大花地不容塊根生物堿成分的研究

孫國峰, 陳封政, 田 沖, 成 英, 李書華

( 樂山師范學(xué)院 新能源材料與化學(xué)學(xué)院/樂山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心, 四川 樂山 614000 )

大花地不容(Stephaniamacrantha)是1988年報(bào)道的一個(gè)新種(羅獻(xiàn)瑞,1988),該種歸屬于千金藤屬山烏龜亞屬山烏龜組,主要分布于云南,由于其花形特殊,在云南漾濞縣的部分家庭將大花地不容作為觀賞植物栽培(謝道濤,2014)?！吨袊参镏尽酚涊d防己科千金藤屬植物約60種,分布于亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū),少數(shù)產(chǎn)于大洋洲,分布于中國的千金藤屬植物有39個(gè)種,分別屬于3個(gè)亞屬(千金藤亞屬、粉防己亞屬和山烏龜亞屬),其中山烏龜亞屬植物具有塊根,生物堿含量較高,活性強(qiáng)(朱兆儀等,1983)。山烏龜亞屬植物中廣西地不容、云南地不容、小葉地不容研究比較充分,尤其對(duì)廣西地不容的研究顯得深入和全面,涉及其生物堿成分(閔知大和鐘守明,1980;成桂仁等,1981;黃秋潔等,2018),內(nèi)生真菌(卿朕等,2016;周秋艷等,2016;劉曉瑩等,2017;湯夏安等,2019)和種子資源(覃艷,2006)等。大花地不容的基礎(chǔ)研究非常薄弱,僅20世紀(jì)90年代有一篇關(guān)于生物堿成分的研究報(bào)道(陳嬿等,1994)。為了進(jìn)一步詳細(xì)研究該植物塊根的化學(xué)成分及活性,我們對(duì)大花地不容塊根的生物堿成分及主要成分的生物活性進(jìn)行了研究,共得到了11個(gè)化合物,分別為青藤堿(1)、青風(fēng)藤堿(2)、斯帝酚靈堿(3)、瑞枯靈(4)、異紫堇定(5)、紫堇單酚堿(6)、巴婆堿(7)、sukhodianine(8)、荷包牡丹堿(9)、7-氧代克班寧(10)和巴馬汀(11),化合物1-11的結(jié)構(gòu)見圖1。其中,化合物2、3、4、7、8、9、10系首次從大花地不容中分離得到。

1 儀器與材料

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE212BW-B(日本雅瑪拓);冷卻水循環(huán)裝置CF810C(日本雅瑪拓);隔膜真空泵LVS302Z(美國威爾奇);制備液相色譜SACID 100 mm (成都格萊精密儀器有限公司);Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

大花地不容塊根,2019年3月購自安國冷背藥材有限公司,經(jīng)樂山師范學(xué)院成英副教授鑒定為防己科千金藤屬植物大花地不容(Stephaniamacrantha)的塊根,樣本保存于樂山師范學(xué)院樂山特色農(nóng)產(chǎn)品藥用成分研發(fā)工程中心(20190301)。

2 提取與分離

2.1 總生物堿的提取

取大花地不容塊根3 kg,首先經(jīng)60 ℃烘干后粉碎,過10目篩,將大花地不容塊根小顆粒倒入100 L提取罐中,然后加入3.65×10-3g·mL-1的鹽酸溶液30 L,攪拌6 h,轉(zhuǎn)速20 r·min-1,放出提取液,最后再向提取罐中加入3.65×10-3g·mL-1的鹽酸溶液20 L,攪拌3 h,轉(zhuǎn)速20 r·min-1,放出提取液。合并2次提取液,首先用氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)提取液的pH至9左右,然后用30 L二氯甲烷萃取堿性提取液2次,合并2次二氯甲烷萃取液,接著用20 L蒸餾水洗滌二氯甲烷萃取液,最后50 ℃減壓濃縮二氯甲烷后得到大花地不容塊根的總生物堿95 g。

2.2 總生物堿的分離純化

2.2.1 總生物堿的硅膠柱層析分離 稱取200目層析硅膠800 g,以二氯甲烷濕法裝柱。稱取總生物堿80 g,拌樣上樣。以不同比例的二氯甲烷∶甲醇(50∶1→5∶1)為洗脫液,收集洗脫液,經(jīng)薄層層析點(diǎn)板檢測(cè)后,分成了8個(gè)部分。

2.2.2 生物堿的制備液相分離純化 將上述經(jīng)過硅膠柱層析分段得到的8個(gè)部分的生物堿,通過制備液相色譜分離純化。制備方法:將樣品用酸水溶解后吸入制備柱,然后以乙腈(20%)-水(80%)梯度洗脫,逐漸增加乙腈的比例,直至乙腈比例為80%。檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm。制備柱:C18,50 mm × 450 mm,5 μm。

按照峰收集洗脫液, 各洗脫液首先用氨水調(diào)至中性后濃縮除去乙腈,然后用氨水堿化后,最后用二氯甲烷萃取。

圖 1 化合物1-11的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of compounds 1-11

按照上述方法,經(jīng)過多次制備液相制備純化后,按照出峰順序依次得到11個(gè)化合物,分別為化合物1(3 100 mg)、2(850 mg)、3(81 mg)、4(296 mg)、5(126 mg)、6(109 mg)、7(225 mg)、8(76 mg)、9(168 mg)、10(527 mg)、11(237 mg)。

3 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色無定形粉末,碘化鉍鉀顯橘紅色,推斷該化合物可能為生物堿。ESI-MSm/z: 330 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 6.63 (1H, d,J=8 Hz, H-2), 6.54 (1H, d,J=8 Hz, H-1), 6.07 (1H, brs, HO-4), 5.47 (1H, s, H-8), 4.35 (1H, d, H-5e), 3.80 (3H, s, OCH3-3), 3.49 (3H, s, OCH3-7), 3.17 (1H, m, H-9), 2.43 (3H, s, NCH3-17)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 194.1 (C-6), 152.3 (C-7), 145.0 (C-3), 144.7 (C-4), 130.4 (C-11), 122.6 (C-12), 118.2 (C-1), 115.1 (C-8), 108.9 (C-2), 56.7 (C-9), 56.1 (OCH3-3), 54.8 (OCH3-7), 49.2 (C-5), 47.1 (C-16), 45.9 (C-14), 42.8 (-NCH3), 40.5 (C-13), 36.0 (C-15), 24.2 (C-10)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(曾立和尹文清,2010)報(bào)道的青藤堿(sinomenine)基本一致,故鑒定該化合物為青藤堿。

化合物2白色無定形粉末,碘化鉍鉀顯橘紅色,推斷該化合物可能為生物堿。ESI-MSm/z: 328 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 7.55 (1H, s, H-5), 6.75 (1H, d,J=8 Hz, H-2), 6.66 (1H, d,J=8 Hz, H-1), 6.33 (1H, s, H-8), 3.89 (3H, s, OCH3-3), 3.75 (3H, s, OCH3-6), 3.69 (1H, d,J=4 Hz, H-9), 3.33 (1H, d,J=16 Hz, H-10b), 2.98 (1H, m, H-10a), 2.60 (1H, m, H-16b), 2.47 (1H, m, H-16a), 2.45 (3H, s, NCH3), 2.37 (1H, m, H-15b), 1.75 (1H, m, H-15a)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 181.5 (C-7), 161.7 (C-14), 151.0 (C-6), 145.4 (C-3), 143.3 (C-4), 129.8 (C-11), 124.0 (C-12), 120.5 (C-5), 118.8 (C-1), 109.5 (C-2), 61.0 (C-9), 56.3 (OCH3-3), 54.9 (OCH3-6), 47.0 (C-16), 43.7 (C-13), 41.7 (-NCH3), 37.8 (C-15), 32.6 (C-10)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(沈曉靜等,2016)報(bào)道的青風(fēng)藤堿(sinoactine)基本一致,故鑒定該化合物為青風(fēng)藤堿。

化合物3褐色無定形粉末,碘化鉍鉀顯橘紅色,推斷該化合物可能為生物堿。ESI-MSm/z: 298 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 7.03 (1H, d,J=8 Hz, H-12), 6.89 (1H, d,J=8 Hz, H-8), 6.64 (1H, s, H-3), 6.41 (1H, d,J=8 Hz, H-9), 6.29 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 4.29 (1H, m, H-6a), 3.81 (3H, s, OCH3-1), 3.60 (3H, s, OCH3-2), 3.45 (1H, m, H-5), 3.15 (1H, m, H-5), 2.77 (2H, m, H-4), 2.40 (1H, m, H-7), 2.30 (1H, m, H-7)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 186.2 (C-10), 153.5 (C-1), 150.0 (C-8, 12), 144.3 (C-2), 135.5 (C-7b), 132.5 (C-3b), 128.2 (C-9, 11), 127.4 (C-3a), 112.2 (C-3), 61.0 (OCH3-2), 57.7 (C-6a), 56.3 (OCH3-1), 51.2 (C-7a), 48.2 (C-5), 45.0 (C-4), 26.3 (C-7)。上述核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(龔運(yùn)淮和丁立生,2006;張茂生,2009)報(bào)道的斯帝酚靈堿(stepharine)基本一致,故鑒定該化合物為斯帝酚靈堿。

化合物4淺黃色無定形粉末,ESI-MSm/z: 330 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 6.77 (1H, s, H-2′), 6.73 (1H, d,J=8 Hz, H-5′), 6.59 (1H, d,J=8 Hz, H-6′), 6.54 (1H, s, H-5), 6.37 (1H, s, H-8), 3.85 (6H, s, OCH3-6, OCH3-4′), 3.71 (1H, m, H-1), 3.19 (1H, m, H-3a), 3.05 (1H, m, H-9a), 2.80 (3H, m, H-3b, H-9b, H-4a,), 2.60 (1H, m, H-4b), 2.40 (3H, s, NCH3)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 145.3 (C-6), 145.2 (C-4′), 145.0 (C-7), 143.4 (C-3′), 133.0 (C-8a), 130.1 (C-1′), 125.0 (C-4a), 120.9 (C-6′), 115.6 (C-2′), 113.7 (C-5′), 110.6 (C-8), 110.4 (C-5), 64.5 (C-1), 55.9 (OCH3-6), 55.8 (OCH3-4′), 46.6 (C-3), 42.2 (-NCH3), 40.9 (C-9), 24.8 (C-4)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(王恩軍等,2008)報(bào)道的瑞枯靈(reticuline)基本一致,故鑒定該化合物為瑞枯靈。

化合物5淺黃色無定形粉末,ESI-MSm/z: 342 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 8.84 (1H, s, 11-OH), 6.86 (1H, d,J=8 Hz, H-8), 6.84 (1H, d,J=8 Hz, H-9), 6.70 (1H, s, H-3), 3.92 (3H, s, OCH3-10), 3.91 (3H, s, 2-OCH3), 3.71 (3H, s, OCH3-1), 3.18 (1H, m, H-6a), 3.05 (2H, m, H-4), 2.88 (1H, d,J=16Hz, H-7a), 2.71 (1H, d,J=16Hz, H-7b), 2.54 (3H, s, NCH3), 2.45 (2H, m, H-5)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 151.3 (C-2), 149.5 (C-10), 144.0 (C-11), 142.2 (C-1), 130.2 (C-3a), 130.0 (C-7a), 129.2 (C-11b), 126.0 (C-3b), 120.2 (C-11a), 119.0 (C-8), 111.1 (C-3), 110.0 (C-9), 62.9 (C-6a), 62.1 (OCH3-1), 56.2 (OCH3-10), 55.9 (OCH3-2), 52.7 (C-5), 43.9 (-NCH3), 35.9 (C-7), 29.3 (C-4)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(張茂生,2009)報(bào)道的異紫堇定(isocorydine)基本一致,故鑒定該化合物為異紫堇定。

化合物6類白色無定形粉末,ESI-MSm/z: 342 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 6.80 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 6.76 (1H, d,J=8 Hz, H-12), 6.73 (1H, s, H-1), 6.62 (1H, s, H-1), 4.22 (1H, d,J=16 Hz, H-8a), 3.89 (3H, s, OCH3-2), 3.87 (3H, s, OCH3-3), 3.81 (3H, s, OCH3-9), 3.59 (1H, m, H-13a), 3.57 (1H, m, H-8b), 3.24 (1H, m, H-6a), 3.20 (1H, m, H-13), 3.16 (1H, m, H-5a), 2.83 (1H, m, H-13), 2.69 (1H, m, H-5b), 2.66 (1H, m, H-6b)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 147.5 (C-3), 147.4 (C-2), 146.6 (C-10), 143.3 (C-9), 129.6 (C-4b), 127.9 (C-12a), 127.2 (C-4a), 126.6 (C-8a), 124.9 (C-12), 114.4 (C-11), 111.3 (C-4), 108.5 (C-1), 60.6 (OCH3-9), 59.5 (C-13a), 56.1 (OCH3-2), 55.9 (OCH3-3), 53.9 (C-8), 51.6 (C-6), 36.2 (C-13), 29.0 (C-5)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(楊德蘭,2010)報(bào)道的紫堇單酚堿(corydalmine)基本一致,故鑒定該化合物為紫堇單酚堿。

化合物7棕色無定形粉末,ESI-MSm/z: 268 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 8.29 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 7.21～7.33 (3H, m, H-8, 9, 10), 6.71 (1H, s, H-3), 3.80 (1H, dd,J=16, 4Hz, H-8), 3.59 (3H, s, OCH3-1), 3.35 (1H, m, H-6a), 2.99 (2H, m, H-5), 2.77 (2H, m, H-4), 2.70 (2H, m, H-7)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 148.2 (C-2), 142.8 (C-1), 136.2 (C-7a), 132.0 (C-11a), 130.0 (C-3b), 128.7 (C-8), 128.0 (C-9), 127.6 (C-10), 127.3 (C-3a), 127.2 (C-11), 125.3 (C-11b), 114.6 (C-3), 60.4 (OCH3-1), 53.6 (C-6a), 43.3 (C-5), 37.4 (C-7), 29.0 (C-4)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(龔運(yùn)淮和丁立生,2006;鐘圣海等,2016)報(bào)道的巴婆堿(asimilobine)基本一致,故鑒定該化合物為巴婆堿。

化合物8類白色無定形粉末,ESI-MSm/z: 355 [M]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 7.91 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 7.08 (1H, d,J=8 Hz, H-10), 6.57 (1H, s, H-3), 6.08 (1H, s, -OCH2-), 5.95 (1H, s, -OCH2-), 5.43 (1H, brs, H-7), 3.92 (6H, s, OCH3-8, OCH3-9), 3.21 (1H, m, H-6a), 3.16 (2H, m, H-5), 2.71 (1H, m, H-4), 2.70 (3H, s, NCH3)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 153.3 (C-8), 148.4 (C-9), 147.6 (C-2), 143.5 (C-1), 130.8 (C-7a), 129.4 (C-3a), 124.7 (C-10), 124.6 (C-3b), 122.7 (C-11a), 116.7 (C-11b), 113.6 (C-11), 107.8 (C-3), 101.9 (-OCH2-),67.7 (C-7), 61.8 (OCH3-8), 60.3 (OCH3-9), 56.1 (C-6a), 54.4 (C-5), 43.3 (-NCH3), 29.3 (C-4)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(石曉麗,2013)報(bào)道的sukhodianine基本一致,故鑒定該化合物為sukhodianine。

化合物9類白色無定形粉末,ESI-MSm/z: 340 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 7.67 (1H, s, H-11), 6.78 (1H, s, H-8), 6.52 (1H, s, H-3), 6.08 (1H, s, -OCH2-), 5.93(1H, s, -OCH2-), 3.92 (6H, s, OCH3-9, OCH3-10), 3.14 (1H, m, H-6a), 3.07 (2H, m, H-5), 2.65 (2H, m, H-4), 2.61 (1H, m,H-7), 2.60 (3H, s, NCH3), 2.52 (1H, m, H-7)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 148.2 (C-10), 147.7 (C-9), 146.6 (C-2), 141.8 (C-1), 128.4 (C-7a), 126.7 (C-3a), 126.4 (C-3b), 123.6 (C-11a), 116.6 (C-11b), 111.3 (C-11), 110.5 (C-8), 106.8 (C-3), 100.6 (-OCH2-),62.4 (C-6a), 56.1 (OCH3-9), 55.9 (OCH3-10), 53.6 (C-5), 43.9 (-NCH3), 34.2 (C-7), 29.2 (C-4)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(彭扶云,2014)報(bào)道的荷包牡丹堿(dicentrine)基本一致,故鑒定該化合物為荷包牡丹堿。

化合物10類白色無定形粉末,ESI-MSm/z: 335 [M]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 8.78 (1H, d,J=4 Hz, H-5), 8.27 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 7.63 (1H, d,J=4 Hz, H-4), 7.14 (1H, d,J=8 Hz, H-10), 7.01 (1H, s, H-3), 6.31 (2H, s, -OCH2-), 4.01 (3H, s, OCH3-8), 3.95 (3H, s, OCH3-9)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 181.7 (C-7), 153.6 (C-1), 151.7 (C-2), 151.2 (C-6a), 146.4 (C-8), 146.2 (C-9), 144.6 (C-5), 135.3 (C-7a), 126.1 (C-3a), 125.6 (C-11a), 123.8 (C-11), 123.5 (C-10), 120.0 (C-11b), 117.0 (C-4), 108.4 (C-11b), 102.2 (C-3), 102.0 (-OCH2-), 62.5 (OCH3-8), 56.2 (OCH3-9)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(彭扶云,2014)報(bào)道的7-氧代克班寧(7-oxocrebanine)基本一致,故鑒定該化合物為7-氧代克班寧。

化合物11淺黃色無定形粉末,ESI-MSm/z: 353 [M+H]+。1H-NMR (CDCl3, 400 MHz)δ: 9.79 (1H, s, H-8), 8.82 (1H, s, H-13), 8.14 (1H, d,J=8 Hz, H-11), 8.03 (1H, d,J=8 Hz, H-12), 7.68 (1H, s, H-1), 7.07 (1H, s, H-4), 4.96 (2H, m, H-6), 4.23 (3H, s, OCH3-10), 4.13 (3H, s, OCH3-9), 4.01 (3H, s, OCH3-2), 3.96 (3H, s, OCH3-3), 3.31 (2H, m, H-5)。13C-NMR (CDCl3, 100 MHz)δ: 153.6 (C-9), 151.6 (C-3), 150.6 (C-2), 146.1 (C-8), 145.5 (C-10), 139.5 (C-13a), 135.0 (C-12a), 130.0 (C-4a), 127.8 (C-12), 124.1 (C-11), 123.0 (C-8a), 121.0 (C-4b), 111.9 (C-4), 109.6 (C-1), 62.2 (OCH3-9), 57.3 (OCH3-3), 57.0 (C-6), 56.7 (OCH3-2), 56.4 (OCH3-10), 27.2 (C-5)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)(王恩軍等,2008)報(bào)道的巴馬汀(palmatine)基本一致,故鑒定該化合物為巴馬汀。

4 活性測(cè)試

對(duì)大花地不容塊根的總生物堿和主要成分青藤堿進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測(cè)試。參照文獻(xiàn)(李書華等,2021)采用 CCK-8測(cè)定法檢測(cè)。大花地不容塊根的總生物堿對(duì)肺癌細(xì)胞A549的IC50值為7.5×10-4g·mL-1,青藤堿對(duì)肺癌細(xì)胞A549的IC50值為6.59×10-9g·mL-1,上述結(jié)果表明大花地不容塊根總生物堿和青藤堿對(duì)肺癌細(xì)胞A549均有一定的細(xì)胞毒活性。

5 討論與結(jié)論

山烏龜亞屬植物中的云南地不容的主要生物堿成分為青風(fēng)藤堿,其次為克班寧,分別屬于嗎啡烷型和阿樸啡型生物堿(彭扶云,2014);廣西地不容的主要生物堿成分為L(zhǎng)-四氫巴馬汀堿,屬于原小檗堿型生物堿(閔知大和鐘守明,1980);小葉地不容的主要生物堿成分為青風(fēng)藤堿(左愛學(xué)等,2013)和L-四氫巴馬汀堿(何嘉泳等,2017)。本研究中大花地不容的主要生物堿成分為青藤堿,屬于嗎啡烷型生物堿。從植物化學(xué)分類學(xué)上看,分布于中國的千金藤屬山烏龜亞屬山烏龜組的幾種植物的主要生物堿均有差異,分別屬于嗎啡烷型、阿樸啡型和原小檗堿型生物堿,這與楊鶴鳴和陳嬿(1994)的研究結(jié)果一致。

本文對(duì)大花地不容塊根的生物堿成分進(jìn)行了詳細(xì)的研究,鑒定了11個(gè)生物堿,均屬于異喹啉類生物堿,其中化合物1是該植物塊根的主要生物堿類成分,化合物1和化合物2屬于嗎啡烷型生物堿,化合物3屬于原阿樸啡型生物堿,化合物4屬于芐基四氫異喹啉類生物堿,化合物5、7、8、9、10屬于阿樸啡型生物堿,化合物6、11屬于原小檗堿型生物堿?；衔?、3、4、7、8、9、10系首次從大花地不容中分離得到。此外對(duì)大花地不容塊根的總生物堿和主要成分青藤堿進(jìn)行了體外細(xì)胞測(cè)試,結(jié)果顯示總生物堿和青藤堿對(duì)肺癌細(xì)胞A549均具有一定的細(xì)胞毒活性。