魚類的干擾素系統(tǒng)：研究進展與我國學者的貢獻

李 麗，鄒 鈞，蘇建國，劉蘭浩，張 珊，聶 品*

(1.中國科學院水生生物研究所，淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，湖北 武漢 430072；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海 201306；3.華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，湖北 武漢 430070；4.青島農(nóng)業(yè)大學海洋科學與工程學院，山東 青島 266109)

脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要抗病毒策略是在模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別病毒后誘導干擾素(interferon,IFN)產(chǎn)生[1]。IFN 是一類由有核細胞分泌的具有廣譜抗病毒活性的多效能細胞因子，其本身不具有直接的抗病毒作用，而是依賴于RNA 和蛋白質(zhì)合成等細胞代謝過程發(fā)揮其活性。IFN 通過調(diào)控激活一系列信號通路，誘導產(chǎn)生大量具有抗病毒作用的ISGs。這些ISGs可直接作為效應蛋白抵抗病毒感染，或者作為調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)控細胞或者宿主的抗病毒狀態(tài)[2]。近年來，我國學者發(fā)現(xiàn)非哺乳動物IFN 的部分成員還具有強大的直接或間接抗細菌功能[3-4]。

魚類被認為是最早具有完善IFN 系統(tǒng)的脊椎動物類群，是研究IFN 系統(tǒng)組成、功能和起源的重要對象，備受比較免疫學家的青睞[5]。近年來，國內(nèi)外魚類免疫學家在魚類IFN 系統(tǒng)研究方面取得了重大進展。尤其值得關注的是，2022 年我國魚類免疫學研究團隊在斑馬魚(Danio rerio)和非洲爪蟾(Xenopus laevis)中鑒定到了一類新型IFN，將之命名為IV 型IFN，極大地拓展了我們對IFN系統(tǒng)復雜性和多樣性的認知[6-7]。至此，根據(jù)基因結構、基因座、受體組成以及信號通路等特點將IFN 分為I 型、II 型、III 型和IV 型共四種類型[6,8]。目前，已經(jīng)在魚類中發(fā)現(xiàn)了全部四種類型IFN 的存在，其中III 型IFNs 只在軟骨魚中有報道[9]。

IFN 的信號傳導起始于與細胞膜上特異性受體的結合，進而激活胞質(zhì)中的JAK/STAT 信號通路，最終誘導一系列ISGs 和補體轉(zhuǎn)錄，這些誘導表達的ISGs 和補體是IFN 發(fā)揮其抗病毒和抗細菌等抗感染功能的效應分子[4,10]。IFN 功能的多樣性和復雜性源于其大量誘導表達的效應分子的作用。在哺乳動物中，I 型和III 型IFNs 的功能相似，主要是作為先天性的抗病毒因子，它們的區(qū)別在于III 型IFNs 的表達具有組織細胞特異性，而I 型IFNs 幾乎在所有有核細胞中表達[11-12]。相比而言，II 型IFN 主要由CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK)等免疫細胞表達產(chǎn)生，主要功能是免疫調(diào)控、協(xié)調(diào)病毒和細菌感染中產(chǎn)生的先天性和適應性免疫[13]。IV 型IFN 的誘導機制似乎與I 型和III 型的非常相似，已有研究表明其具有顯著的抗病毒作用，推測IV 型IFN 可能與I 型和III 型IFN 功能相似，主要在先天的抗病毒免疫反應中發(fā)揮作用[6,14-15]。

1 I 型干擾素

1957 年，科學家Isaacs 等[16]在用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒感染時首次發(fā)現(xiàn)IFN，后來的研究表明，該IFN 屬于I 型IFN。到目前為止，哺乳動物I 型IFN 的已知成員有IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ、IFN-τ、IFN-ν、IFN-μ 和IFN-ζ(limitin)。但并非所有的哺乳動物都具有這些IFN，其中IFN-δ、IFN-τ 和IFN-ζ 分別存在于野豬(Sus scrofa)、反芻類(ruminants) 和小鼠(Mus musculus)中；IFN-ν 在人(Homo sapiens)及除貓科(Felidae)動物以外的其他胎盤類哺乳動物中被認為是假基因，但研究發(fā)現(xiàn)其在家養(yǎng)貓中可能是有功能的；IFN-μ 則只存在于馬(Equus caballus)中[17-18]。

IFN-α 和IFN-β 是哺乳動物中分布最為廣泛，研究最為深入的I 型IFN。哺乳動物I 型IFN 具有廣泛的生物學功能，如抗病毒、抗菌、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等[12]。I 型IFN 與其特異性受體結合后通過激活JAK-STAT 信號通路，從而激活ISGs 轉(zhuǎn)錄，如抗黏液病毒基因 (myxovirus resistant gene，Mx)、ISG15 以及2'-5'寡腺苷酸合成酶(2'-5' oligoadenylate synthetase,OAS)等基因的轉(zhuǎn)錄，以抵抗病毒等病原的感染[8]。I 型IFN 的主要功能之一是抗病毒作用，這涉及多種機制，如阻止病毒進入細胞、控制病毒基因的轉(zhuǎn)錄、切割病毒RNA 以及控制病毒蛋白的合成等[19-20]。除此之外，I 型IFN 在免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用，調(diào)控宿主的先天性和適應性免疫。如IFN-α 和IFN-β 可誘導NK 細胞的細胞毒性，誘導大多數(shù)細胞中的主要組織相容復合物I 類(major histocompatibility complex I,MHC I)分子的表達，以及誘導共刺激分子在抗原提呈細胞中的表達[21-22]。

與哺乳動物相比，魚類IFN 的研究起步較晚，但近年來取得了顯著的進展。魚類IFN 的深入研究始于2003 年，當年有三個獨立的研究團隊分別在斑馬魚、大西洋鮭(Salmo salar)、暗綠鲀(Tetraodon nigroviridis)中鑒定了完整的IFN 基因序列[23-25]。自此，IFN 的發(fā)現(xiàn)鑒定不斷增多，在不同分類地位的魚類中被鑒定，主要包括鯉形目(Cypriniformes)、鮭形目(Salmoniformes)、鱸形目(Perciformes)、鰈形目(Pleuronectiformes)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鲇形目(Siluriformes)、頜針魚目(Beloniformes)、鰻鱺目(Anguilliformes)、以及軟骨魚類等[6-7,26-28]。近些年來，我國學者對不同魚類中I 型IFN 的類群鑒定和功能研究做出了突出的成績，如對草魚(Ctenopharyngodon idella)[29]、鯽(Carassius auratus)[30]、青魚(Mylopharyngodon piceus)[31-32]、鱖(Siniperca chuatsi)[33]、翹嘴鲌(Culter alburnus)[26]、烏鱧(Channa argus)[34]、大黃魚(Larimichthys crocea)[35-36]等魚類I 型IFN 的鑒定和功能研究。

1.1 魚類I 型IFNs 的基因結構

在基因結構組成方面，哺乳動物和鳥類等羊膜動物的I 型IFNs 無內(nèi)含子，而魚類I 型IFNs由4 個內(nèi)含子和5 個外顯子組成[28,37]。在研究I型IFNs 的進化中，有學者認為I 型IFNs 可能很早就作為有內(nèi)含子的基因出現(xiàn)在脊椎動物中，并在四足動物和魚類中同步進化[38]。我國學者在闡明I 型IFNs 由魚類中的有內(nèi)含子進化為羊膜動物中的無內(nèi)含子的研究中做出了突出的貢獻。2010 年，我國學者在研究兩棲動物熱帶爪蟾(X.tropicalis)的I 型IFNs 時提出I 型IFNs 逆轉(zhuǎn)座假說，解釋了羊膜動物中I 型IFNs 內(nèi)含子丟失事件[39]。隨后，以熱帶爪蟾和青藏高原特有的兩棲動物高山倭蛙(Nanorana parkeri)為研究對象，我國學者發(fā)現(xiàn)熱帶爪蟾、高山倭蛙和羊膜動物的無內(nèi)含子I 型IFNs 基因可能是由互相獨立的逆轉(zhuǎn)座事件產(chǎn)生的[40-41]。

此外，一些魚類IFNs 可通過選擇性使用不同的啟動子而產(chǎn)生不同的異構體，這些異構體轉(zhuǎn)錄本表現(xiàn)出不同的本底和誘導表達水平[42-46]。斑馬魚的IFNφ1 存在有信號肽和缺乏信號肽兩種轉(zhuǎn)錄異構體，其中缺乏信號肽的異構體形式呈現(xiàn)組成型表達，而病毒感染可顯著誘導含信號肽的轉(zhuǎn)錄本[47]。隨后的功能研究表明魚類中缺乏信號肽的I 型IFNs 具有正常的抗病毒功能，可作為一種新型防御手段來對抗病毒感染[46]。

1.2 魚類I 型IFNs 的分類和命名

與其他類型的IFN 相比，I 型IFNs 在不同脊椎動物中存在的類群/亞群和拷貝數(shù)是高度多樣化的。由于I 型IFNs 在進化過程中受到逆轉(zhuǎn)座事件以及譜系專一性的擴增和分化影響，硬骨魚類的I 型IFNs 與高等脊椎動物的I 型IFNs 同源性僅在13%～30%，通過序列相似性難以區(qū)分硬骨魚類的I 型IFNs 的亞型，同時也難以與哺乳動物I 型IFNs 建立一一對應關系[38]。起初，關于魚類I 型IFNs 的命名沒有一致的標準，甚至在不同的魚類中存在不同的命名規(guī)則。通過魚類免疫學家的不斷探索，目前已建立了一套魚類特有的IFN 分類命名系統(tǒng)。最初，根據(jù)干擾素成熟肽中參與形成二硫鍵的半胱氨酸的數(shù)目，將I 型IFNs 分成兩大類：含有兩個半胱氨酸的類群I (group I)和含有四個半胱氨酸的類群II (group II)，且每個類群又被進一步分成不同的亞群[48]。隨著不同魚類基因組的公布以及新的I 型IFNs 亞群基因的鑒定，魚類I 型IFNs 的類群劃分一直處于不斷地修訂和完善中[37]。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，I 型IFN 可分為8 個亞群，即IFNa -IFNf 以及IFNh 和IFNi，但是IFNg 一般指II 型IFN-γ，所以其在I 型IFNs亞群命名中不被采用[37,49]。

迄今為止，根據(jù)半胱氨酸數(shù)目，同時參考受體組成以及系統(tǒng)進化關系，有學者將已知的硬骨魚類I 型IFNs 分為四個類群，類群I 含有兩個半胱氨酸，廣泛存在于各種魚類中，包括IFNa、IFNd、IFNe 和IFNh 四個亞群，且發(fā)現(xiàn)類群I 的基因擴增可能與硬骨魚類特定的全基因組復制事件有關[38]；類群II 含有四個半胱氨酸，包括IFNc和IFNi；類群III (group III)也含有四個半胱氨酸，目前報道的只有IFNf，該類群似乎分化較早，迄今為止只在鮭鱒魚類和鰻鱺中被報道，是與軟骨魚的I 型IFNs 最接近的類群[37,50-51]；類群IV(group IV)包含IFNb，最初IFNb 和IFNc 因含有四個半胱氨酸被劃分到類群II，但近期在研究烏鱧(Channa argus) I 型IFNs 時，發(fā) 現(xiàn)IFNb 和IFNc 在系統(tǒng)發(fā)育樹中形成姊妹群，則將IFNb 形成的姊妹群單獨命名為類群IV。至此，魚類I 型IFNs 根據(jù)進化關系可分為4 個類群[34]。

如表1 所示，I 型IFNs 在不同種類的魚類中存在不同的拷貝數(shù)和組成差異。鮭鱒類，如虹鱒似乎具有最復雜多樣的I 型IFNs 組成，包含有除IFNh 和IFNi 以外的所有其他6 個亞群的IFN，即IFNa -f[52]，而在斑馬魚、鯉、翹嘴鲌等鯉科魚類中的I 型IFNs 亞群組成為IFNa、IFNc 和IFNd[26,28-29]。在棘鰭總目(Acanthopterygii)中發(fā)現(xiàn)存在IFNc、IFNd 和IFNh 三個亞群的IFNs。例如，鱸形目的鱖、大黃魚和大西洋白姑魚[33,49,53]，鰈形目的牙鲆和大菱鲆中均存在上述三個I 型IFNs[54-55]。達氏鱘、中華鱘和雀鱔中I 型IFNs 的類群I 中只有IFNe 單一類型[50,56]。然而，目前還不清楚不同魚類中一些IFN 亞群缺失和擴增的原因，現(xiàn)有的證據(jù)至少表明I 型IFNs 可能在硬骨魚類的不同種類中經(jīng)歷了獨立的演化事件[9,34,50-51]。此外，研究結果顯示，與IFN 配體相互作用的一套完整的IFN 受體也存在于軟骨魚——米氏葉吻銀鮫(Callorhinchus milii)[9]。

表1 I 型IFNs 在不同種類魚類中的組成差異Tab.1 Composization of type I IFNs in different fish species

1.3 魚類I 型IFNs 的受體和信號傳導

哺乳動物所有I 型IFNs 都共用一套受體，IFNAR1 和IFNAR2，它們均屬于II 型細胞因子受體家族[8]。魚類的IFN 受體屬于細胞因子受體家族B(cytokine receptor family B，CRFB) 的成員，而魚類中已發(fā)現(xiàn)的CRFB 成員至少有17 個[25,57-58]。從系統(tǒng)發(fā)育分析看，魚類CRFB1～3 均與哺乳動物IFNAR2 同源。有趣的是，并非所有硬骨魚類都具有CRFB3；CRFB5 與哺乳動物IFNAR1 同源[28]，其在大部分魚類中只有一個拷貝，而在大西洋鮭中有4 個拷貝[59]。在斑馬魚的研究中，研究人員通過功能缺失和獲得的技術方法，發(fā)現(xiàn)I 型IFNs中的類群I 通過結合CRFB1 和CRFB5 發(fā)揮抗病毒功能，而類群II 通過CRFB2 和CRFB5 發(fā)揮抗病毒功能[60]。

目前的研究顯示，硬骨魚類不同類群的I 型IFNs 似乎選擇性結合不同的受體復合物。我國學者在一些魚類的I 型IFNs 的受體組成方面也取得了良好的研究成績[61-63]。利用IFN 及其受體的物種特異性，通過在不同細胞中共轉(zhuǎn)染I 型IFNs 配體和受體的方法對鱖I 型IFNs 的三個成員IFNc、IFNd 和IFNh 的受體組成進行分析。結果表明，鱖I 型IFNs 中的IFNc(類群II) 更傾向于通過CRFB2 和CRFB5 傳遞信號，而IFNh 和IFNd(類群I)則更傾向于通過CRFB1 和CRFB5 發(fā)揮抗病毒功能，雖然這三個I 型IFNs 也可以通過另一個I 型干擾素受體組合誘導ISGs 的表達[33]。相似的I 型IFNs 配受體組成也在羅非魚、草魚的研究中得到驗證[61-62,64]。近年來，通過解析大黃魚的新亞類IFNi 的晶體結構，發(fā)現(xiàn)其可以通過CRFB2 和CRFB5 進行信號傳導，且與CRFB5 的結合能力高于與CRFB2 的結合能力[36]。此外，我國學者通過解析晶體結構發(fā)現(xiàn)，草魚IFNa 可分別與CRFB1、CRFB2 和CRFB5 結合形成異二聚體復合物[64]，隨后又有學者通過特異性的抗體阻斷實驗發(fā)現(xiàn)草魚IFNa(原文中稱為IFN1)可通過CRFB1/CRFB2/CRFB5 受體激活STAT1 信號，促進血小板對細菌的吞噬作用[4]。

此外，硬骨魚類中同一類群的I 型IFNs 的不同亞類對CRFB5 的利用也存在異構體的差異。在一種古老原始淡水魚類，亞洲龍魚(Scleropages formosus)的研究中發(fā)現(xiàn)，其I 型IFNs 有四個成員：IFNa1、IFNa2、IFNb 和IFNc，其 中IFNa1 和IFNa2 屬于類群I，它們均利用CRFB1/CRFB5b 受體復合物；而IFNb 和IFNc 屬于類群II，它們則分別利用CRFB2/CRFB5a 和CRFB2/CRFB5b[65]。與復雜的I 型IFNs 組成相一致，大西洋鮭的I 型IFNs 受體CRFB1 和CRBF5 也因為全基因組復制事件出現(xiàn)了擴張，具有2 個CRFB1(CRFB1a 和CRFB1b)和4個CRFB5 (CRFB5a、CRFB5b、CRFB5c和CRFB5x)，IFNa、IFNc 和IFNb 分別利用不同的受體復合物，CRFB1a/CRFB5a/CRFB5b/CRFB5c、CRFB2/CRFB5a/CRFB5c 以 及CRFB2/CRFB5x[59]。

與哺乳動物相似，魚類I 型IFNs 的信號傳導主要依賴于保守的JAK/STAT 途徑[28]。魚類中已經(jīng)報道的JAK 激酶有四種：JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2，它們能激活轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子STAT[66]。迄今為止，魚類中已經(jīng)報道8 個STAT 分子，包括STAT1a、STAT1b、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6[67]。已有的研究證實，魚類STAT1 基因參與調(diào)控I 型IFNs 信號通路，并可被IFN-γ 誘導表達[68]。青魚(Mylopharyngodon piceus)中也存在STAT1a 和STAT1b，在病毒和IFN 誘導后兩者轉(zhuǎn)錄表達均可被上調(diào)，而STAT1b 的上調(diào)表達程度要高于STAT1a。此外，兩者可分別以同源二聚體或者異源二聚體的形式發(fā)揮抗病毒功能[69]。點帶石斑魚(Epinephelus coioides)STAT2 通過上調(diào)宿主I 型IFNs 和ISGs 的表達抵抗點帶石斑魚神經(jīng)壞死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)的感染[70]。此外，大西洋鮭中存在2 個序列相似性很高的STAT2 同源基因，即STAT2a 和STAT2b，兩者均參與了大西洋鮭IFNa 和IFN-γ 誘導的信號轉(zhuǎn)導過程[71]。

1.4 魚類I 型IFNs 的功能

與哺乳動物類似，魚類I 型IFNs 也通過誘導具有抗病毒活性的ISGs 的表達，促使宿主建立抗病毒狀態(tài)[72]?，F(xiàn)有的研究證實，魚類的一些ISGs具有直接的抗病毒作用，如Mx、Viperin、ISG15、PKR 和PKZ 等[73-76]。真核或原核重組表達的IFNa、IFNb 和IFNc 蛋白均可有效激活宿主抗病毒基因的表達，抵抗病毒感染[48,77]。用重組IFNa、IFNb或IFNc 處理的鮭TO 細胞，可抑制傳染性胰臟壞死病毒(infectious pancreatic necrosis virus,IPNV)和鮭甲病毒(salmon α virus,SAV)的復制，增強細胞對病毒感染的抵抗力[77-78]。但當病毒感染的狀態(tài)建立之后，這些重組蛋白對細胞的保護作用則會喪失[77]。有趣的是，不同的I 型IFNs 在病毒感染中的作用似乎存在差異。目前的研究結果顯示大部分魚類的IFNd 幾乎沒有抗病毒活性[33]。斑馬魚 的IFN ?2 和IFN?3(均 為IFNc 亞 群) 可 引起ISGs 的快速表達，從而保護魚類免受SVCV 和IHNV 的感染。相比之下，IFN?1(IFNa 亞群)可誘導ISGs 延遲高表達，從而對不同的病毒(SVCV、IHNV、SHRV、ISKNV 和CHIKV)感染提供有效的保護作用。然而IFN?4(IFNd 亞群)似乎沒有顯著的抗病毒作用[79-80]。此外，我國學者也研究了魚類I 型IFN 糖基化對其抗病毒功能的影響，發(fā)現(xiàn)青魚IFNb 的N-糖基化位點突變后并不影響其抗病毒功能，表明N-連接的糖基化對IFNb 抗病毒功能的實現(xiàn)不是必需的[32]。

鮭鱒魚類I 型IFNs 不同亞群之間的抗病毒作用也存在很大差異。體外實驗證實，大西洋鮭IFNa、IFNb 和IFNc 均可增強大西洋鮭腎臟細胞(Atlantic salmon kidney cells,ASK)對SAV3 感染的抵抗作用，而體內(nèi)實驗結果顯示IFNa 發(fā)揮局部的抗SAV3 感染作用，IFNb 和IFNc 則可發(fā)揮系統(tǒng)性的保護作用[81]。大西洋鮭的IFNa 和IFNc 對IPNV 和SAV 具有很強的抗病毒活性，但只有IFNa 能保護魚類細胞免受ISAV 的感染。相比而言，IFNb 在體外誘導細胞產(chǎn)生抗病毒活性的能力要弱于IFNa 和IFNc[82]。鱸形目IFNh、IFNc 和IFNd 的抗病毒活性也在多種鱸形目魚類有報道，鱖和大黃魚的IFNc 和IFNh 可引起ISGs 的強烈表達，從而保護魚類細胞免受病毒感染[33,83]。而IFNd 的抗病毒活性似乎在不同的鱸形目魚類中存在差異，如鱖的IFNd 與鯉科魚類以及鮭鱒魚類的IFNd 相似，不能誘導STAT1 磷酸化以及ISGs的上調(diào)表達，也不能保護細胞免受病毒感染[33]，而大黃魚IFNd 則可誘導ISGs 表達，具有抗病毒活性[6,35]。

除此之外，我國學者也對包括斑馬魚、鯉、草魚、青魚、金魚(C.auratus auratus)、鯽、日本鰻鱺(Anguilla japonica)、中華鱘、石斑魚等多種魚類I 型IFNs 的ISGs 誘導活性和抗病毒活性進行了研究[30-31,81,84-88]。

除抗病毒功能以外，哺乳動物中的研究顯示I 型IFNs 在抵抗細菌感染中也發(fā)揮著復雜的作用[89]。研究表明魚類的I 型IFNs 參與抗細菌感染的免疫反應。重組的草魚IFNφ1 可以通過結合革蘭氏陽性菌的肽聚糖和革蘭氏陰性菌的脂多糖，而直接殺死細菌[3]。除此之外，草魚IFNa 還可通過激活IFN-IFN 受體-JAK/STAT-C3.3-CR1 通路而發(fā)揮抗菌功能[4]。大黃魚的IFNd 和IFNh 可以被溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)和嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)混合菌顯著誘導表達[83]。斑馬魚的IFN?1 能保護魚類免受細菌感染[79]。綜上表明，魚類的I 型IFNs 可通過直接和間接的方式在抗細菌感染免疫中也發(fā)揮重要的作用。

特別值得關注的是，近幾年我國學者通過解析魚類IFN 的晶體結構來探究IFN 的功能及其與受體結合的結構基礎方面也取得了突出的成績。對草魚IFNa 晶體結構的解析，發(fā)現(xiàn)其具有典型的直螺旋F，由6 個螺旋組成，IFNa 可與CRFB1、CRFB2 和CRFB5 結合，這三種受體可形成異二聚體復合物，提示魚類I 型IFNs 雖然在結構域上與哺乳動物的保守，但是在與受體相互作用的方式方面可能存在差異[64]。對大黃魚I 型IFNi 晶體結構的解析，則首次發(fā)現(xiàn)了具有6 個半胱氨酸，形成具有三對二硫鍵獨特結構的I 型IFN[36]，進一步揭示了魚類I 型干擾素系統(tǒng)的組成與結構多樣性，為其功能研究提供了結構基礎。

2 II 型干擾素

2.1 魚類II 型IFNs 的組成及基因結構

在哺乳動物中，II 型IFNs 只有一個基因編碼，即IFN-γ，該基因含有4 個外顯子和3 個內(nèi)含子。而魚類由于全基因組復制以及IFN-γ 基因座的串聯(lián)復制，其II 型IFNs 組成出現(xiàn)擴增現(xiàn)象，有兩個成員，分別是IFN-γ 和IFN-γrel[90]。已知的硬骨魚類II 型IFNs 基因座是高度保守的，IFN-γrel 基因位于IFN-γ 基因的上游，且兩者均由4 個外顯子和3 個內(nèi)含子組成[91]。

1998 年，Chinchar 等[92]從斑點叉尾鮰中檢測到魚類的II 型IFN，IFN-γ 蛋白，發(fā)現(xiàn)其性質(zhì)類似于哺乳動物的II 型IFN。而魚類中IFN-γ 基因序列最早是在紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)中通過基因共線性的方法被克隆鑒定[93]。紅鰭東方鲀IFNγ 基因座中還包括IL-22 和IL-26 兩個基因。隨后，在斑馬魚基因組中發(fā)現(xiàn)了與IFN-γ 相鄰的另外一個基因，即IFN-γ 相關因子(IFN-γ related molecule,IFN-γrel，發(fā)表時曾被命名為IFN-γ1)。目前，IFNγ 已經(jīng)在多種魚類中被報道，包括大西洋鱈(Gadus morhua)、大西洋鮭、鯉、金魚、虹鱒、鲇(Silurus asotus)、大黃魚、鱖、牙鲆、黃鰭棘鯛(Acanthopagrus latus)等[94-105]。在一些鯉科魚類和鮭鱒魚類中，由于第四次全基因組復制事件，其IFN-γ 和IFN-γrel 都出現(xiàn)了多個拷貝[24,97-98,106-107]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，巨骨舌魚(Arapaima gigas)的II型IFNs 及其受體基因座也發(fā)生了復制，導致其具有三個II 型IFNs，分別是IFN-γ、IFN-γlike 以及IFN-γrel[108]。

2.2 魚類II 型IFNs 的受體和信號傳導

哺乳動物IFN-γ 的受體由IFN-γR1 和IFNγR2 組成，分布于幾乎所有的細胞表面，其中IFN-γR1 行使與配體結合的功能，而IFN-γR2 則負責信號傳導[8]。IFN-γ 受體胞內(nèi)部分具有保守的磷酸化位點，其中IFN-γR1 的磷酸化位點靶向JAK1，而IFN-γR2 的磷酸化位點靶向JAK2[109]。哺乳動物中，IFN-γR1 和IFN-γR2 都是以單拷貝形式存在，而在硬骨魚類中IFN-γR1 具有兩個同源基因，即IFN-γR1-1 和IFN-γR1-2，也被稱為CRFB17 和CRFB13[57,95,110-112]。硬骨魚類CRFB6則與哺乳動物IFN-γR2 同源，具有較短的胞內(nèi)區(qū)序列，含有JAK2 結合位點[28]。IFN-γR2 在四足動物和魚類中一直被認為僅有一個拷貝，但近期的研究發(fā)現(xiàn)巨骨舌魚的IFN-γR2 也存在兩個拷貝，被命名為IFN-γR2-1 和IFN-γR2-2，兩者分別被不同的IFN-γ 所利用，其中IFN-γR2-1 與IFN-γR1-1是IFN-γlike 的受體，而IFN-γR1-2 和IFN-γR2-2是IFN-γ 的受體[108]。魚類II 型IFN 受體胞內(nèi)區(qū)功能的研究結果顯示，CRFB17(IFN-γR1-1)和CRFB13(IFN-γR1-2)的胞內(nèi)區(qū)存在保守的STAT1 結合位點[95,108]。已有的研究證實，斑馬魚和草魚的IFNγrel 不與CRFB6 結合。此外，鱖和巨骨舌魚的IFN-γrel 在CRFB17 存在的條件下即可誘導下游基因表達，發(fā)揮其免疫功能[57,95,108,113]。因此，硬骨魚類IFN-γrel 可通過II 型干擾素受體CRFB17 發(fā)揮功能。但是，IFN-γrel 的信號傳導中CRFB17 是否與自身形成同源二聚或多聚體，還是與其他亞基配對形成異源二聚體，都值得進一步探索。

2.3 魚類II 型IFNs 的功能

哺乳動物的IFN-γ 通常被認為是先天性和適應性免疫的調(diào)節(jié)性細胞因子，主要對細胞內(nèi)感染產(chǎn)生免疫作用。IFN-γ 和IFN-γrel 的生物學功能已經(jīng)在一些魚類中進行了初步的研究，包括斑馬魚、金魚、鯽、大西洋鮭以及巨骨舌魚等[101,106,108,114-115]。與哺乳動物的IFN-γ 類似，虹鱒和金魚IFN-γ 可增強巨噬細胞的呼吸爆發(fā)和一氧化氮(nitric oxide,NO)產(chǎn)生，促進巨噬細胞對細菌的吞噬作用，且IFN-γ C 末端保守的正電荷氨基酸殘基基序?qū)ζ浠钚员夭豢缮賉96,116]。將草魚的IFN-γ 裝載在羧甲基殼聚糖納米顆粒上可顯著提高草魚抗細菌感染的能力[117]。此外，我國學者近期發(fā)現(xiàn)草魚IFN-γ 也參與調(diào)控殺魚愛德華氏菌(Edwardsiella piscicida)與NOD1 或自噬體的相互作用，從而增強細胞清除細菌的能力[118]。

有趣的是，與I 型IFNs 類似，魚類的IFN-γ也具有顯著的抗病毒活性。鱖IFN-γ 不僅可強烈激活Mx、IFP35 和Nmi 等ISGs 的啟動子，而且在細胞中過表達后也表現(xiàn)出強烈的抗病毒活性[95,119-121]。日本花鱸(Lateolabrax japonicus) IFN-γ也能顯著增強細胞抗石斑魚神經(jīng)壞死病毒感染的作用，同時能調(diào)控MHC II 分子的表達[122]。大西洋鮭IFN-γ 能顯著抑制IPNV 和SAV3 感染，且其抗病毒活性部分依賴于I 型IFN[101]。鯽IFN-γ 和IFN-γrel 的原核重組蛋白均具有強烈的抵抗鯽造血壞死病毒(crucian carp hematopoietic necrosis virus,CHNV)感染的作用[103,123]。

除此之外，斑馬魚IFN-γ 信號參與保守的IFN-γ-IRF1-CIITA-MHC II 信號級聯(lián)通路，從而參與魚類早期適應性免疫中的抗原提呈過程[124]。在幾種不同的魚類中，已報道IFN-γ 作為疫苗佐劑的潛在應用價值。牙鲆IFN-γ 作為疫苗佐劑可提高魚體對愛德華氏菌外膜蛋白OmpV 引起的免疫反應[103]。虹鱒IFN-γ 可增強DNA 疫苗早期特異性IgM 反應，增強CpG 對虹鱒IHNV 誘導的死亡的保護作用[125]。近年來，我國學者在硬骨魚類IFN-γ 對Th1 細胞的調(diào)控作用方面也取得了良好的成績，在羅非魚中鑒定了CD3+CD4-1+IFN-γ+的Th1 細胞，發(fā)現(xiàn)Th1 細胞及其產(chǎn)生的IFN-γ 在羅非魚巨噬細胞活化和抵抗細菌感染中的作用[126]。

然而，IFN-γrel 作為硬骨魚類特有的基因，它的抗菌和抗病毒功能與IFN-γ 存在一些差異，同時其在不同物種或細胞中也表現(xiàn)出一定程度的功能差異。暗綠鲀IFN-γ 可顯著誘導Mx 的表達，而IFN-γrel 則抑制其表達，且IFN-γrel 在細菌感染時能以更快的速度更大程度地促進宿主炎癥反應的發(fā)生，而IFN-γ 在細菌感染后期誘導宿主產(chǎn)生有效的抗菌免疫反應[127]。金魚IFN-γrel 可以誘導iNOS 表達和NO 產(chǎn)生并誘導顯著的吞噬作用[116]。相反，鯉的重組IFN-γrel 不能誘導吞噬細胞產(chǎn)生iNOS[128]。斑馬魚的IFN-γrel 可以激活胚胎中ISGs 的表達，但不能激活ISGs 在EPC 細胞中的表達[68]。許氏平鲉(Sebastes schlegelii) IFN-γ可增強巨噬細胞呼吸爆發(fā)活性和NO 反應來調(diào)控免疫反應，同時可上調(diào)促炎因子以及抗病毒基因表達[129]。

最近，對草魚IFN-γrel 晶體結構的解析，發(fā)現(xiàn)了其獨特的拓撲結構，可形成由兩對二硫鍵連接的同源二聚體，提示草魚IFN-γrel 在進化過程中可能出現(xiàn)了特有的功能，與IFN-γ 相關的細胞因子功能部分被保留，IFN-γrel 能上調(diào)促炎基因的表達，但已經(jīng)喪失了激活參與Th1 反應的功能[113]。基于上述在多種魚類中關于IFN-γrel 的研究結果，目前普遍認為魚類IFN-γrel 在功能上存在亞功能化或者起到輔助IFN-γ 功能的作用。而IFN-γrel的功能機制有待深入闡明。

3 III 型干擾素

III 型干擾素，即IFN-λ，亦曾被稱為IL-28/29。III 型干擾素及其受體在兩棲類、鳥類、哺乳類中均有報道[39,130-132]。III 型IFNs 家族包含多個成員，目前發(fā)現(xiàn)的有功能的基因拷貝有IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3 和IFN-λ4，其表達調(diào)控模式與I型IFNs 相似[133-134]。III 型IFNs 的受體屬于II 型細胞因子受體家族，包括兩條受體鏈：IFN-λR1(也稱IL28Rα 或LICR2) 和IL10RB(亦稱為IL10R2)。IFN-λR1 的胞外區(qū)由兩個串聯(lián)的纖連蛋白III 型結構域(fibronectin type III,FNIII)組成，主要與IFNλ 進行特異性結合[135]。IL10RB 則與JAK/STAT 通路蛋白結合，負責信號傳導，此外，它還是IL-10 家族細胞因子共用受體。III 型IFNs 的信號通路途徑與I 型IFNs 的很相似[11]。除了抗病毒作用外，IFN-λ 還具有抗細胞增殖、抗腫瘤，參與抗原加工提呈以及免疫調(diào)節(jié)作用等多種生物學功能[136]。誘導性表達方面，III 型IFNs 在很多類型的細胞中均可被誘導產(chǎn)生，在甲型流感病毒(influenza a virus,IAV)感染時，IFN-λ 在漿細胞樣樹突狀細胞中的產(chǎn)生量要比在單核細胞來源的樹突狀細胞中的產(chǎn)生量多[137]。

對于早期在魚類中報道的IFN，曾存在關于其究竟是與哺乳動物的I 型或III 型IFNs 中的哪種具有相同的系統(tǒng)發(fā)育關系的爭議。由于在斑馬魚等魚類中最初鑒定的IFNs 含有四個內(nèi)含子，這與哺乳動物III 型IFNs 中的情況相似，而哺乳動物的I 型IFNs 則是無內(nèi)含子的。因此，有學者認為這些魚類的I 型IFNs 是哺乳動物III 型IFNs 的同源物[25,47]。然而，后續(xù)的研究發(fā)現(xiàn)兩棲動物的I型和III 型IFNs 基因都存在這種內(nèi)含子的結構[39]，而且斑馬魚IFN 的晶體結構解析顯示出I 型IFNs典型的F 螺旋結構，而非III 型IFNs 的彎曲螺旋結構，從而證實硬骨魚類中所報道的IFN 是與哺乳動物的I 型IFNs 同源[138-139]，而非III 型IFNs[28]。2020 年，我國學者在綜述論文中描述了軟骨魚類中的III 型干擾素受體亞基[28]，英國學者從軟骨魚類米氏葉吻銀鮫中鑒定到了IFN-λ，該研究結果否定了IFN-λ 是由四足動物祖先中的I 型IFNs 復制而來的假說[9]。

4 IV 型干擾素

在2022 年以前，學術界普遍認為IFN 只有三種類型，而最近我國學者在斑馬魚24 號染色體上發(fā)現(xiàn)了與斑馬魚中已知所有IFN 基因具有較低一致性(5.5%～17.0%) 的新IFN 基因，并將其命名為IFN-υ，即IV 型IFN，且這種類型的IFN 存在于從魚類到原始哺乳動物的脊椎動物類群中[6]。脊椎動物的IFN 類型也由原來的三種類型增加到四種類型，這一發(fā)現(xiàn)刷新了我們對脊椎動物IFN系統(tǒng)復雜性的認識，為IFN 的研究開拓了全新的方向[6-7]。

與其他三種類型IFNs 不同，IFN-υ 及其受體IFN-υR1 分別位于獨特且高度保守的基因座上，且在系統(tǒng)發(fā)育樹上分別與II 型細胞因子及II 型細胞因子受體聚在一起。IFN-υ 含有多個外顯子，多序列比對結果發(fā)現(xiàn)，IFN-υ 的氨基酸序列的N端具有一段保守的基序[CXXXXX(W/L)]。通過基因過表達、體內(nèi)基因敲除和敲降實驗，發(fā)現(xiàn)IFNυ 具有誘導ISGs 表達和抗病毒功能。通過在斑馬魚體內(nèi)進行受體敲除和敲降實驗，發(fā)現(xiàn)IFN-υ 的受體復合物由CRFB12(即IFN-υR1) 和CRFB4(IL10R2)構成。IFN-υR1 受體具有保守的激活JAK-STAT 通路的位點以及相同的內(nèi)含子相位(1-2-1-0-1-0)[6-7]。Chen 等[14]以兩棲動物的模式生物為對象，對IV 型IFNs 的轉(zhuǎn)錄、信號傳導和功能方面進行了研究，發(fā)現(xiàn)IFN-υ 啟動子元件與III 型IFNs 非常相似，存在可被IRF1、IRF3、IRF7 和p65 轉(zhuǎn)錄激活的ISRE 和NF-κB 位點。并且IFN-υ通過激活ISGF3 轉(zhuǎn)錄復合物，誘導大約400 個ISGs 基因表達，其中大約268 個ISGs 基因與人類或斑馬魚的ISGs 無關，它們可能是兩棲類特有的ISGs。近期，在青魚中也鑒定到了IFN-υ，發(fā)現(xiàn)其可通過誘導ISGs 的表達并增強細胞的抗病毒作用[15]。有關IV 型IFN 的功能，是一個值得進一步探究的重要方向。

5 總結和展望

干擾素作為一類高效廣譜的非特異性免疫因子，在魚類抵抗病毒和細菌感染免疫中發(fā)揮著重要作用。近年來，我國學者在魚類干擾素系統(tǒng)的研究中做出了很大貢獻，不僅克隆鑒定了多種魚類中的干擾素基因，對其結構、功能和信號傳導進行了深入研究，而且鑒定了IV 型干擾素，豐富了脊椎動物的干擾素系統(tǒng)，所取得的研究結果對魚類抗病毒藥物的研發(fā)具有重要的理論指導意義。

雖然，在魚類IFN 系統(tǒng)的研究中取得了突出的成績，但是與哺乳動物干擾素功能的認識還存在差距。魚類IFN 誘導產(chǎn)生抗病毒作用的ISGs 的篩選以及作用機制的解析等內(nèi)容還存在很多未知。由于IV 型IFN 是一個近期才發(fā)現(xiàn)的IFN，其在不同魚類中的鑒定、信號通路以及功能等內(nèi)容也是今后研究的重點。此外，關于魚類中I 型IFNs 誘導的天然免疫反應如何有效地協(xié)調(diào)適應性免疫、I型IFNs 在這個過程中的作用機制、II 型IFNs 的表達調(diào)控及其免疫調(diào)節(jié)功能等內(nèi)容，都是魚類免疫學工作者面臨的挑戰(zhàn)?？偠灾?，魚類IFN 的研究對于魚類免疫學家來說任重而道遠，魚類IFN系統(tǒng)的深入研究將為魚類抗病毒抗細菌藥物的開發(fā)、DNA 疫苗研制和抗病育種等奠定基礎，同時對魚類IFN 作用機理的研究也將從進化角度為人類等高等脊椎動物IFN 的研究和應用提供思路。

（作者聲明本文無實際或潛在的利益沖突）