大花海棠‘比哥’離體快繁再生體系的初步建立

陳彩霞，黃敏，趙怡，曹傳取，王吉升，史志話，汪葛峰，高俊山

（1安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，合肥 230036；2合肥華綠種苗有限公司，合肥 230041）

0 引言

秋海棠屬為全球第六大屬被子植物，目前已知近2050種物種，也是世界著名的觀賞花卉[1-4]。大花海棠‘比哥’是多年生草本花卉，隸屬于秋海棠科秋海棠屬，是德國(guó)班納利(Benary)種子公司選育出來(lái)的雜交一代品種，以四季秋海棠和竹節(jié)秋海棠為主要親本的雜種后代[5-6]?！雀纭盗邪慈~色和花色可分為綠葉紅花型、銅葉紅花型、銅葉玫紅花型?！雀纭盗衅贩N結(jié)合了多種秋海棠的優(yōu)點(diǎn)，具有早花、花大、花多、花葉顏色豐富、花期長(zhǎng)、抗性強(qiáng)以及枝葉繁茂等優(yōu)點(diǎn)，曾榮獲“2008年莫斯科國(guó)際花展特別大獎(jiǎng)”。

大花海棠是理想的室內(nèi)外觀花盆栽，一般用于園林花帶、花鏡、花壇以及室內(nèi)花盆或花籃種植，美化室內(nèi)外環(huán)境，同時(shí)也是花園及綠地大面積群植的優(yōu)良品種，具有較高的觀賞和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，開(kāi)發(fā)前景廣闊[7]。目前，大花海棠僅在景觀應(yīng)用、栽培管理技術(shù)[8]以及扦插繁殖[9]等方面有報(bào)道，關(guān)于其組織培養(yǎng)快速繁殖方面尚無(wú)報(bào)道。大花海棠仍采用傳統(tǒng)的有性繁殖，雜交F1代具有較高的雜種優(yōu)勢(shì)，田間生長(zhǎng)性狀良好，如果自留種，其F2代發(fā)生性狀分離，且種子發(fā)芽率低，不能保持親本的優(yōu)良特性，所以一般不用F2代種子播種。市場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)種植的大花海棠主要依賴進(jìn)口，一粒種子價(jià)格高達(dá)0.7～0.8 元，大大增加了花卉企業(yè)的成本。鑒于此，本研究采用不同植物激素配比，篩選適合大花海棠組織培養(yǎng)快繁的培養(yǎng)基，建立大花海棠組織培養(yǎng)再生體系，旨在為大花海棠離體快速繁殖提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料選擇與外植體消毒

試驗(yàn)于2021 年8 月—2022 年10 月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。選取大花海棠品種‘比哥’系列的綠葉紅花型為試驗(yàn)材料，種植于合肥華綠種苗有限公司智能化溫室，當(dāng)植株長(zhǎng)到40～50 cm高后，選擇園藝性狀表現(xiàn)好的植株作為母本。采集剛展開(kāi)的葉片，并將其用自來(lái)水流水沖洗30 min，置于超凈工作臺(tái)，首先用70%酒精消毒10 s，再用蒸餾水沖洗2 次，接著用0.1%的升汞消毒8 min，最后用蒸餾水沖洗5 次，沿著主葉脈方向切成1 cm×1 cm 大小的葉片組織，接種到不定芽分化培養(yǎng)基上[10-12]。

1.2 主要儀器

試驗(yàn)使用的主要儀器包括FST-IV-20 普利菲爾超純水儀（上海富詩(shī)特儀器設(shè)備有限公司）、YP3002電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、HVE-50 高壓滅菌鍋（平山加工株式會(huì)社日本）、SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、PHS-3E型號(hào)PH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、金尼克超聲波清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）、接種器械滅菌器（濟(jì)南格艾特儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 培養(yǎng)基配制

1.3.1 不定芽分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA、2.4-D 和NAA，一共設(shè)計(jì)9 種(B1～B9)培養(yǎng)基配方（表1）。每種培養(yǎng)基接種60片葉片，每3片葉片接種在同一瓶培養(yǎng)基內(nèi)，共計(jì)20瓶，接種8周后觀察不定芽分化情況，分別統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)率和不定芽誘導(dǎo)率，如式(1)～(2)[13]，其中，發(fā)生不定芽的外植體數(shù)包括同時(shí)發(fā)生不定芽和愈傷組織的外植體。

表1 誘導(dǎo)不定芽分化的培養(yǎng)基配方

1.3.2 不定芽增殖培養(yǎng)基將分化培養(yǎng)基中已分化的不定芽切割下來(lái)，接種到繼代增殖培養(yǎng)基中，繼代增殖基本培養(yǎng)基為MS附加不同濃度的6-BA和NAA，共設(shè)計(jì)9種(P1～P9)培養(yǎng)基配方（表2）。每種培養(yǎng)基接種120團(tuán)芽，每6團(tuán)芽接種在一瓶培養(yǎng)基內(nèi)，共計(jì)20瓶，4周繼代1次，觀察不定芽增殖情況，并統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，如式(3)。

表2 不定芽增殖培養(yǎng)基配方

1.3.3 組培苗生根培養(yǎng)基將高度大于2.5 cm 單株組培苗切下，接種到生根培養(yǎng)基中，生根基本培養(yǎng)基為1/2MS 和MS，附加不同濃度的IBA 和NAA，共設(shè)計(jì)8種(R1～R8)培養(yǎng)基配方（表3）。每種培養(yǎng)基接種100 株苗，每5株組培苗接種在同一瓶培養(yǎng)基內(nèi)，共計(jì)20瓶，4周后觀察其生根情況，統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，如式(4)。

表3 生根培養(yǎng)基配方

1.4 培養(yǎng)條件

研究采用的培養(yǎng)基中含有25 g/L 蔗糖和7 g/L 瓊脂，pH 5.8，培養(yǎng)室溫度(26±2)℃，光照2000～3000 lx，每天光照12 h、黑暗12 h，培養(yǎng)室相對(duì)空氣濕度70%。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)由Microsoft Excel 2010 整理后采用DPS 軟件進(jìn)行方差分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花海棠愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化

如表4所示，外植體在大部分培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d均長(zhǎng)出愈傷，但是單獨(dú)使用6-BA無(wú)法獲得愈傷，只是原組織無(wú)效膨大，隨著6-BA濃度的升高，外植體死亡速度加快（圖1A～B）。當(dāng)6-BA 和2.4-D 同時(shí)使用，誘導(dǎo)出愈傷并完成分化，且2 種激素比值在10:1 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)率和芽分化率較高，分別為100%和85%以上（圖1E、H），比值偏低或偏高都影響愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化，甚至導(dǎo)致死亡（圖1C～D）。當(dāng)6-BA、2.4-D和NAA 3 種激素同時(shí)使用（B8組合），愈傷誘導(dǎo)速度最快，芽分化速度最快，效果最好，愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率分別為100%、92.4%（圖1H）。因此最佳不定芽分化的培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L 2.4-D+0.2 mg/L NAA。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽分化的影響

2.2 大花海棠不定芽增殖

如表5 所示，隨著6-BA 濃度的升高，不定芽分化速度和增殖倍數(shù)提高，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到1 mg/L時(shí)，芽生長(zhǎng)勢(shì)快，而且植株強(qiáng)壯（圖2B～D），當(dāng)6-BA 濃度達(dá)到3 mg/L時(shí)，分化芽最多，但是芽長(zhǎng)勢(shì)減弱，并出現(xiàn)玻璃化（圖2I）。提高NAA濃度易生成根，根生成后不定芽增殖速度減慢，但是不定芽也變強(qiáng)壯。當(dāng)植物激素6-BA和NAA同時(shí)使用，不定芽增殖系數(shù)為4.5～7.5，雖然P2組合不定芽增殖系數(shù)不是最高，但是不定芽長(zhǎng)勢(shì)表現(xiàn)最佳（圖2B），最佳不定芽增殖的培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA。

表5 不同激素配比對(duì)不定芽繼代增殖的影響

2.3 大花海棠組培苗生根

大花海棠組培苗培養(yǎng)4 周后組培苗長(zhǎng)勢(shì)如表6 所示。當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS、激素為IBA時(shí)，IBA濃度的升高對(duì)大花海棠生根有促進(jìn)作用，但是也對(duì)根系有毒害作用，后期抑制其發(fā)育。當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS、激素為NAA 時(shí)，NAA 濃度的升高促進(jìn)了大花海棠生根，根系多且質(zhì)量好，R8組合根數(shù)量最多，每株達(dá)10條以上（圖3）。綜上所述，最佳生根培養(yǎng)基配方為1/2 MS+1.0 mg/L NAA。

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)組培苗生根的影響

3 結(jié)論

本研究總結(jié)了一套大花海棠快繁再生體系的完整方案。以葉片為外植體，大花海棠組織培養(yǎng)再生體系最佳的不定芽分化培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2.4-D+ 0.2 mg/L NAA，培養(yǎng)6 周后分化率高達(dá)92.4%。6周后再將不定芽按團(tuán)塊方向性切割下來(lái)，繼代到增殖培養(yǎng)基上，最佳的不定芽繼代增殖培養(yǎng)基為MS+1 mg/L 6-BA+ 0.1 mg/L NAA，增殖系數(shù)為6.6。根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行增殖，每4周繼代1次，叢生芽多，而且芽粗壯，無(wú)玻璃化。將植株高度達(dá)2.5 cm 以上的單株芽接種到生根培養(yǎng)基上，最佳的生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+1.0 mg/L NAA，其根系數(shù)量可達(dá)10 條以上，而且根質(zhì)量好，當(dāng)組培生根苗根長(zhǎng)達(dá)到1.5 cm 以上時(shí)可移栽馴化。研究結(jié)果可為大花海棠的大規(guī)模培養(yǎng)、繁殖及轉(zhuǎn)基因遺傳轉(zhuǎn)化提供理論依據(jù)。

4 討論

理論上植物體細(xì)胞具有全能性，經(jīng)體外培養(yǎng)后，在激素作用下進(jìn)行重編程，通過(guò)細(xì)胞脫分化和再分化發(fā)育成為一個(gè)獨(dú)立的植株[14]。但實(shí)際應(yīng)用上，植物的品種和器官分化能力不同，選擇合適的外植體是產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)再生植株的前提。張悅圓等[15]研究表明，雙腺藤快繁再生選擇帶腋芽的莖段作為外植體優(yōu)于頂芽；李丹等[16]研究蟆葉秋海棠發(fā)現(xiàn)葉片的愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于葉柄；鄭志勇[17]則選擇莖段誘導(dǎo)中華秋海棠不定芽。本研究選擇葉片作為外植體，其分化能力強(qiáng)，且材料來(lái)源充足，采集時(shí)不傷害母本，故對(duì)于大規(guī)模工廠化組培生產(chǎn)種苗，葉片是理想的外植體材料。

增殖系數(shù)被認(rèn)為是衡量組培苗繼代培養(yǎng)的重要指標(biāo)，其受到諸多因素的影響，如培養(yǎng)基、光照、濕度、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響增殖系數(shù)最關(guān)鍵的因素。一般來(lái)說(shuō)，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比值高利于根形成，反之利于莖芽的發(fā)生。針對(duì)組培不同階段植物生長(zhǎng)的需求，對(duì)激素種類和濃度進(jìn)行篩選，是組培工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)[18-19]。國(guó)內(nèi)對(duì)于秋海棠科秋海棠屬植物研究植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)組培苗增殖系數(shù)的影響早已有相關(guān)報(bào)道，麗格海棠繼代增殖培養(yǎng)最佳植物激素配比為6-BA 2 mg/L+NAA 0～0.1 mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)5.8[20]；李丹等[16]認(rèn)為蟆葉秋海棠芽增殖激素濃度為6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖系數(shù)可達(dá)6.8。但本研究發(fā)現(xiàn)大花海棠芽增殖時(shí)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比為6-BA 2 mg/L+NAA 0.5 mg/L，增殖系數(shù)高達(dá)7.5。

合適濃度的糖和氮源有利于植物組培苗生根誘導(dǎo)。研究表明，低糖、低氨鹽培養(yǎng)基有利于多數(shù)植物試管苗生根[21-22]。蔗糖濃度不適合會(huì)引起異養(yǎng)無(wú)根苗的饑餓，或滲透壓低于或超出最適水平從而不利于生根，低鹽培養(yǎng)基可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的氮源降低到了一個(gè)有利于試管苗生根的水平[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，低鹽培養(yǎng)基1/2MS 比高鹽培養(yǎng)基MS 更適合生根培養(yǎng)，而R8培養(yǎng)基的生根效果更好，可能是因?yàn)镽8培養(yǎng)基的成分更適合大花海棠組培苗不定根的生長(zhǎng)。生長(zhǎng)素IAA、IBA和NAA常用于誘導(dǎo)生根，研究證明IAA在啟動(dòng)不定根形成時(shí)起關(guān)鍵作用[24]，而IBA促進(jìn)IAA的形成、運(yùn)輸，間接促進(jìn)生根[25]。NAA促進(jìn)組培苗儲(chǔ)存的淀粉水解成為還原糖，有利于不定根的形成[26]。生長(zhǎng)素的作用機(jī)理不同，因此對(duì)不同品種生根作用不同，本研究發(fā)現(xiàn)IBA和NAA對(duì)于生根的影響在一定濃度范圍內(nèi)，高濃度促進(jìn)生根，而NAA更適合大花海棠生根。

大花海棠組培再生體系的建立是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，從愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽分化、不定芽繼代增殖、最后到組培苗生根都是環(huán)環(huán)相扣，前一個(gè)階段生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)間接影響下一階段生長(zhǎng)。從試驗(yàn)結(jié)果看出，對(duì)于雙子葉植物大花海棠而言，單一的生長(zhǎng)素不利于誘導(dǎo)愈傷，需要添加細(xì)胞分裂素，合適的細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素比例濃度促進(jìn)脫分化及再分化[27]。從大花海棠組培苗繼代增殖可看出，此過(guò)程對(duì)激素較敏感，較低濃度的細(xì)胞分裂素6-BA 和NAA 便可滿足其生長(zhǎng)需求，濃度過(guò)高無(wú)效芽增多，而且后期玻璃化嚴(yán)重。高濃度的IBA 對(duì)大花海棠組培苗生根前期形成有促進(jìn)作用，但是后期抑制其發(fā)育，而NAA 為1.0 mg/L 時(shí)促進(jìn)植株生長(zhǎng)，根系發(fā)達(dá)。因此，組培再生是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過(guò)程，在組培生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)組培苗的長(zhǎng)勢(shì)而調(diào)節(jié)培養(yǎng)基配方。