孤獨(dú)癥譜系障礙患兒血清甘丙肽、神經(jīng)絲輕鏈水平與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性研究

鄒 丹,劉海蓮,黃美容,楊 帆,杜國平

(1.重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院兒童保健中心,重慶 405400;2.重慶市綦江區(qū)人民醫(yī)院兒科,重慶 401420)

孤獨(dú)癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙,發(fā)病起始于嬰幼兒,臨床特征為社交障礙或受限、刻板行為、言語發(fā)育障礙、興趣狹隘等,嚴(yán)重影響患兒生長發(fā)育和日常生活[1]。世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球約有0.76%的兒童患有ASD,隨著診療技術(shù)的不斷提高,ASD患病率也在不斷增加。美國疾病控制與預(yù)防中心數(shù)據(jù)顯示自2002年至2014年8歲兒童ASD患病率從0.66%增加至1.68%[2],Zhou[3]于2014年至2016年在上海、廣州、長沙和哈爾濱抽樣調(diào)查顯示6～12歲兒童ASD的患病率為0.70%。早期神經(jīng)元損傷是ASD發(fā)病的基礎(chǔ),在ASD小鼠模型中可觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞線粒體損傷、炎癥小體激活及其介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和再生障礙[4]。甘丙肽(galanin,GAL)是中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)劑,Xu等[5]研究發(fā)現(xiàn)給予外源性GAL可激活GAL受體促使神經(jīng)再生。神經(jīng)絲輕鏈(neurofilament light chain,NfL)是軸突細(xì)胞骨架的神經(jīng)元特異性成分,可在軸突損傷或神經(jīng)元細(xì)胞凋亡后進(jìn)入細(xì)胞外空間,被認(rèn)為是一種神經(jīng)退行性生物標(biāo)志物[6]。GAL、NfL是否與ASD有關(guān)尚不清楚,本研究擬檢測ASD患兒血清GAL、NfL水平,分析其與ASD病情的關(guān)系,以期為臨床ASD診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2020年10月至2022年10月重慶市開州區(qū)人民醫(yī)院收治的80例ASD患兒為ASD組。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合美國精神病學(xué)協(xié)會(huì)的精神疾病診斷和統(tǒng)計(jì)手冊(cè)(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,DSM)-5診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];②患兒家屬或法定監(jiān)護(hù)人知情同意簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):①慢性腎臟、內(nèi)分泌、心臟和肝臟疾病;②代謝障礙,如血脂異常、丙酮酸羧化酶缺乏或卟啉癥;③合并兒童期精神分裂癥、躁郁癥、強(qiáng)迫癥或神經(jīng)衰弱;④營養(yǎng)不良、急性感染、遺傳疾病。另選擇同期本院兒科保健門診接診的62例年齡和性別匹配的健康兒童為對(duì)照組,對(duì)照組不存在任何精神障礙/行為及系統(tǒng)性疾病。ASD組男56例,女24例;年齡2～8歲,平均(5.16±1.75)歲;體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)21～25kg/m2,平均(22.35±1.49)kg/m2。對(duì)照組男41例,女21例;年齡2～9歲,平均(5.12±1.68)歲;BMI 20～25kg/m2,平均(22.16±1.29)kg/m2。兩組年齡、性別、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),本研究方案均根據(jù)《赫爾辛基宣言》執(zhí)行,已經(jīng)獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 血清GAL、NfL檢測

研究對(duì)象入組次日晨采集空腹10～12h外周靜脈血5mL注入一次性真空采血管,待血液標(biāo)本凝結(jié)取上層液,以3 000rpm離心10min(離心半徑10cm),-80℃保存。采用VarioskanLUX酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司),酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清GAL水平,GAL試劑盒購自武漢賽培生物科技公司。GAL檢測范圍12.35～1 000pg/mL,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均控制在10%以內(nèi)。采用全自動(dòng)Simoa HD-1蛋白質(zhì)檢測分析儀(美國Quanterix公司),單分子免疫陣列檢測技術(shù)檢測血清NfL水平,NfL試劑盒購自上海舒話生物科技公司。NfL檢測范圍為0～2 000pg/mL。由對(duì)患者臨床資料完全不知情的檢驗(yàn)科醫(yī)師操作,批內(nèi)和批間變異系數(shù)均控制在10%以內(nèi)。

1.3 ASD病情評(píng)估

兒童自閉癥評(píng)估量表(Childhood Autism Rating Scale,CARS)評(píng)估病情嚴(yán)重程度[8],CARS包括人際關(guān)系、模仿、情感反應(yīng)、軀體運(yùn)動(dòng)能力、與非生命物體的關(guān)系、對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)、視覺反應(yīng)、聽覺反應(yīng)、近處感覺反應(yīng)、焦慮反應(yīng)、語言交流、非語言交流、活動(dòng)水平、智力功能、總印象共15個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行評(píng)估,每個(gè)項(xiàng)目采用1～4分4級(jí)評(píng)分法,滿分15～60分。CARS總分<30分為無ASD,30～36分為輕中度ASD,37～60分為重度ASD。根據(jù)CARS評(píng)分將ASD患兒分為輕中度組和重度組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ASD組和對(duì)照組血清GAL、NfL水平比較

53例患兒于3歲前診斷出ASD,27例于3歲后診斷出ASD,21例有ASD家族史。CARS評(píng)分30～53分,平均(36.22±5.91)分。44例(55.00%)為輕中度ASD,36例(45.00%)為重度ASD。ASD組血清GAL、NfL水平均高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為29.926、25.029,P<0.05),見表1。

表1 ASD組和對(duì)照組血清GAL、NfL水平比較

2.2 不同ASD病情患兒血清GAL、NfL水平比較

重度組血清GAL、NfL水平均高于輕中度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為5.053、5.602,P<0.05),見表2。

表2 不同ASD病情患兒血清GAL、NfL水平比較

2.3 血清GAL、NfL水平與CARS評(píng)分的相關(guān)性

ASD患兒血清GAL、NfL水平與CARS參數(shù)人際關(guān)系、情感反應(yīng)、對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)、焦慮反應(yīng)、語言交流、非語言交流、活動(dòng)水平、CARS總分呈正相關(guān)性,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r值介于0.241～0.698之間,P<0.05),見表3。

表3 血清GAL、NfL水平與CARS評(píng)分的相關(guān)系數(shù)

2.4 GAL、NfL診斷ASD的價(jià)值分析

GAL、NfL診斷ASD的曲線下面積分別為0.736、0.796,聯(lián)合GAL和NfL診斷ASD的曲線下面積為0.884,經(jīng)De Long Z檢驗(yàn)顯示聯(lián)合診斷大于單獨(dú)GAL和NfL的診斷效能(Z值分別為3.323、2.402,P<0.05),見表4和圖1。

圖1 GAL、NfL診斷ASD的ROC曲線

3 討論

3.1 探尋ASD生物學(xué)標(biāo)志物的必要性

ASD是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,其中環(huán)境危險(xiǎn)因素包括高齡產(chǎn)婦(≥40歲)、父親年齡較大(≥50歲)、妊娠期間母體代謝異常、肥胖、高血壓、細(xì)菌或病毒感染、自身免疫性疾病家族史、早產(chǎn)、低出生體重、小于胎齡兒或大于胎齡兒等[9]。ASD患兒多伴發(fā)育遲緩或智力障礙、語言和運(yùn)動(dòng)障礙及不同形式的焦慮(包括社交焦慮、廣泛性焦慮、年幼兒童的分離焦慮和恐懼癥),還可引起睡眠障礙、肥胖、癲癇等[9]。ASD確切病因尚不完全清楚,目前認(rèn)為可能與遺傳、環(huán)境和免疫因素等有關(guān),上述因素共同作用下引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷是ASD發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)[10],因此探討神經(jīng)損傷相關(guān)生物學(xué)標(biāo)志物可能對(duì)ASD診斷及病情評(píng)估有益。

3.2 GAL與ASD的關(guān)系分析

GAL是一種神經(jīng)肽,由29個(gè)氨基酸組成,廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓各節(jié)段神經(jīng)細(xì)胞中。GAL受體GAL1主要存在于嗅覺系統(tǒng)、杏仁核、下丘腦、丘腦和腦干,GAL2主要表達(dá)于海馬、三叉神經(jīng)束、齒狀回和迷走神經(jīng)背側(cè)復(fù)合體,GAL3僅在下丘腦中存在。GAL具有調(diào)節(jié)胃腸、泌尿生殖系統(tǒng)平滑肌收縮,抑制胰島素分泌、促使催產(chǎn)素、垂體生長激素釋放等功能,GAL還能抑制脊髓神經(jīng)刺激引起的傷害性反射,增強(qiáng)嗎啡脊髓鎮(zhèn)痛效果。與其他神經(jīng)肽一樣,GAL可與去甲腎上腺素、5-羥色胺、乙酰膽堿等多種神經(jīng)遞質(zhì)共同存在于同一神經(jīng)細(xì)胞內(nèi),并與其相互作用,參與學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié),與癲癇、焦慮癥、重度抑郁癥、阿爾茨海默病等多種神經(jīng)精神疾病有關(guān)[11-12]。既往研究顯示在抑郁、神經(jīng)元損傷和神經(jīng)退行性病變中均可觀察到GAL異常表達(dá)[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)ASD組患兒血清GAL水平顯著高于對(duì)照組,血清GAL水平與ASD患兒CARS評(píng)分呈正相關(guān)性,GAL診斷ASD的曲線下面積達(dá)0.736。Saad等[15]發(fā)現(xiàn)ASD兒童血清GAL濃度顯著增加,且嚴(yán)重ASD患兒GAL水平明顯高于輕癥患兒,提示GAL可能在ASD發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮一定作用,與病情嚴(yán)重程度有關(guān)。但是GAL參與ASD的作用機(jī)制尚不清楚,推測可能為ASD發(fā)病與γ-氨基丁酸紊亂有關(guān),γ-氨基丁酸可使突觸后膜氯離子通道開放,氯離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)降低突觸后膜負(fù)電位,抑制突觸后神經(jīng)元興奮,γ-氨基丁酸異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)元興奮/抑制平衡被破壞,引起神經(jīng)發(fā)育障礙[16]。Bajo等[17]發(fā)現(xiàn)GAL對(duì)γ-氨基丁酸的傳遞具有雙重作用,可降低大多數(shù)中央杏仁核神經(jīng)元中γ-氨基丁酸能抑制性突觸后電位的幅度,并增加其他神經(jīng)元的γ-氨基丁酸能抑制性突觸后電位的幅度,導(dǎo)致壓力和焦慮等異常行為和神經(jīng)發(fā)育障礙。

3.3 NfL與ASD的關(guān)系分析

神經(jīng)絲是高度磷酸化的神經(jīng)元細(xì)胞骨架成分,可維持神經(jīng)元結(jié)構(gòu)并確定軸突口徑,根據(jù)其分子量,由輕鏈(NfL)、中鏈(NfM)和重鏈(NfH)組成。NfL在神經(jīng)元細(xì)胞體中合成和組裝后,通過微管裝置沿軸突雙向運(yùn)輸,形成與軸突平行的連續(xù)重疊陣列,并保持?jǐn)?shù)月至數(shù)年內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài),以抵抗外部壓力,維持軸突直徑,間接調(diào)節(jié)軸突傳導(dǎo)速度[18]。在軸突損傷刺激下,68-kDa的NfL被釋放到細(xì)胞外液并進(jìn)入腦脊液、體液及外周血循環(huán),腦脊液NfL水平增高可反映多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)退行性癡呆、帕金森等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的軸突損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)NfL與ASD也存在密切關(guān)系,ASD組血清NfL水平高于對(duì)照組,NfL與CARS評(píng)分正相關(guān),診斷ASD的曲線下面積為0.796,表明NfL可作為ASD的生物學(xué)標(biāo)志物。Ameis等[20]研究發(fā)現(xiàn)大腦邊緣系統(tǒng)整合負(fù)責(zé)復(fù)雜社會(huì)情緒功能的調(diào)節(jié),大腦邊緣連接發(fā)育受損影響白質(zhì)和髓鞘形成,導(dǎo)致ASD社交障礙。邊緣密度成像檢查顯示ASD患兒白質(zhì)束連接邊緣密度顯著降低,表明白質(zhì)連接不足是ASD的潛在機(jī)制[21]。Bergman等[22]研究發(fā)現(xiàn)NfL是白質(zhì)損傷的敏感和特異性標(biāo)志物,因此推測ASD患者血清NfL升高可能由白質(zhì)連接發(fā)育受損引起,NfL不僅是ASD的癥狀性標(biāo)志物,也可能參與ASD的病理生理過程。ROC分析結(jié)果顯示聯(lián)合GAL和NfL后診斷ASD的曲線下面積較單獨(dú)診斷明顯增大,提示聯(lián)合檢測血清GAL和NfL可為ASD診斷提供更可靠的信息。

綜上,ASD患者血清GAL和NfL水平均增高,高GAL和NfL與ASD病情嚴(yán)重程度有關(guān),聯(lián)合GAL和NfL在ASD診斷中具有較高的價(jià)值。本研究創(chuàng)新性在于驗(yàn)證了GAL、NfL和ASD病情可能存在相關(guān)性,GAL、NfL有望成為ASD的有價(jià)值生物標(biāo)志物,可能為未來開展ASD發(fā)病機(jī)制和臨床治療提供參考和靶點(diǎn)。本研究不足之處在于樣本量偏少,可能導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚,尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本數(shù)量加以證實(shí)。