水飛薊賓靶向結直腸癌腫瘤微環(huán)境作用機制研究進展

何盛瀾，徐小雯，龔 彪，3

1.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院消化病研究所（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院內鏡中心（上海 201203）；3.上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院消化內科（上海 201203）

結直腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內位于惡性腫瘤的第3位，病死率位于第2 位，我國結直腸癌的發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢，給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來了沉重負擔［1-2］。目前，結直腸癌的常規(guī)治療方式包括根治性外科手術、免疫治療、靶向治療及新輔助放射治療（以下簡稱“放療”）、化學療法（以下簡稱“化療”）等。研究［3］表明，腫瘤的侵襲、轉移及耐藥與腫瘤細胞的自發(fā)性遺傳學異常有關，并在很大程度上受腫瘤微環(huán)境調控。腫瘤細胞能夠通過調控細胞因子的生成與分泌重塑腫瘤微環(huán)境，繼而為自身增殖、侵襲創(chuàng)造更有利的條件，這一過程是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)［4-7］。

近年來，雖然靶向藥物的研發(fā)與臨床轉化明顯提升了進展期結直腸癌患者的生存率［8］，但由于個體化的差異，仍有部分患者無法從中獲益［9-10］。天然產物具有高活性、多靶點、毒副作用小等特點，是靶向藥物的重要來源。作為天然產物的一種，水飛薊賓能夠在腫瘤的不同階段發(fā)揮抗腫瘤作用，如誘導細胞凋亡和自噬、抑制血管新生及遷移，且安全性較高，可作為日常膳食補充劑，在結直腸癌的研究中引起了廣泛關注［11-12］。本文主要從血管生成、炎癥反應、免疫細胞、細胞外基質以及腫瘤相關成纖維細胞等方面綜述水飛薊賓對結直腸癌腫瘤微環(huán)境的靶向作用，以期為結直腸癌的治療提供參考。

1 腫瘤微環(huán)境

腫瘤微環(huán)境是指圍繞在腫瘤細胞周圍的細胞和理化成分，其在腫瘤形成和進展的各個時期呈動態(tài)變化，并對腫瘤生長、血管形成、上皮細胞-間充質轉化等過程起至關重要的作用［13］。腫瘤微環(huán)境不僅是腫瘤細胞轉化生長過程中的一種被動反應結果，也是腫瘤進展中的主動參與者，更是腫瘤發(fā)展各個階段不可或缺的固有組成部分。

與腫瘤細胞相比，腫瘤微環(huán)境中的非腫瘤成分具有更好的遺傳穩(wěn)定性，不易產生獲得耐藥基因突變并參與調控藥物耐受的可逆機制［14］，因此以腫瘤微環(huán)境作為藥物靶點，發(fā)生耐藥的概率相對較低。研究［15］表明，腫瘤微環(huán)境正常化能夠減弱獲得性耐藥、抑制腫瘤進展、延長患者生命周期。目前腫瘤微環(huán)境靶向藥物已經被證實對多種類型的腫瘤有效，與放療、化療聯用，可以增強抗腫瘤治療效果［16］。此外，不同類型腫瘤的腫瘤微環(huán)境變化具有一定的共通性，這也為治療藥物的普適性帶來了希望。

2 水飛薊賓靶向結直腸癌腫瘤微環(huán)境的作用機制

水飛薊是一種菊科植物，其果入藥，在肝臟疾病的治療中已有非常悠久的歷史。水飛薊素是從該植物的種皮中提取的一類有效成分，其中以水飛薊賓含量最高、作用最強。研究［12，17-18］顯示，水飛薊賓具有較強的抗腫瘤作用，其對腫瘤細胞的調控機制涉及阻滯細胞周期、誘發(fā)細胞凋亡、調控自噬和調節(jié)微小RNA 等，上述藥理特性均已在結直腸癌體內、體外實驗中得到了廣泛驗證［19］。除了對腫瘤細胞的抑制作用以外，水飛薊賓對腫瘤微環(huán)境中的各種成分亦具有靶向抑制性。

2.1 抑制血管生成 實體腫瘤的新生血管由內皮細胞和周皮細胞構成，是腫瘤微環(huán)境中最重要的成分，也是實體腫瘤從癌前病變發(fā)展為惡性侵襲表型過程中至關重要的一步［20］。當腫瘤大小超過1 mm3時，氧氣和營養(yǎng)物質很難輸送至腫瘤核心細胞中，進而造成細胞缺氧。缺氧環(huán)境會導致腫瘤細胞分泌多種促血管生成因子［如血管內皮生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）］，并從鄰近血管中招募內皮細胞［21］；腫瘤微環(huán)境中的其他成分（如腫瘤相關成纖維細胞、免疫細胞）也可能通過細胞外基質重塑和分泌促血管生成因子，并由此促進血管形成［20］。研究［12］證實，水飛薊賓能夠在腫瘤治療中發(fā)揮顯著的抑制血管生成作用，其中也包括結直腸癌。

Sameri 等［11］研究表明，水飛薊賓可以抑制血管生成，進而發(fā)揮抗腫瘤作用，經水飛薊賓干預的結直腸癌CT26細胞中，涉及血管生成的VEGF、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、血管生成素（Ang）-2 和Ang-4mRNA 水平顯著降低。Singh 等［22］采用皮下注射結腸癌HT29 細胞的方法建立裸鼠移植瘤模型，并用水飛薊賓進行干預，結果顯示水飛薊賓可以降低移植瘤中血管生成相關蛋白誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、COX-2、HIF-1α、VEGF 的表達。Ravichandran 等［23］以氧化偶氮甲烷（AOM）誘導的結腸癌A/J小鼠為研究對象，發(fā)現水飛薊賓可以顯著抑制小鼠腫瘤組織中VEGF 和iNOS 的表達，進而發(fā)揮抗血管生成的作用。Rajamanickam 等［24］采用APC-min/+小鼠建立自發(fā)腸道腺瘤動物模型，并在此基礎上探討水飛薊賓對結直腸癌的化學預防作用，結果顯示水飛薊賓能夠選擇性抑制模型小鼠息肉中巢蛋白陽性微血管的形成，進而減少息肉形成。

2.2 抑制炎癥反應 腫瘤細胞分泌的炎癥因子會募集免疫細胞遷移至腫瘤微環(huán)境，這些免疫細胞容易發(fā)生失常反應，從而有利于腫瘤細胞的生長，持續(xù)的內環(huán)境紊亂又會加重機體炎癥反應［25］。炎癥環(huán)境是結直腸癌形成和發(fā)展的重要調節(jié)因素，異常表達的趨化因子和細胞因子介導的串擾既驅動著腫瘤的轉移、耐藥和免疫抑制，又是抗腫瘤治療藥物的潛在靶點［26］。慢性炎癥通過氧化應激、異常的免疫介導等途徑促進腫瘤發(fā)展，常見的影響因子有信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）、核因子-κB（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素（IL）-1β、IL-6等［27-28］。

Raina等［29］研究證實，水飛薊賓能夠明顯抑制TNF-α誘導的NF-κB 活化及炎癥因子COX-2 和iNOS 的表達，從而起到抗炎、抗腫瘤作用。除此之外，結直腸癌異種移植模型、化學腫瘤模型以及基因工程小鼠結直腸癌模型均證實水飛薊賓對iNOS 具有抑制作用［22-24］。Kauntz 等［30］采用水飛薊賓干預AOM 誘導的結直腸癌模型大鼠，結果顯示，與對照組相比，水飛薊賓能明顯降低模型大鼠結腸黏膜中IL-1β、TNF-α的表達水平，表現出強大的促凋亡、抗炎作用。

水飛薊賓能夠抑制三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的結腸炎模型大鼠結腸組織中NF-κB激活及IL-1β、TNF-α表達，聯合熊去氧膽酸（UDCA）還能顯著改善模型大鼠腸道的抗氧化能力，進而緩解炎癥［31］。與蘆丁聯用時，水飛薊賓能顯著抑制結腸癌HT-29 細胞中炎癥標志蛋白［NF-κB、人核因子κB抑制蛋白-α（IKK-α）、人核因子κB 抑制蛋白-β（IKK-β）］表達，下調B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、中期因子-2（MK-2）mRNA 的表達，從而誘導細胞凋亡［32］。

可見，水飛薊賓能夠有效抑制炎癥因子的表達，下調炎癥相關通路，從而改善腫瘤微環(huán)境的慢性炎癥狀態(tài)。

2.3 調節(jié)免疫細胞 免疫細胞主要分為適應性免疫細胞和先天免疫細胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。免疫細胞具有雙重調節(jié)功能，一方面其可以調節(jié)免疫功能，從而抑制腫瘤的生成；另一方面，免疫細胞的促炎和免疫抑制作用又參與腫瘤微環(huán)境的重塑，這一過程會增加腫瘤微環(huán)境的復雜性，從而有利于腫瘤細胞的免疫逃逸［28］。免疫細胞與趨化因子、細胞因子等共同建立炎癥環(huán)境，而腫瘤微環(huán)境內的細胞重塑在很大程度上是由炎癥驅動的，因此深入了解其免疫發(fā)病機制有利于制定更為有效的治療策略［33］。

肥大細胞與免疫細胞、炎癥介導的結直腸癌密切相關，其能通過調節(jié)促炎細胞因子和誘導性炎癥酶發(fā)揮重要作用［34-35］。Kim等［36］研究發(fā)現，濃度范圍在0.05～0.4 mmol/L 的水飛薊賓能不同程度地下調人肥大細胞HMC-1中的NF-κB信號通路，同時抑制IL-6、IL-8、TNF-α等促炎細胞因子的產生。

巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中較為豐富的細胞之一，其可以通過分泌細胞因子介導炎癥反應，如激活IL-6R/STAT3 途徑，從而增強結直腸癌細胞的增殖和侵襲能力［37-38］。水飛薊賓能夠有效抑制小鼠巨噬細胞系RAW264.7 中TNF-α、COX-2、一氧化氮（NO）和IL-6 的表達，其抗炎作用與抑制NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）的活性有關［39-40］。

2.4 調節(jié)細胞外基質 細胞外基質是膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、蛋白聚糖/黏多糖和幾種糖蛋白組成的非細胞三維大分子網絡，基質成分之間相互連結，并與細胞黏附受體相連，在組織和器官中形成復雜網絡，細胞表面受體通過細胞外基質轉導信號，調節(jié)細胞生長、遷移、分化等多種功能［41］。細胞外基質是一種動態(tài)結構，在正常組織中連續(xù)不斷地經歷可控的重塑，而當組織病變時，細胞外基質的組成、結構、剛度均會發(fā)生變化，即重塑異常，其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關［42］。水飛薊賓能夠顯著削弱腫瘤細胞與細胞外基質成分的相互作用，從而減弱腫瘤細胞的動力和侵襲力，纖連蛋白在包括結直腸癌在內的多種惡性腫瘤中呈高表達，水飛薊賓可顯著降低其表達水平［12］。

腫瘤細胞分泌的基質金屬蛋白酶（MMPs）是降解細胞外基質，抑制腫瘤細胞侵襲、轉移的關鍵因素，可作為腫瘤復發(fā)、轉移的預測標志物，也是腫瘤治療的有效靶點［43-44］，體外、體內實驗已證實水飛薊賓能夠顯著抑制MMPs 表達。Lin 等［45］在結直腸癌LoVo 細胞的體外實驗中發(fā)現，水飛薊賓可以降低激活蛋白-1（AP-1）的結合活性，下調MMP2 表達，進而抑制腫瘤細胞的侵襲能力。結直腸癌細胞實驗和異種移植腫瘤模型研究均顯示，水飛薊賓可通過抑制NF-κB 轉錄活性而降低MMP9表達，從而抑制腫瘤細胞遷移［11，29］。

2.5 抑制腫瘤相關成纖維細胞激活 在腫瘤微環(huán)境中，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關的成纖維細胞被稱為腫瘤相關成纖維細胞，主要來源于正常的成纖維細胞、上皮細胞、骨髓間充質細胞等，腫瘤細胞分泌的生長因子、細胞因子等均能激活這些細胞并將其改造為有利于自身發(fā)展的腫瘤相關成纖維細胞［46-47］。腫瘤相關成纖維細胞具有高可塑性和極端的異質性，其生物標記物較多，主要有α-平滑肌動蛋白（α-SMA）、波形蛋白（VIM）、成纖維細胞活化蛋白（FAP）、肌間線蛋白等，其中α-SMA是腫瘤相關成纖維細胞最可靠的特異性標志物，FAP則是基于腫瘤相關成纖維細胞進行治療的最有前途的靶點［48］，直接靶向FAP 的人源單克隆抗體西羅珠單抗（Sibrotuzumab）已經成功應用于臨床［15］。

目前有關水飛薊賓作用于腫瘤相關成纖維細胞的報道較少。水飛薊賓能夠靶向抑制轉化生長因子（TGF）-β2，從而阻止前列腺癌上皮細胞介導的腫瘤相關成纖維細胞激活［49］。單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）是腫瘤相關成纖維細胞介導的前列腺癌侵襲的關鍵成分，水飛薊賓可以抑制NF-κB和AP-1的結合活性，從而降低腫瘤相關成纖維細胞中的MCP-1 表達［50］。此外，水飛薊賓與IPI-549 聯用，可有效重塑乳腺癌模型小鼠的腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤相關成纖維細胞激活，同時具有抗纖維化、抑制腫瘤細胞遷移和血管生成的作用［51］。但在其他腫瘤中尚缺乏相關的研究。

研究［52］發(fā)現，通過藥物阻滯或者基因敲除STAT3可以抑制TGF-β 信號通路所誘發(fā)的肌成纖維細胞激活。水飛薊賓是已知的天然STAT3抑制劑，其對STAT3磷酸化的抑制作用在多種臨床前腫瘤模型中均得到了證實［53］。因此，水飛薊賓可能是通過STAT3信號通路抑制結直腸癌中腫瘤相關成纖維細胞激活的潛在靶點。

3 水飛薊賓制劑的研究進展

水飛薊賓的黃酮類結構使其生物利用率較差，為改善其吸收效果，臨床一般使用水飛薊賓磷脂復合物。但即便給予結直腸癌患者口服最大劑量的水飛薊賓磷脂復合物，仍不能發(fā)揮其最佳藥理活性［12，54］，因此研發(fā)具有更高吸收效能的水飛薊賓制劑是十分必要的。

為了提高水飛薊賓的生物利用度，許多研究者通過化學結構修飾開發(fā)了許多半合成衍生物和制劑。Xu等［55］發(fā)現，水飛薊賓希夫堿衍生物較水飛薊賓溶解度升高，能通過增強抗炎和抗凋亡作用抵消四氯化碳誘導C57BL/6J 小鼠的急性肝損傷，且安全性良好。Xi等［56］研究表明，相比水飛薊賓，糖化基水飛薊賓衍生物具有更好的水溶性（＞15 mg/L），該衍生物在肝微粒體中表現出良好的代謝穩(wěn)定性。另外，水飛薊賓磷酸二酯糖偶聯物可大大提高水飛薊賓中黃酮木脂素部分的水溶性和抗氧化活性［57］。

近年來納米靶向藥物得到了快速的發(fā)展，納米藥物不僅可以明顯降低藥物毒性，還具有改善生物利用率和增強靶向特異性等優(yōu)點，可明顯提高化療的療效和安全性［58-60］。研究［61］發(fā)現，負載水飛薊賓的磁性尼奧小體納米顆粒（MNNPs）復合物對結直腸癌HT-29 細胞具有明顯的細胞毒性作用，可誘導HT-29 細胞發(fā)生凋亡，且呈劑量和時間依賴性。雖然納米醫(yī)學提高了水飛薊賓的生物利用度，但其帶來的副作用和并發(fā)癥不容忽視，須不斷進行優(yōu)化，以形成腫瘤微環(huán)境靶向標準化治療體系，進而使越來越多的腫瘤患者從中獲益［62-63］。

4 總結與展望

腫瘤微環(huán)境在惡性腫瘤治療中的重要性是毋庸置疑的，腫瘤細胞可利用血管生成增強自身的營養(yǎng)供給，并通過炎癥反應創(chuàng)造有利于自身發(fā)展的免疫微環(huán)境，重塑細胞外基質，進而實現腫瘤的侵襲、轉移和定植。雖然不同類型的腫瘤微環(huán)境具有一定的共通性，但個體間和不同腫瘤之間的腫瘤微環(huán)境仍存在一定差異，且腫瘤微環(huán)境具有強大的代償調控機制，因此需挖掘更貼合臨床發(fā)展的模型以探索腫瘤微環(huán)境影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，摸索腫瘤微環(huán)境中各腫瘤標記物的臨界值，并設定相關標準，從而為個體化治療及新靶點的研究提供依據。

水飛薊賓是十分理想的結直腸癌治療藥物，其不僅對結直腸癌腫瘤細胞有明顯的抑制作用，還可通過調節(jié)腫瘤微環(huán)境中各個成分的表達影響結直腸癌的形成和發(fā)展。Jain［64］于2001年首次提出“血管正?；钡母拍?，認為抗血管生成藥物可以在破壞腫瘤血管之前使其正?；?，進而改善藥物輸送和增加組織含氧量。還有研究［65］認為抗血管生成藥物具有“時間窗”，有利于增加其他藥物作用于腫瘤細胞的療效。因此，只有合理使用抗血管生成藥物、抓住“血管正?；瘯r間窗”，才能使聯合用藥發(fā)揮最佳的協同作用；但目前對于血管正常化期間腫瘤是否進展仍存在爭議，所以血管正?；^程中的細胞分子機制也需進一步驗證。在輕度缺氧狀態(tài)下，抗血管生成是否是抗腫瘤的關鍵機制，還需進一步從“血管正?；焙汀皶r間窗”的角度進行研究。由于目前相關研究較少，因此水飛薊賓是否能夠通過血管正?；种颇[瘤進展仍待探索。