草莓莖尖組培繁育體系優(yōu)化及SRAP遺傳穩(wěn)定性檢驗

王培，李軍見，王高奇，耿騰飛

（西安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，西安 710061）

0 引言

草莓病毒病在世界各地分布廣泛，目前已報道的可侵染草莓的病毒有20 多種，草莓受侵染后，主要表現(xiàn)為葉片失綠、畸形、生長量減少、植株矮化、產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣等現(xiàn)象，嚴重時可引起毀滅性災(zāi)害[1]。在中國危害嚴重的主要有草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)、草莓皺縮病毒(SCV)、草莓鑲脈病毒(SVBV)和草莓斑駁病毒(SMoV)4 種草莓病毒，目前尚無有效化學(xué)藥劑進行防治，最好的解決辦法是采用脫毒種苗進行無病毒栽培[2]。因此，眾多學(xué)者在草莓種苗脫毒方面進行了大量的研究，建立了以草莓莖尖組織培養(yǎng)為主體，結(jié)合熱處理脫毒、超低溫脫毒或化學(xué)試劑脫毒等方法為補充的多種脫毒體系[1,3-5]。隨著草莓組培技術(shù)的發(fā)展，生產(chǎn)中組培苗開始大量使用，但有時會出現(xiàn)種性變異、花而不實等現(xiàn)象，針對該現(xiàn)象學(xué)者們也開展了草莓離體培養(yǎng)條件下遺傳變異方面的研究。苗徐靜等[6]通過對草莓試管苗DNA甲基化的MSAP檢測發(fā)現(xiàn)，隨繼代次數(shù)的增加，組培苗DNA甲基化敏感多態(tài)性整體呈下降趨勢。代雄偉[7]研究發(fā)現(xiàn)，整個組培過程黃毛草莓甲基化水平呈現(xiàn)降低和升高交替出現(xiàn)的動態(tài)變化趨勢，這與組培過程中細胞功能分化、激素的使用以及外界環(huán)境的影響密切相關(guān)。劉振[8]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加NAA 對草莓葉片分化的再生植株的遺傳穩(wěn)定性影響較大。王國平等[9]認為，在草莓離體培養(yǎng)過程中，生長調(diào)節(jié)劑的種類和含量、繼代次數(shù)以及組織培養(yǎng)的時間都有可能會導(dǎo)致染色體數(shù)目或性狀畸變的出現(xiàn)。趙密珍[10]認為，離體培養(yǎng)過程中加入的某些植物生長調(diào)節(jié)劑可能是引起草莓的組培苗莖數(shù)、花序數(shù)增多等現(xiàn)象的原因。Haque 等[11]認為，大量變異會對生產(chǎn)產(chǎn)生不利影響，如造成果實產(chǎn)量下降和畸形果的產(chǎn)生等。因此，草莓組培過程中，關(guān)注組培苗的遺傳變異情況非常必要，但很少有對現(xiàn)有報道的草莓組培繁育體系進行遺傳穩(wěn)定性的檢驗。本研究采用草莓莖尖組織培養(yǎng)，設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑濃度梯度、調(diào)整培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方，調(diào)查莖尖分化情況、增殖苗形態(tài)、增殖系數(shù)、生根苗葉片和根系等性狀，比對組培前后植株DNA的相關(guān)序列擴增多態(tài)性(sequence- related amplified polymorphism，SRAP)標(biāo)記條帶的差異，旨在以組培苗遺傳穩(wěn)定和健壯為標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化草莓莖尖組培繁育體系，為草莓工廠化育苗提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料見表1。MS 和1/2MS 培養(yǎng)基購自阜陽曼林生物技術(shù)有限公司，瓊脂、瓊脂糖購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，蔗糖購自天津市科密歐化學(xué)試劑公司，硝酸鈣（分析純）購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司，6-BA、NAA購自Sigma公司，快捷型植物基因組DNA 提取系統(tǒng)(DP321)、2×Taq PCR Mix(KT201)購自天根生化科技有限公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。組培和SRAP遺傳穩(wěn)定性檢驗試驗于2021年11月—2022年11月在西安市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)展示中心組培及分子實驗室進行。

表1 試驗材料

1.2 試驗方法

1.2.1 組培方法

（1）取樣。在設(shè)施內(nèi)，剪取草莓植株上生長充實、小葉尚未展開且?guī)в形凑衬嗤另斞康馁橘肭o（莖粗2～4 mm、長約10～15 cm），將匍匐莖裝入塑料袋并密封，放入冰箱4℃冷藏備用。

（2）培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基以MS 或1/2MS 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，瓊脂5.2 g/L，蔗糖30 g/L，根據(jù)不同培養(yǎng)階段加入不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑以及硝酸鈣。培養(yǎng)基pH 5.8，121℃高壓蒸汽滅菌20 min。培養(yǎng)室溫度(25±2)℃，相對濕度45%～60%，光照強度2000～3000 lx，光照時長12 h/d。

（3）外植體處理。剪取草莓匍匐莖頂端頂芽，先用加入洗衣粉或洗潔精的水溶液震蕩浸泡5 min，再用自來水流水沖洗30 min。之后在超凈工作臺上，用75%酒精表面消毒0.5～1.0 min，無菌水沖洗3 遍，0.20% HgCl2浸泡8～11 min，無菌水沖洗3 遍，放入無菌水中待用。

（4）初代培養(yǎng)。設(shè)計正交試驗，在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，設(shè)置15 個處理（表2）。每個處理每個品種接種10 瓶，每瓶1 個莖尖。在體式顯微鏡下，切取0.1～0.3 mm已消毒的莖尖生長點，接種在初代培養(yǎng)基上，培養(yǎng)30 d。

（5）增殖培養(yǎng)。設(shè)計單一變量試驗，在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加不同濃度的6-BA，設(shè)置3 個處理（表3）。每個處理每個品種接種10瓶，每瓶接種個體形態(tài)大小近乎一致的無菌單芽5 個。接種單芽后，30 d 轉(zhuǎn)接1次，培養(yǎng)60 d。

表3 草莓增殖培養(yǎng)單一變量試驗處理

（6）生根培養(yǎng)。設(shè)計單一變量試驗，將增殖苗接種到MS（處理1）和1/2MS+硝酸鈣0.45 g/L（處理2）2 種培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。每個處理每個品種各10瓶，每瓶接種5 株個體形態(tài)完好、株高和大小近乎一致的無根或剪根幼苗，培養(yǎng)25～30 d。

（7）試驗調(diào)查和數(shù)據(jù)統(tǒng)計。初代培養(yǎng)中，不以品種分類，觀察所有莖尖的分化情況。增殖和生根培養(yǎng)中，每個品種隨機取10 個樣本，調(diào)查增殖形態(tài)和系數(shù)、生根植株的株高、葉片數(shù)、根長、根系條數(shù)。株高是指草莓植株中最高葉片距離植株基部的高度。統(tǒng)計增殖系數(shù)時，若出現(xiàn)芽塊，與單芽等量大小的芽塊視為1個單芽。采用Excel 2003 和SAS V8 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.2.2 遺傳穩(wěn)定性檢驗方法

（1）引物合成。設(shè)計SRAP標(biāo)記引物（表4）[12-13]。

表4 SRAP標(biāo)記引物

（2）DNA 提取及檢測。使用快捷型植物基因組DNA 提取系統(tǒng)(DP321)提取供試材料組培前、后植株的第3 片展開葉DNA，使用核酸分析儀Nano Drop2000檢測DNA濃度和純度。

（3）SRAP-PCR 檢測。采用25 μL 的擴增體系：2×Taq PCR Mix 12.5 μL；正反引物各1 μL；DNA 模板＜1000 ng；加ddH2O至25 μL。擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1 min，5 個循環(huán)；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀照相觀察。

（4）數(shù)據(jù)統(tǒng)計。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果人工讀帶，以相同遷移位置上有帶記為“1”，無帶或缺失、模糊不清條帶記為“0”，建立0/1數(shù)據(jù)矩陣。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖組培

2.1.1 初代培養(yǎng)經(jīng)過5 d初代培養(yǎng)后，莖尖生長點逐漸變綠萌動，15 d 出現(xiàn)新芽和愈傷組織的分化。在不同處理下草莓莖尖分化存在明顯差異（表5）。比較不同處理下莖尖分化情況，當(dāng)NAA濃度≥0.05 mg/L時，會出現(xiàn)愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象，也由此可推知，相比于6-BA，NAA 濃度的增加更易產(chǎn)生愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象。處理1 添加的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度最低，莖尖分化最好，30 d 內(nèi)每個莖尖平均分化出2 個健壯芽且基部沒有愈傷組織附著。適合草莓莖尖初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.01 mg/L。

表5 不同處理對草莓初代培養(yǎng)莖尖分化比例的影響（接種后30 d） %

2.1.2 增殖培養(yǎng)在不同處理下，草莓初代單芽增殖情況存在明顯差異（表6）。處理1 的2 個品種，雖然以幼苗為增殖形態(tài)的植株達到93%以上，沒有出現(xiàn)愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象，但植株生長勢弱，增殖系數(shù)較低；處理3的2個品種，雖然增殖系數(shù)適合，但出現(xiàn)大量的愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象；處理2的2個品種，增殖形態(tài)以幼苗為主，苗健壯，基部會產(chǎn)生極少量的愈傷組織，且增殖系數(shù)最大。綜合考慮植株形態(tài)、增殖系數(shù)、植株健壯程度、愈傷組織和玻璃化出現(xiàn)情況等方面，適合草莓增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 0.3 mg/L+ NAA 0.01 mg/L。

表6 不同處理對草莓增殖分化的影響

2.1.3 生根培養(yǎng)在不同處理下，2個品種的株高、葉片數(shù)、根數(shù)、根系長度存在顯著差異（表7）。其中，2個品種的株高、根數(shù)、根系長度均是處理2顯著大于處理1；但‘鳳冠’處理1的葉片數(shù)顯著大于處理2，‘天仙醉’處理2 的葉片數(shù)顯著大于處理1。綜合考慮植株株高和根系發(fā)育情況，1/2MS+硝酸鈣0.45 g/L 的培養(yǎng)基更加適合生根培養(yǎng)。同時，‘鳳冠’在2 種處理下變化相對較小，且葉片數(shù)在MS培養(yǎng)基中更大，可能與品種自身較抗鹽堿的特性有關(guān)。

表7 不同處理對草莓生根培養(yǎng)的影響

2.2 組培苗基因穩(wěn)定性檢測

前期研究已對64 對SRAP 引物組合進行篩選，其中19對引物產(chǎn)生了清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好的條帶，共擴增出72條條帶。將這19對引物對‘鳳冠’和‘天仙醉’組培前后植株進行DNA-SRAP擴增，具體擴增結(jié)果見表8?！P冠’和‘天仙醉’組培前后72 個基因位點未發(fā)生變化，以上條帶數(shù)據(jù)形成的DNA指紋沒有差異。

3 結(jié)論

（1）在保證組培植株健壯的前提下，盡量減少植物生長調(diào)節(jié)劑添加的種類和濃度，降低了高變異率愈傷組織的產(chǎn)生。與前人研究相比[14-23]，本研究培養(yǎng)基中使用的植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度有所減少，初代培養(yǎng)基中6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA濃度為0.01 mg/L，增殖培養(yǎng)基中6-BA濃度為0.3 mg/L、NAA濃度為0.01 mg/L，生根培養(yǎng)基中未添加植株生長調(diào)節(jié)劑。初代培養(yǎng)基中NAA 濃度達到及超過0.05 mg/L 將影響植株分化，會出現(xiàn)大量的愈傷組織和玻璃化現(xiàn)象；增殖培養(yǎng)基6-BA濃度低有助于分化出較多幼苗，這些結(jié)論與李曉亮等[21]的研究較一致。生根培養(yǎng)基中，不添加植株生長調(diào)節(jié)劑可以有效提高植株健壯程度，在生根的同時完成復(fù)壯；使用1/2MS 培養(yǎng)基，降低培養(yǎng)基的鹽分，能夠有效促進植株生根，結(jié)合生產(chǎn)中的表現(xiàn)，品種越不耐鹽堿，在1/2MS 培養(yǎng)基中長勢越好，但需要注意的是，1/2MS 培養(yǎng)基需額外添加硝酸鈣，否則會在生根培養(yǎng)后期出現(xiàn)新葉褐變壞死的現(xiàn)象。

（2）控制繼代次數(shù)和增殖系數(shù)，減少組培時長，避免植物生長調(diào)節(jié)劑在植株體內(nèi)過度累積，降低變異風(fēng)險。本研究將繼代次數(shù)控制在2代、增殖系數(shù)控制在5以下，有植物生長調(diào)節(jié)劑使用的時間為3個月，這些結(jié)論與胡盼盼等[24]的總結(jié)較一致。雖然使用該方法得到組培苗數(shù)量少，但組培苗質(zhì)量好，加之優(yōu)質(zhì)組培苗本身生長勢旺盛，可以通過在防蟲網(wǎng)室中進行匍匐莖快速繁殖增加種苗數(shù)量。

（3）組培苗SRAP基因穩(wěn)定性檢測，證明草莓莖尖組培擴繁體系的可靠性。前人研究表明，SRAP 分子標(biāo)記由于具有簡單、高效、高共顯性、重復(fù)性、易測序等優(yōu)點，已應(yīng)用在多種作物的種質(zhì)資源鑒定評價中[25]。劉振[8]采用SRAP分子標(biāo)記技術(shù)，檢測不同途徑獲得的草莓植株的遺傳穩(wěn)定性，檢測子代與母本的相似程度，為離體快繁和種質(zhì)資源保存提供了技術(shù)依據(jù)。本研究將考察組培苗基因穩(wěn)定性作為莖尖組培體系是否合理的一項指標(biāo)，采用SRAP分子標(biāo)記擴增得到的72 個基因位點不存在變異，證明組培苗種性穩(wěn)定。

4 討論

研究以‘鳳冠’和‘天仙醉’草莓為材料，這2 個品種在西安地區(qū)設(shè)施栽培中表現(xiàn)出早熟性好、冬季連續(xù)結(jié)果能力強、果個大等優(yōu)點，但隨著種植年限的增加，也出現(xiàn)了不同程度的品種退化和產(chǎn)量下降現(xiàn)象，經(jīng)分子檢測證實這2個品種已有病毒侵染。雖然前人已建立‘紅顏’[14-19]、‘白雪公主’[20]、‘甜查理’[14]、‘京藏香’[14]、‘鬼怒甘’[21]、‘石莓7 號’[22]、‘阿蘇的小雪’[18]、‘童子一號’[23]等品種的莖尖組培體系，但未見有這2個品種組培方面的報道。值得注意的是，不同品種組培使用的植物生長調(diào)節(jié)劑種類及數(shù)量、繼代次數(shù)和培養(yǎng)時間均不相同，即使是同一品種如‘紅顏’莖尖組培體系也不盡相同，因此在進行大規(guī)模組培生產(chǎn)前，需要針對不同品種對組培體系進行調(diào)整和優(yōu)化。

在建立草莓組培繁育體系時，要將保持品種種性、植株健壯、脫病脫毒作為標(biāo)準(zhǔn)，而不是一味追求增殖數(shù)量。在保持品種種性方面，可以使用ISSR、MSAP[6]、RAPD、SCAR[26]、SSR[27]、SRAP等技術(shù)進行基因穩(wěn)定性檢測，還可以進行田間栽培種性鑒定試驗。只有證明組培苗未發(fā)生變異后，才可使用在生產(chǎn)中。組培苗進入栽培種植環(huán)節(jié)后，雖然已脫去了病毒和病菌，但并不意味著在種植過程中不會再染病，由于組培苗相對于常規(guī)苗生長勢更旺盛，所以應(yīng)當(dāng)注意灰霉病、白粉病、蚜蟲、螨蟲等病蟲害的防治。

然而，本研究在增殖培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)占比約15%的叢芽，其基部產(chǎn)生極少量的愈傷組織，因此仍存在變異的可能，下一步研究中將進一步細分該培養(yǎng)階段植物生長調(diào)節(jié)劑的濃度梯度，以期找到更加利于植株幼苗分化且兼顧植株健壯度和增殖系數(shù)的濃度。同時，在組培體系的遺傳穩(wěn)定性檢驗中，下一步研究中將擴大基因標(biāo)記的數(shù)量，并結(jié)合組培苗田間種性鑒定，從基因和表型2個方面檢驗遺傳穩(wěn)定性。