刺槐素對小鼠骨髓巨噬細(xì)胞AIM2炎癥小體活化的抑制作用

葉勒丹·馬漢，王兆霞，吳選霞，補(bǔ)娟

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究與轉(zhuǎn)化中心，烏魯木齊 830001

炎癥小體是細(xì)胞內(nèi)的一個關(guān)鍵多聚蛋白復(fù)合體，在免疫和炎癥調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）炎癥小體是由AIM2、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）和pro-Caspase-1 組成的一種多聚蛋白復(fù)合物，其活化后可激活Caspase-1，促進(jìn)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-18 成熟與釋放，從而引起炎癥反應(yīng)［1］。AIM2炎癥小體在多種炎癥疾病中扮演著重要角色，參與了動脈粥樣硬化、皮膚病、肝病和神經(jīng)炎癥疾病等的發(fā)生發(fā)展，抑制AIM2炎癥小體活化可能是治療這些疾病的一種策略［2-3］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些對AIM2炎癥小體有抑制作用的藥物，包括RGFP966、穿心蓮內(nèi)脂、果糖—精氨酸等［4］，然而關(guān)于靶向AIM2炎癥小體的抑制劑報道較少。刺槐素是一種天然的植物黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性，參與糖尿病、哮喘、缺血性腦卒中等炎癥相關(guān)疾病的治療［5-6］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，刺槐素可以通過抑制Caspase-1 介導(dǎo)的IL-1β 表達(dá)，從而降低NLRP3、NLRC4炎癥小體活化［7］。但是刺槐素對AIM2炎癥小體活化的具體影響目前尚不清楚。2022年1月—2023 年1 月，本研究選用脂多糖（LPS）和一種雙鏈DNA（dsDNA）模擬物poly（dA：dT）共同誘導(dǎo)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞（BMDMs）中AIM2炎癥小體的激活，觀察刺槐素對AIM2炎癥小體活化的影響，為研究炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制及治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料 動物：C57BL/6 小鼠10 只，體質(zhì)量（20 ± 2）g，6～8 周齡，購自新疆醫(yī)科大學(xué)，動物許可證號：SCXK（新）2018-0002，在室溫20～25 ℃和相對濕度約55%的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一段時間。主要試劑：刺槐素、LPS 購自美國Sigma 公司，poly（dA：dT）購自美國InvivoGen 公司，Caspase-1 抗體、IL-1β抗體購自美國Abcam 公司，IL-1β、IL-18、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA 試劑盒購自杭州聯(lián)科生物有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成科技有限公司。主要儀器：熒光倒置顯微鏡購自日本Nikon公司，多功能酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)購自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.2 BMDMs 的分離和培養(yǎng) 將小鼠頸椎脫臼處死，取出股骨后，從兩端將其剪開，使用無菌注射器將細(xì)胞吹出。將細(xì)胞收集至無菌離心管中，1 500 r/min離心4 min，隨后棄掉上清液。加入紅細(xì)胞裂解液3～4 mL，將細(xì)胞重懸，靜置4 min。加入無菌PBS并混勻，1 500 r/min離心4 min。將細(xì)胞懸液加入含有10 ng/mL 粒細(xì)胞—巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GMCSF）的DMEM 培養(yǎng)基中，用無菌技術(shù)將其吹勻。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞分組及LPS、poly（dA：dT）、刺槐素處理當(dāng)BMDMs 融合至約80%時，分為對照組、LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組。對照組將BMDMs繼續(xù)在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h；LPS組將BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h；LPS+ poly（dA：dT）組將BMDMs在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，再加入poly（dA：dT） 10 μmol/L 作用0.5 h；LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組將BMDMs 在加入含50 ng/mL LPS 的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 h，然后加入刺槐素10 μmol/L 作用0.5 h，最后加入poly（dA：dT） 10 μmol/L作用0.5 h。

1.4 細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白檢測 采用Western blotting法。細(xì)胞裂解液總蛋白提?。菏占M細(xì)胞至離心管中，加入含蛋白酶抑制劑和廣譜磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液100 μL，充分混勻，4 ℃放置60 min；4 ℃條件下12 000 r/min 離心15 min，收集上清液。細(xì)胞上清液蛋白提?。菏占M細(xì)胞樣本至離心管中，離心后取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入相同體積的甲醇和1/4體積的氯仿渦旋混勻，4 ℃條件下12 000 r/min離心5 min；將上層液體去掉，再加入等體積甲醇，混勻后4 ℃條件下12 000 r/min 離心5 min，盡可能棄盡上清，55 ℃金屬浴干燥5 min。使用BCA 法對上述收集的液體進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，取30 μg 蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。轉(zhuǎn)膜完成后，用5%脫脂奶粉封閉2 h。加入IL-1β、Caspase-1 和內(nèi)參β-actin（稀釋比例分別為1∶ 500、1∶ 1 000、1∶ 1 000）一抗，4 ℃搖床孵育過夜；加入二抗（稀釋比例為1∶ 5 000），搖床孵育1 h。使用三羥甲基氨基甲烷緩沖液（TBST）洗滌膜10 min，更換洗滌液，重復(fù)此步驟3 次。加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑（ECL），進(jìn)行避光顯色和顯影。采用Image J 軟件分析條帶灰度值，計算目的蛋白相對表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18、TNF-α 蛋白檢測采用ELISA法。各組分組處理24 h后收集細(xì)胞上清液，加入到ELISA 板的適當(dāng)孔中，根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作。使用試劑盒提供的特異性抗體對IL-1β、IL-18、TNF-α進(jìn)行捕獲，將其固定在板上。加入適當(dāng)?shù)拿笜?biāo)記二抗，添加底物，觀察顏色反應(yīng)，并根據(jù)反應(yīng)的光密度測定板上的吸光度。使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定IL-1β、IL-18 和TNF-α 水平，計算每個樣品的目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度。

1.6 細(xì)胞毒性檢測 采用LDH 法。取各組細(xì)胞上清液，按照LDH 試劑盒說明書操作，使用450 nm波長進(jìn)行測定，參照公式（OSID 碼圖1）計算細(xì)胞上清液LDH濃度，以此表示細(xì)胞毒性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件。計量資料采用S-W 正態(tài)性檢驗(yàn)，呈正態(tài)分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)或Games-Howell檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析；非正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 和上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量比較 各組細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）。與對照組、LPS 組比較，LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量均升高，且LPS+poly（dA：dT）組升高更明顯（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較（）

表1 各組細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β和上清液Caspase-1、IL-1β蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+poly（dA：dT）組比較，△P＜0.05。

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2.2 各組細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18 和TNF-α 蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)比較（pg/mL，）

表2 各組細(xì)胞上清液IL-1β、IL-18和TNF-α蛋白表達(dá)比較（pg/mL，）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與LPS組比較，#P＜0.05；與LPS+poly（dA：dT）組比較，△P＜0.05。

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2.3 各組細(xì)胞上清液LDH 水平比較 對照組、LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組細(xì)胞上清液LDH 水平分別為（223.189 ±13.283）、（913.839 ± 16.213）、（1 598.824 ±270.241）、（1 496.732 ± 75.670）U/L；與對照組比較，LPS 組、LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組細(xì)胞上清液LDH 水平均升高，且LPS+poly（dA：dT）組和LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組升高更明顯（P均＜0.05）。

3 討論

炎癥小體是先天性免疫系統(tǒng)的一部分，負(fù)責(zé)感知受損細(xì)胞中來自病原體的危險信號，這對于保護(hù)宿主免受環(huán)境威脅至關(guān)重要。AIM2 是一種能識別細(xì)胞質(zhì)內(nèi)DNA 的傳感器蛋白，由N 端PYD 域和C 端HIN 域組成，當(dāng)dsDNA 與HIN 結(jié)合時，可通過PYD結(jié)合ASC募集pro-Caspase-1形成AIM2炎癥小體，產(chǎn)生活化后的Caspase-1 可導(dǎo)致炎癥因子IL-1β、IL-18的成熟與釋放，二者是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，參與引起炎癥反應(yīng)［8］。此外，活化后的Caspase-1 還可通過裂解焦孔素D（GSDMD），直接介導(dǎo)細(xì)胞焦亡［9］。因此，Caspase-1 和IL-1β 通常是AIM2 炎癥小體活化的直接標(biāo)志。

近年來，AIM2炎癥小體在疾病調(diào)控中的作用備受關(guān)注，而尋找能夠抑制AIM2 炎癥小體的藥物具有重要的臨床治療意義。目前，許多抑制AIM2 炎癥小體的藥物主要通過研究與AIM2 相關(guān)的疾病進(jìn)行探索，如RGFP966 抑制劑可通過下調(diào)AIM2 炎癥小體表達(dá)來減輕缺血性腦損傷［10］；穿心蓮內(nèi)酯通過抑制AIM2 炎癥小體激活和細(xì)胞焦亡，從而改善放射性肺損傷［11］；槲皮素通過下調(diào)AIM2 表達(dá)而抑制JAK2/STAT1 通路，從而減輕炎癥性皮膚病引發(fā)的炎癥反應(yīng)［12］。在感染DNA 病毒或轉(zhuǎn)染DNA 類似物的情況下，細(xì)胞質(zhì)中的dsDNA 能夠被AIM2 直接識別［4］。DNA 病毒（小鼠巨細(xì)胞病毒、痘苗病毒、人乳頭瘤病毒等）或某些細(xì)菌（科斯特菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等）均能激活A(yù)IM2 炎癥小體［13］。刺槐素作為一種天然化合物，已有研究證明其具有抗炎和抗氧化等多種生物活性［5，14］，但是其對AIM2 炎癥小體的影響鮮見報道。

研究顯示，LPS 預(yù)刺激巨噬細(xì)胞并轉(zhuǎn)染poly（dA：dT）可特異性活化AIM2 炎癥小體，是一種用于篩選靶向AIM2 炎癥小體抑制劑的經(jīng)典方法［15-16］。在炎癥小體激活途徑中，炎癥小體成分的轉(zhuǎn)錄上調(diào)和pro-Caspase-1 的激活被認(rèn)為是導(dǎo)致pro-IL-1β 成熟的上游信號。為了研究刺槐素對AIM2 炎癥小體活化的影響，本研究檢測了細(xì)胞裂解液中的pro-Caspase-1、pro-IL-1β 表達(dá)變化，以及上清液中成熟的Caspase-1 和IL-1β 表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組、LPS組比較，LPS+poly（dA：dT）組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量均升高，這表明LPS 和poly（dA：dT）共同刺激可以激活小鼠BMDMs 的AIM2 炎癥小體，導(dǎo)致Caspase-1 和IL-1β釋放，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)，與已有的研究結(jié)果一致［17-18］。本研究結(jié)果顯示，各組細(xì)胞裂解液pro-Caspase-1、pro-IL-1β 蛋白相對表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與LPS+poly（dA：dT）組比較，LPS+poly（dA：dT）+刺槐素組上清液Caspase-1、IL-1β 蛋白相對表達(dá)量均降低，說明刺槐素對AIM2炎癥小體的抑制作用并非通過改變炎癥小體成分轉(zhuǎn)錄水平，而是通過抑制Caspase-1 的活化來實(shí)現(xiàn)的，該結(jié)果與既往研究結(jié)果類似［19］。

此外，本研究進(jìn)一步通過ELISA法檢測上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表達(dá)，結(jié)果顯示poly（dA：dT）誘導(dǎo)后BMDMs中這三種炎癥因子表達(dá)均升高，經(jīng)刺槐素處理后只有IL-1β 表達(dá)降低，IL-18 和TNF-α 表達(dá)無明顯改變。炎癥因子IL-1β、IL-18 和TNF-α的生成不僅可以由AIM2炎癥小體激活，還存在其他生成途徑，這表明刺槐素可能并非通過AIM2途徑調(diào)控IL-18和TNF-α的表達(dá)。細(xì)胞毒性的檢測是為了解不同處理條件對細(xì)胞的影響，LDH是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的酶，只有當(dāng)細(xì)胞膜受損時LDH才會被釋放至細(xì)胞外。本研究結(jié)果顯示，poly（dA：dT）誘導(dǎo)后BMDMs上清液LDH濃度升高，經(jīng)刺槐素處理后LDH無明顯變化。前期本課題組發(fā)現(xiàn)，刺槐素可抑制NLRP3 炎癥小體活化后LDH 的釋放，但本研究顯示刺槐素對AIM2炎癥小體活化后LDH的釋放沒有顯著影響，具體原因還需要深入研究。

綜上所述，刺槐素對LPS 與poly（dA：dT）共誘導(dǎo)小鼠BMDMs 的AIM2 炎癥小體活化具有抑制作用，能夠減少細(xì)胞中Caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)，從而減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)為刺槐素作為潛在的炎癥抑制劑提供了有力支持，為其在AIM2 炎癥小體相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。但是，刺槐素如何抑制AIM2 炎癥小體的活化及其具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，這將成為我們未來研究的重點(diǎn)。