我國葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒研究進展*

范旭東，胡國君，陳紹莉，任 芳，杜乃凡，戰(zhàn) 良，張尊平，董雅鳳

（1 中國農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所，國家落葉果樹脫毒中心，遼寧興城 125100）（2 遼寧省綠色農(nóng)業(yè)技術(shù)中心）（3 山東青大種苗有限公司）

葡萄在無性繁殖和生長過程中極易感染病毒，感病植株受病毒長期持續(xù)危害，無法通過藥劑治療，嚴重影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)。葡萄是感染病毒種類最多的果樹，目前已報道的病毒多達95 種[1-2]，其中約1/3 的病毒可引起明顯的癥狀和危害，導致樹體長勢減弱、葉片和枝條畸形、葉片變色（變紅、變黃、褪綠、花葉、環(huán)斑）、木質(zhì)部凹陷等。葡萄扇葉衰退?。╣rapevine fanleaf degeneration disease，GFDD）是一類重要的葡萄病毒病，早期研究認為其病原為葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）和10 余種其他線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）病毒[3]。郭德銀等[4]最早采用間接ELISA方法從我國葡萄樣品中檢測到GFLV，但國內(nèi)尚無其他線蟲傳多面體病毒侵染葡萄的報道。

近年來，我國栽植的陽光玫瑰葡萄病毒病發(fā)生普遍，多表現(xiàn)為植株長勢減弱，葉片皺縮、褪綠、畸形等葡萄扇葉衰退病癥狀，為明確其病原，本團隊采用高通量測序技術(shù)，從病株中鑒定到葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）[5]、灰比諾葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV）[6]和葡萄蠶豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）[7]，未檢測到GFLV 和其他線蟲傳多面體病毒屬病毒，明確了我國葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒種類。本文通過對上述病毒研究進展情況進行梳理和總結(jié)，可為有針對性地開展病毒檢測和脫除，進而有效防控葡萄扇葉衰退病提供參考。

1 我國葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒分析

葡萄扇葉衰退?。ㄋ追Q扇葉?。┰谖覈髦饕咸旬a(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，但一直對其病原缺乏深入系統(tǒng)研究。早期僅通過癥狀觀察判斷為扇葉病[8]，后采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）[4]和PCR 方法[9]對GFLV進行檢測，因僅針對目的病毒，因此不能檢測到樣品中的其他病毒。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，使全面檢測樣品中的所有病毒種類成為可能，對揭示引起葡萄病毒病害的病原具有重要意義。近年來，本團隊采用高通量測序技術(shù)對部分表現(xiàn)扇葉衰退病的葡萄樣品進行病毒鑒定，均未檢測到GFLV，而是檢測到GINV、GPGV 和GFabV 等新病毒[10]，進而明確了我國葡萄扇葉衰退病的主要病原。

2 我國葡萄扇葉衰退病相關(guān)病毒研究進展

2.1 葡萄扇葉病毒

20 世紀60 年代初首次報道葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）可通過線蟲傳播，并將其汁液摩擦接種至昆諾藜、千日紅、煙草等草本寄主[11]。Hewitt 等[12]先通過劍線蟲將GFLV 傳播至莧色蔾，再從感染的莧色蔾回接到葡萄植株，引起葡萄產(chǎn)生典型的葡萄扇葉病癥狀，從而完成了GFLV 的柯赫氏法則驗證，證明GFLV 是葡萄扇葉病的病原。GFLV 屬豇豆花葉病毒科（Comoviridae）、線蟲傳多面體病毒屬（Nepovirus）。病毒粒子球形，直徑30 nm，基因組包括RNA1 和RNA2 兩條鏈，不同分離株間無血清學差異，但存在癥狀差異，自然界中未發(fā)現(xiàn)葡萄以外的其他寄主[3]。

我國早期主要通過田間癥狀觀察來確定GFLV侵染，具有一定的主觀性。郭德銀等[4]采用間接ELISA 方法對葡萄樣品進行了GFLV 鑒定，田間品種陽性率為74.3%，熱處理試管苗陽性率為5.6%，國外引進的脫毒品種陽性率為17.7%。晁無疾等[13]采用ELISA 方法對北京地區(qū)葡萄樣品進行檢測，結(jié)果顯示GFLV 在北京地區(qū)發(fā)生普遍。譚雪蓮等[14]對甘肅地區(qū)葡萄樣品進行ELISA 檢測，GFLV 檢出率為13.3%。2000 年以來，許多學者開始采用RT-PCR方法進行檢測[15-18]。張向昆[19]對秦皇島8 個葡萄園5個釀酒品種435 份葡萄樣品進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)葡萄扇葉病普遍發(fā)生，但未檢出GFLV。陳婕等[20]對嘉興地區(qū)6 個縣區(qū)的6 個主栽品種162 份樣品進行檢測，未檢出GFLV。周敏[21]從湖南主產(chǎn)區(qū)采集的54 個表現(xiàn)癥狀的葡萄樣品中29 個樣品檢測到GFLV。Zhou等[22]研發(fā)了巢式PCR 方法，大幅度提高了GFLV 的檢測靈敏度，2017 年首次報道了GFLV 中國分離物的基因組全長序列，其與國外分離物處于不同的進化分支[23]。

由于侵染葡萄的病毒種類繁多，癥狀復(fù)雜多變，很難將某種病毒與癥狀相對應(yīng)，研究結(jié)果也顯示，部分帶病植株檢測不到GFLV[19-21]，故推測存在其他病毒引起類似癥狀。近幾年，高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，可同時檢測發(fā)病植株中的所有已知和未知病毒，對于病原鑒定具有革命性的意義[24]。筆者對表現(xiàn)葉片褪綠斑駁、環(huán)斑、畸形等癥狀的葡萄樣品進行高通量測序，均未檢測到GFLV，而是多次檢出GINV、GPGV 和GFabV，表明引起我國葡萄扇葉衰退病的病原不僅僅是GFLV。

2.2 葡萄漿果內(nèi)壞死病毒

日本于1997 年最先報道葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）[25]。GINV被認為是葡萄漿果內(nèi)壞死病（最早稱花葉?。┑牟≡?，該病于1984 年在日本巨峰葡萄上首次發(fā)現(xiàn)，在當時的日本山梨縣葡萄園中造成嚴重危害。敏感品種（巨峰、先鋒、立川無核、康拜爾早生等）長勢減弱，春季萌芽延遲，并表現(xiàn)莖內(nèi)壞死、短節(jié)，葉片褪綠，果粒變小，果外變色，果內(nèi)壞死等癥狀[26]。GINV 屬發(fā)狀病毒屬（Trichovirus）的成員，病毒粒子大小為740 nm×12 nm，基因組全長為7 229 nt，由3 個開放閱讀框組成，分別編碼復(fù)制酶（RP）、移動蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）。目前已報道3個GINV 中國分離物的基因組全長序列[27]?；贛P和CP 的遺傳進化分析結(jié)果顯示，中國和日本GINV分離物可分為3 組，其中中國分離物主要分在組群1 和組群2，日本分離物位于組群3[28]。GINV 在田間可通過癭螨進行傳播[29]。

Fan 等[5]對表現(xiàn)癥狀（褪綠斑駁和環(huán)斑）和無癥狀的貝達進行小RNA 測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無癥狀植株中僅檢測到2 種類病毒（GYSVd1 和HSVd），而在表現(xiàn)環(huán)斑癥狀的植株中檢測到GINV 和HSVd，推測GINV 與貝達褪綠斑駁和環(huán)斑癥狀發(fā)生相關(guān)。后續(xù)對我國15 個省區(qū)市的195 個葡萄樣品進行GINV 的RT-PCR 檢測，帶毒率為35.9%；表現(xiàn)明顯環(huán)斑癥狀的葡萄樣品GINV 檢出率為94.1%[28]，部分樣品癥狀表現(xiàn)見圖版2-A。雖然將GINV 嫁接傳毒至健康貝達葡萄上會引起環(huán)斑癥狀，但仍不能完成柯赫氏法則驗證。對植物病毒而言，侵染性克隆是完成柯赫氏法則第三條規(guī)則的有效方法。為此，我們構(gòu)建了GINV 侵染性克隆，進一步確定了GINV 能夠引起明顯的葡萄環(huán)斑癥狀[30]。

2.3 灰比諾葡萄病毒

2012 年，意大利研究人員首次發(fā)現(xiàn)灰比諾葡萄病毒（grapevine Pinot gris virus，GPGV），引起灰比諾、塔明娜、黑比諾等葡萄品種葉片褪綠斑駁、皺縮、變形等癥狀，與葡萄扇葉病極為相似[31]。GPGV是葡萄上發(fā)生最普遍、危害最嚴重的病毒之一，目前已有20 多個國家相繼報道[32]。研究表明GPGV 可通過葡萄癭螨進行傳播[33]，并且該病毒在田間存在草本寄主[34]。GPGV 為正義單鏈RNA 病毒，是發(fā)狀葡萄病毒屬（Trichovirus）成員，其基因組由3 個開放閱讀框組成，分別編碼復(fù)制酶（RP）、移動蛋白（MP）和外殼蛋白（CP）。GenBank 數(shù)據(jù)庫登錄的GPGV 基因組全長序列有200 多條[35-36]。

感染GPGV 的葡萄植株并非都表現(xiàn)明顯癥狀，可能與葡萄品種對病毒的敏感性有關(guān)[37]。一些敏感品種并非一直表現(xiàn)明顯癥狀，Bianchi 等[38]發(fā)現(xiàn)，有癥狀植株的GPGV 平均濃度顯著高于無癥狀植株。Bertazzon 等[39]進一步證實了這一現(xiàn)象，指出嚴重癥狀的發(fā)生與較高的病毒濃度有關(guān)。Saldarelli 等[40]對92 個GPGV 分離物基因組序列進行比較分析，發(fā)現(xiàn)MP 基因3′端和CP 基因起始處的588 個堿基區(qū)存在顯著的序列多樣性，特別是在有癥狀的葡萄樣品中，MP 基因存在提前終止密碼子，從而產(chǎn)生了毒力較強的分離物，引起嚴重癥狀。為進一步明確GPGV的致病性，研究者構(gòu)建了侵染性克隆，通過農(nóng)桿菌侵染方式接種葡萄，出現(xiàn)了與田間自然感染植株相同的癥狀，進一步證明了GPGV 與癥狀的關(guān)系，接種的葡萄4～5 個月后會發(fā)生隱癥現(xiàn)象[41]。植株體內(nèi)硼元素的平衡在減輕癥狀中起到一定作用[40-41]。

2016 年，我國首次報道了GPGV，檢測的36個葡萄樣品中15 個為陽性，其中10 個樣品表現(xiàn)褪綠花葉癥狀[6]，部分樣品癥狀表現(xiàn)見圖版2-B。將5個感染GPGV 的葡萄樣品（僅1 個表現(xiàn)褪綠花葉癥狀）嫁接傳毒至健康貝達葡萄上，結(jié)果均表現(xiàn)明顯的褪綠花葉癥狀，表明貝達葡萄對GPGV 較為敏感。2018 年，采用RT-PCR 方法對采自15 個省區(qū)市的195 個葡萄樣品進行檢測，GPGV 檢出率為28.2%[42]。

2.4 葡萄蠶豆萎蔫病毒

葡萄蠶豆萎蔫病毒（grapevine fabavirus，GFabV）是2016 年從日本鮮食葡萄上鑒定出的新病毒[43]，中國、韓國、美國等也有報道[7,44-45]。GFabV 屬于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）蠶豆萎蔫病毒屬（Fabavirus）成員，其基因組由RNA1 和RNA2 兩條正義單鏈組成[46]。GFabV 基因組變異較大，基于RNA1 和RNA2 多聚蛋白的部分核苷酸序列系統(tǒng)進化樹分析表明，中國和國外GFabV 分離物可劃分為5 個種群，中國分離物歸屬于其中的3 個種群[47]。日本學者基于RNA1 基因組序列將GFabV 分離物劃分為4 個種群[45]。目前，中國已獲得了3 個具有明顯差異的GFabV 基因組全長序列[48-49]。

2017 年，采用小RNA 測序技術(shù)，我國首次從表現(xiàn)葉片褪綠斑駁及畸形癥狀的貝達葡萄上檢測到GFabV，通過嫁接傳毒的方法，明確了該病毒與貝達病毒病癥狀的相關(guān)性[7]。我國陽光玫瑰病毒病普遍發(fā)生，表現(xiàn)葉片變小、褪綠斑駁、畸形等癥狀，但均未檢測到GFLV[50-51]。2019 年，我們采用小RNA測序技術(shù)，對表現(xiàn)和不表現(xiàn)癥狀的陽光玫瑰進行病毒鑒定，發(fā)現(xiàn)GFabV 在感病陽光玫瑰中檢出率達88.2%，明顯高于其他病毒，因此推測GFabV 是引起陽光玫瑰病毒病的關(guān)鍵病原[10]。日本保存的陽光玫瑰無病毒原種不攜帶病毒和類病毒，但母本樹（原種嫁接到5BB 砧木上）攜帶GFabV、葡萄雙生病毒A、啤酒花矮化類病毒和葡萄黃斑類病毒1[52]。韓國學者也在葡萄上檢測到GFabV，帶病毒的陽光玫瑰葡萄表現(xiàn)葉片褪綠和畸形癥狀[45]。部分感染GFabV的葡萄樣品癥狀見圖版2-C。

3 展望

葡萄扇葉衰退病在我國葡萄產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，曾經(jīng)認為類似癥狀均由GFLV 引起，近年研究發(fā)現(xiàn)，除GFLV 外，GINV、GPGV 和GFabV 也會引起扇葉衰退病癥狀（葉片畸形、黃斑、環(huán)斑、黃化），而且檢出率顯著高于GFLV。通過侵染性克隆構(gòu)建（GINV）、嫁接傳毒（GPGV、GFabV）等試驗研究，證明GINV、GPGV、GFabV 與我國葡萄扇葉衰退病相關(guān)。今后應(yīng)加強GINV、GPGV、GFabV 的致病性及傳播途徑研究，研發(fā)高效的病毒檢測和脫除技術(shù)，建立規(guī)范的葡萄脫毒種苗培育體系，為我國葡萄產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供苗木保障。