2022年濟(jì)南市3株輸入性新型冠狀病毒奧密克戎BQ.1全基因組特征分析

白 颯,劉保華,閆榮軍,趙 輝,孫連波,張 濤,韓煥美

2019年12月發(fā)現(xiàn)的新冠肺炎疫情(COVID-19)是由新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)引發(fā)的一種呼吸道傳染疾病,是繼人冠狀病毒229E(HCoV-229E)[1]、HCoV-OC43、急性嚴(yán)重呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)、HCoVNL63[2]、HCoV-HKU1[3-4]和中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERSCoV)[5]后第7種能感染人類的冠狀病毒。因其傳播速度快、傳染性強(qiáng)等特性被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)宣布成為“國(guó)際公共衛(wèi)生緊急事件”,2020年3月WHO將COVID-19定義為全球性大流行病[6-10]。疫情造成的死亡人數(shù)已遠(yuǎn)超2003年SARS大流行,對(duì)全球的健康、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[11-12]。

SARS-CoV-2為單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)約30 kb。隨著病毒的持續(xù)流行,SARS-CoV-2目前已經(jīng)進(jìn)化出多種基因型和進(jìn)化分支。本研究對(duì)3例輸入性新冠肺炎病例的呼吸道標(biāo)本開(kāi)展核酸檢測(cè)和二代高通量全基因組測(cè)序,并對(duì)基因序列進(jìn)行變異分析和同源性分析,從分子流行病學(xué)角度為濟(jì)南市新冠疫情防控工作提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源 根據(jù)《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》中新冠病毒樣本采集和檢測(cè)技術(shù)指南[13],對(duì)濟(jì)南口岸入境的SARS-CoV-2 無(wú)癥狀感染者采集鼻咽拭子樣本,編號(hào)分別為樣本1-RJ091,樣本2-RJ034,樣本3-RJ136。

1.2 儀器和試劑 GeneRotex 96 全自動(dòng)核酸提取儀和病毒RNA提取試劑均購(gòu)自西安天隆科技有限公司;新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)分別購(gòu)自上海伯杰醫(yī)療科技有限公司、江蘇碩世生物科技股份有限公司、武漢明德生物科技股份有限公司;ABI QuantStudio Q3/Q5以及臺(tái)式熒光計(jì)-Qubit4均購(gòu)自賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific);DNBSEQ-E5基因測(cè)序儀,測(cè)序試劑DNBSEQ-E5RS Sequencing Kit(SE100)及集成測(cè)序載片DNBSEQ-E5RS Integrated Flow Cell均來(lái)自于深圳華大智造科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核酸提取與檢測(cè) 從鼻咽拭子樣本中吸取200 μL進(jìn)行核酸提取,取5 μL用于新冠病毒ORF1ab和N靶基因的檢測(cè),具體操作步驟詳見(jiàn)商品化試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3.2 基因測(cè)序 取提取的目標(biāo)樣本核酸10 μL,通過(guò)ATOPlex RNA 多重PCR擴(kuò)增模塊(華大智造,貨號(hào):940-000132-00)、MGIEasy Fast酶切DNA文庫(kù)制備試劑套裝(華大智造,貨號(hào):940-00029-00)、高通量測(cè)序試劑盒套裝(SE100,貨號(hào):940-000335-00)、DNBSEQ一步法DNB制備試劑盒(OS-DNB)(華大智造,貨號(hào):1000026466)完成病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄、多重PCR、純化、定量等文庫(kù)制備以及OS-DNB的制備等步驟。DNB終濃度≥8 ng/μL后通過(guò)集成測(cè)序載片(華大智造,貨號(hào):1000026251)上機(jī)測(cè)序。按照華大智造公司測(cè)序流程說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 基因組分析數(shù)據(jù)庫(kù)的建立 通過(guò)生物學(xué)分析軟件CLC Genomics Workbench 23.0.4(QIAGEN,Germany)對(duì)已測(cè)序列進(jìn)行優(yōu)化及序列拼接。使用在線分析平臺(tái)pangolin https://pangolin.cog-uk.io/ 對(duì)測(cè)得的病毒全基因組序列進(jìn)行毒株分型,Nextclade(https://clades.nextstrain.org)對(duì)其進(jìn)行變異位點(diǎn)分析。本研究采用SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1(GenBank: MN908947.3)作為新冠病毒參考基因組進(jìn)行分析,同時(shí)從GISAID和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出與所測(cè)序列相似性高,同時(shí)期國(guó)際上公布的序列作為同源性分析的參考基因組,共37條序列通過(guò)MEGA7.0(MasatoshiNei,University of Pennsylvania)軟件分析,最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),用bootstrap抽樣1 000次來(lái)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 核酸檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)RT-PCR法,對(duì)樣本1-RJ091、樣本2-RJ034、樣本3-RJ136的核酸提取物進(jìn)行雙試劑檢測(cè),結(jié)果顯示雙靶標(biāo)(ORF1ab基因和N基因值)擴(kuò)增曲線均呈標(biāo)準(zhǔn)S型且有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期(陽(yáng)性),第三方質(zhì)控品、試劑盒中陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品、陰性標(biāo)準(zhǔn)品以及環(huán)境監(jiān)測(cè)樣品均符合試劑盒結(jié)果判讀要求。

2.2 測(cè)序結(jié)果 3份樣本經(jīng)二代全基因組測(cè)序,測(cè)序質(zhì)量值(Q30)分別為95.92、95.43、98.34,基因組測(cè)序深度分別為5730.77X、2223.97X、2965.59X,拼接后有效全長(zhǎng)在29 835 bp～29 844 bp之間;與標(biāo)準(zhǔn)參考序列SARS-CoV-2 isolate Wuhan-Hu-1)比對(duì),基因組覆蓋率(完整度)分別為99.75%、99.75%、99.65%,覆蓋一致性數(shù)據(jù)較好。

2.3 病毒突變分析 與參比毒株SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1相比,測(cè)序結(jié)果顯示3例樣本基因組變異涉及8個(gè)編碼區(qū)域,其中導(dǎo)致S基因編碼區(qū)氨基酸變異的有32～33個(gè),占總突變的50%以上,ORF1基因上的非同義突變數(shù)為18～20個(gè),占總突變的30%以上。其余編碼區(qū)(包括E、M、N基因)的突變數(shù)僅有10個(gè),N基因占比50%左右。結(jié)合圖1,可發(fā)現(xiàn)3個(gè)樣本序列在S編碼區(qū)均出現(xiàn)了K444T、L452R、N460K、F486V等重要位點(diǎn)的變異,其中病例1和2還出現(xiàn)了R346T的變異。基因組位點(diǎn)詳細(xì)變異情況見(jiàn)表1。

表1 3例病例的基因組位點(diǎn)變異情況

圖1 SARS-CoV-2變異位點(diǎn)進(jìn)化圖[19])

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析 應(yīng)用pangolin分型法及Nextstrain在線平臺(tái)對(duì)病毒進(jìn)行分析,分型結(jié)果顯示,3例不同區(qū)域輸入的新冠病毒均位于BA.5.3.1進(jìn)化分支上,Nextstrain分型為22E,樣本1-RJ091為奧密克戎變異株BQ.1.22,樣本2-RJ034為BQ.1.1,樣本3-RJ13為BQ.1。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建SARS-CoV-2全基因組序列進(jìn)化樹(shù),在進(jìn)化樹(shù)上,3例新冠病毒樣本與來(lái)自日本的參考株BS006451.1、EPI_ISL_18006411聚成一簇,與同時(shí)期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遺傳距離最近,同屬于BQ.1分枝。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)詳見(jiàn)圖2。

●為參考基因組Wuhan-Hu-1株▲sample_1為樣本1-RJ091, ▲sample_2為樣本2-RJ034, ▲sample_3為樣本3-RJ13。

3 討 論

自從2019年12月新冠肺炎出現(xiàn)后,攜帶Spike蛋白D614G的SARS-CoV-2變體迅速成為全球大流行中最普遍的株型[14],經(jīng)過(guò)全球不同人群間的傳播進(jìn)化以及新冠藥物及疫苗的多重選擇下,新的變種不斷出現(xiàn),感染病例不斷攀升,新冠肺炎已然成為了全球范圍內(nèi)最重大的公共衛(wèi)生事件之一[15]。研究表明,SARS-CoV-2基因組平均每月積累2個(gè)堿基突變[16]。持續(xù)深入的病毒基因組監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)評(píng)估新出現(xiàn)的 SARS-CoV-2 變體的風(fēng)險(xiǎn)至關(guān)重要。

本研究通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)對(duì)同一時(shí)間段不同地區(qū)入境的3株新型冠狀毒株進(jìn)行測(cè)序并成功獲得了相應(yīng)的全基因組序列。Pangolin 分型結(jié)果顯示,3例新冠病毒序列均為Omicron變異株,位于BA.5.3.1進(jìn)化分支上,基因型分別為BQ.1.22,BQ.1.1,BQ.1。BQ.1是BA.5通過(guò)變異變遷形成了第6代的一個(gè)亞分支。3例樣本與同時(shí)期日本公布的核苷酸序列相似性最高,遺傳距離最近,同屬于BQ.1分支,提示可能跟日本2022年10月開(kāi)始流行的BQ.1同源。此次全基因組系統(tǒng)發(fā)育分析中可發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2在全球范圍內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定的傳播,世界范圍內(nèi)高密度人群流動(dòng)可使病毒在短時(shí)間內(nèi)擴(kuò)散,符合該毒株在該時(shí)期的上升趨勢(shì)[17]。

通過(guò)對(duì)全基因組變異位點(diǎn)分析以及與Wuhan-HU-1參考序列對(duì)比,3例樣本分別產(chǎn)生了77、80、78個(gè)堿基位點(diǎn)突變,氨基酸突變數(shù)分別為60、63、59,以S編碼區(qū)氨基酸突變頻率最高,ORF1(ORF1a和ORF1b)編碼區(qū)上的突變次之,其余編碼區(qū)(包括E、M、N基因)最少。由于S蛋白是宿主和治療性抗體作用的重要位點(diǎn),通過(guò)受體結(jié)合區(qū)(RBD)與宿主細(xì)胞表面的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)結(jié)合導(dǎo)致細(xì)胞感染[18],因此S蛋白的變異位點(diǎn)對(duì)病毒感染性有著重要影響。3例毒株序列在S刺突蛋白的5個(gè)關(guān)鍵殘基處均集中獲得趨同替換K444T、L452R、N460K 和 F486V的變異,其中病例1和2還出現(xiàn)了R346T的變異,均屬于BQ.1亞系毒株特征性變異位點(diǎn)[19]。所有5個(gè)趨同替換都有助于增加相對(duì)基本繁殖數(shù),而包含所有5個(gè)趨同替換的 BQ.1.1 在所研究的病毒中表現(xiàn)出最高的適應(yīng)性[20]。Fabio S等在中和試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),BQ.1.1比BA.5更能突破BA.2/5感染血清,BQ.1.1 刺突蛋白比 BA.5 刺突蛋白表現(xiàn)出更大的融合性,這些重要位點(diǎn)的突變是導(dǎo)致免疫逃逸的關(guān)鍵[21]。此外,BQ.1 取代 BA5.2 在刺突蛋白上的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域,該位點(diǎn)是COVID-19 疫苗和治療性單克隆抗體(mAbs)的主要靶點(diǎn),因此這些迅速增加的亞變異及廣泛的刺突突變可能對(duì)當(dāng)前某些治療性抗體產(chǎn)生耐藥性。研究表明,臨床批準(zhǔn)的 LY-CoV1404 (bebtelovimab)和Evusheld對(duì) BQ.1 或 BQ.1.1 無(wú)效[22],這引起了人們的擔(dān)憂,即單抗或疫苗對(duì) BQ.1.1 的效果可能不如其他奧密克戎菌株。

由于冠狀病毒亞變體 BQ.1 在逃避抗體方面的優(yōu)勢(shì)使其比原始的Omicron變體更容易傳播,因此,可能會(huì)導(dǎo)致突破性感染和部分人重復(fù)感染,BQ.1.1 已在全球占據(jù)過(guò)主導(dǎo)地位,但到目前為止,沒(méi)有實(shí)質(zhì)性證據(jù)表明 BQ.1及其分支比原來(lái)的奧密克戎變體引起更嚴(yán)重的疾病[19]。雖然我國(guó)已經(jīng)取消了清零政策,但是新變異株的不斷出現(xiàn)一直吸引著人們的極大關(guān)注。截至目前 BA.5.2 及 XBB 是我國(guó)的主要流行毒株,BQ 毒株未成爆發(fā)之態(tài),一方面可能跟毒株本身沒(méi)有導(dǎo)致致病性增強(qiáng)的變異位點(diǎn)有關(guān),另一方面可能跟我國(guó)的防疫政策,醫(yī)療環(huán)境等有關(guān)系,但這個(gè)亞系仍在不斷進(jìn)化和傳播,使得棘突突變的復(fù)雜性也在不斷增加,由奧密克戎毒株引起的突破性感染可交叉中和 BQ.1、BQ.1.1 和 XBB.1.5 毒株等大量新毒株的血清樣本[20-22],二者融合現(xiàn)象越來(lái)越突出,形成“共循環(huán)”,未來(lái)的亞變體應(yīng)該會(huì)綜合 BQ.1.1.*與 XBB.1.5的突變的優(yōu)勢(shì),形成終極的突變模式,這種復(fù)雜模式為疫情發(fā)展走勢(shì)帶來(lái)很大的不確定性,外防輸入仍然面臨考驗(yàn)、挑戰(zhàn)和壓力,我們?nèi)孕杳芮嘘P(guān)注全球疫情形勢(shì)和病毒變異情況,防范病毒卷土重來(lái)。

本研究通過(guò)測(cè)序獲得的3例境外輸入性新冠病毒變異株 OmicronBQ.1及其分支,為濟(jì)南口岸首次檢出的輸入性新冠病毒基因型,豐富了濟(jì)南市SARS-CoV-2變異株的數(shù)據(jù)庫(kù),為潛在的疫情溯源提供了基礎(chǔ)資料。

利益沖突：無(wú)