低廉廣泛運(yùn)用于臨床。免疫組化法還可對(duì)小腫瘤標(biāo)本檢測(cè),可以鑒別可能受到影響的錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR),故近年來國(guó)內(nèi)外均采用免疫組化法來做為錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)的一線篩查[4]。

正常情況下,MMR蛋白在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá),多數(shù)表達(dá)于黏膜窩下三分之一的細(xì)胞基質(zhì)炎癥細(xì)胞和上皮細(xì)胞中。如果腫瘤細(xì)胞核中完全缺失某個(gè)MMR蛋白表達(dá),我們即可認(rèn)為是該表達(dá)缺失。由此我們可以通過運(yùn)用免疫組化方法檢測(cè)錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)各亞基蛋白MLH1,PMS2,MSH2及MSH6的表達(dá)是否缺失,來分析其與結(jié)、直腸癌的臨床特點(diǎn)、藥物選擇以及腫瘤生物學(xué)行為的關(guān)系,并試圖揭示各亞基蛋白缺失情況與化療藥物的選擇與化療方案制定之間的關(guān)聯(lián)。2016年7月18美國(guó)JCO雜志在線發(fā)表了M.D.Anderson癌癥中心的Y.Nancy You等報(bào)告的一項(xiàng)研究顯示,出現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)缺失的晚期結(jié)、直腸癌患者預(yù)后更好,接受包括個(gè)體化外科治療在內(nèi)的多學(xué)科治療模式后有更好的遠(yuǎn)期無病生存率,從而得出錯(cuò)配修復(fù)因子的缺失是結(jié)、直癌患者的一個(gè)有利因素[5]。又如有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)具有錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷(dMMR)或微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MSI-H)的結(jié)、直腸癌患者,約占Ⅱ/Ⅲ期患者的15%～20%,Ⅳ期患者的約5%,此類患者對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑敏感,是PD-1治療的優(yōu)勢(shì)人群,臨床反應(yīng)率高,治療效果好。特別是對(duì)于微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性(MSI-H)晚期結(jié)、直腸癌(CRC)來說,免疫治療的效果大于傳統(tǒng)的化療+靶向治療。反之,占95%的MMS或pMMR晚期大腸癌對(duì)免疫治療不敏感,單藥運(yùn)用無效,從而得知MSI是晚期結(jié)、直腸癌以及實(shí)體瘤的免疫治療療效預(yù)測(cè)因子[6]。

我們可以據(jù)此認(rèn)為錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)系統(tǒng)是體內(nèi)的一個(gè)安全保護(hù)系統(tǒng),該系統(tǒng)對(duì)維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和完整性有重大作用[7]。而錯(cuò)配修復(fù)基因一旦出現(xiàn)突變后,將會(huì)喪失對(duì)體內(nèi)正常遺傳物質(zhì)的保護(hù)作用,從而導(dǎo)致包括結(jié)、直腸癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生,并且錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)的各亞基蛋白突變也會(huì)遺傳給腫瘤細(xì)胞,即腫瘤細(xì)胞將會(huì)攜帶錯(cuò)配修復(fù)基因突變的特征,即dMMR[8]。這樣就提示我們可以開展對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因的鑒定檢測(cè),區(qū)分其亞種系,判斷患病的風(fēng)險(xiǎn)并預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)效果及預(yù)后[9]。同時(shí)也可以對(duì)檢測(cè)陽性人群的結(jié)、直腸癌以及結(jié)、直腸以外的其它惡性腫瘤進(jìn)行終身監(jiān)測(cè)。該研究結(jié)果可為對(duì)這類患者開展各種新治療手段時(shí)提供一個(gè)療效基線標(biāo)準(zhǔn)的療效評(píng)估參考[10-11]。

結(jié)果顯示在所有632例結(jié)、直腸癌病例中,錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)亞基蛋白缺失率為12.6%。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,在歐洲此值為15%～20%[12]。值得注意的是,在某些族群中,如西班牙裔,有研究發(fā)現(xiàn)錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)的亞基缺失率僅為4.3%,提示在不同的族群中些錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)亞基蛋白的缺失率存在著較大的差別[13]。這樣的結(jié)果在其他國(guó)家類似的研究中也得到證實(shí),其中某些結(jié)、直腸癌高發(fā)的西方國(guó)家可以達(dá)15% ～20%[14],韓國(guó)學(xué)者Kim等對(duì)我國(guó)的近鄰韓國(guó)人的研究結(jié)果顯示MLH1、MSH2及MSH6的缺失率分別為3.7%、2%、5.2%。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MLH1、MSH2、MSH6及PMS2缺失率分別為4.3%、2.4%、4.5%和8.9%,顯示我國(guó)及韓國(guó)等亞洲地區(qū)錯(cuò)配基因亞基蛋白缺失率較為接近且與西方國(guó)家人群相比稍低[15]。這些研究數(shù)據(jù)可以看出各人種間錯(cuò)配修復(fù)基因的缺失突變率存在一定的差異,而這種差異在某種程度上與地緣區(qū)域有一定的相關(guān)。缺失蛋白的種類及比例不同,提示不同人種不同地域發(fā)生突變的基因存在差異?？梢钥闯霾煌瑖?guó)家不同人種dMMR結(jié)直腸癌所占比例不盡相同。在這些差異的基礎(chǔ)上,我們可以將不同的人群根據(jù)錯(cuò)配基因的缺失情況分成各個(gè)不同的亞群,進(jìn)而可以對(duì)不同亞群的患者更有效地進(jìn)行化療藥物的選擇并且進(jìn)行更精準(zhǔn)的治療[16-17]。

綜上所述,對(duì)結(jié)、直腸癌患者進(jìn)行錯(cuò)配修復(fù)基因的檢測(cè),通過各亞基蛋白的缺失情況了解結(jié)、直腸癌的臨床亞型和病理特征,對(duì)篩選結(jié)、直腸癌人群中的各亞群有重要的意義。隨著研究的深入,錯(cuò)配修復(fù)基因?qū)τ谠诓煌娜巳褐械慕Y(jié)、直腸部的診斷以及臨床上對(duì)于化療藥物的選擇均有顯著的應(yīng)用價(jià)值,相信對(duì)遠(yuǎn)期臨床治療效果的估計(jì)和預(yù)后判斷會(huì)具有越來越重要的意義。對(duì)錯(cuò)配修復(fù)基因的進(jìn)一步的研究還將有助于揭示結(jié)、直腸癌的發(fā)病、進(jìn)展機(jī)制以及對(duì)未來治療方向的指導(dǎo)。