昆明裂腹魚(yú)FGF 基因的測(cè)序驗(yàn)證與進(jìn)化分析*

王小會(huì)，苗貴東，彭紫威，龍曉武，王封瑞，劉顯威

（1.黔西南州生物遺傳資源挖掘與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 興義 562400；2.興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400）

昆明裂腹魚(yú)（Schizothorax grahami） 是鯉科裂腹魚(yú)屬的一種魚(yú)類(lèi)。迄今全球共發(fā)現(xiàn)裂腹魚(yú)類(lèi)15 屬100 余種，我國(guó)有11 屬76 種。昆明裂腹魚(yú)僅分布于西南地區(qū)，在貴州省主要分布于南、北盤(pán)江的上游支流、烏江上游以及金沙江下游干支流，現(xiàn)已被列為貴州省重點(diǎn)保護(hù)魚(yú)類(lèi)之一。昆明裂腹魚(yú)野生種群資源極少，人工繁育及養(yǎng)殖成為種群資源維持的重要手段[1]。

FGF 基因，最早發(fā)現(xiàn)它能夠刺激卵巢成纖維細(xì)胞的分裂增殖，所以又稱(chēng)為成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子[2]。研究表明FGF 基因還參與其他的生物學(xué)過(guò)程，如生長(zhǎng)、發(fā)育、性別決定和分化、增值、遷移，并且對(duì)個(gè)體的胚胎發(fā)育、卵泡發(fā)育、生殖細(xì)胞的成熟、能量代謝、器官的發(fā)育和形成、組織修復(fù)、骨骼發(fā)育以及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要作用[3]。通過(guò)對(duì)昆明裂腹魚(yú)FGF 基因的研究將為昆明裂腹魚(yú)發(fā)育、生殖及性別調(diào)控機(jī)制揭示起到重要的推動(dòng)作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

本研究昆明裂腹魚(yú)采自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所珍稀魚(yú)類(lèi)保育研究基地，取其魚(yú)鰭95%酒精脫水，-20℃保存?zhèn)溆肹4]。對(duì)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)第二代、第三代高通量聯(lián)合測(cè)序結(jié)果解析得到的FGF 基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)所獲的序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物直接雙向測(cè)序驗(yàn)證該基因序列。對(duì)測(cè)序獲得的準(zhǔn)確的FGF 基因序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析與基因進(jìn)化分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 昆明裂腹魚(yú)基因組DNA 提取

取適量組織，采用天根生物海洋動(dòng)物組織基因組提取試劑盒，按照試劑盒使用方法提取高質(zhì)量基因組DNA，-20 ℃保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；蚪MDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。主條帶清晰，點(diǎn)樣孔較干凈，表明基因組DNA 質(zhì)量良好，滿(mǎn)足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

圖1 基因組DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 FGF 基因引物合成與測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組基因文庫(kù)，利用Primer Premier 5.0 進(jìn)行FGF 基因引物設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的引物送至華大基因進(jìn)行引物合成。引物信息見(jiàn)表1。利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（見(jiàn)圖2），并優(yōu)化至最優(yōu)結(jié)果，PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序驗(yàn)證基因序列。

圖2 昆明裂腹魚(yú)引物L(fēng)FFGF PCR 擴(kuò)增結(jié)果

表1 昆明裂腹魚(yú)FGF 基因引物信息

2.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

將上述PCR 產(chǎn)物送生工生物（上海） 有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖3 所示。

圖3 昆明裂腹魚(yú)FGF 基因測(cè)序（片段）結(jié)果

2.4 昆明裂腹魚(yú)FGF 基因的測(cè)序結(jié)果分析

2.4.1 堿基分析

根據(jù)正反向測(cè)序結(jié)果，利用BioEdit 軟件進(jìn)行序列拼接[5]，得到787 bp 的基因序列。經(jīng)比對(duì)表明測(cè)序序列與三代測(cè)序結(jié)果一致，三代高通量測(cè)序具有較高的質(zhì)量，能夠用于基因結(jié)構(gòu)分析。使用在線分析工具確定該FGF 基因中，得到A 為553 個(gè)，占比27%；T 為549 個(gè)，占比28%；G 為507 個(gè)，占比24%；C 為428 個(gè)，占比21%。

2.4.2 FGF 基因蛋白表達(dá)預(yù)測(cè)分析

利用NCBI 提供的ORF finder 工具預(yù)測(cè)[6]，F(xiàn)GF基因全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組序列有一個(gè)完整的ORF，長(zhǎng)度為699 bp，一共編碼232 個(gè)氨基酸；使用Prot-Param在線軟件分析得到FGF 基因蛋白分子式為C1180-H1885N339O328S11，相對(duì)分子質(zhì)量為26 421.68 Da；等電點(diǎn)（PI） 為9.99；不穩(wěn)定系數(shù)為51.98，該蛋白的結(jié)構(gòu)較為不穩(wěn)定。利用在線軟件Expasy-ProtScal 對(duì)FGF 基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性的預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4，由圖中疏水值判斷，F(xiàn)GF基因編碼的蛋白親水性氨基酸數(shù)量要多于疏水性氨基酸的數(shù)量，初步判定此蛋白為親水性蛋白。

圖4 FGF 蛋白親水性/疏水性分析結(jié)果

利用編碼的氨基酸序列在NCBI 上進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性比對(duì)，結(jié)果顯示與鯉魚(yú)的FGF13 基因一致性達(dá)到99.50%，初步確定此昆明裂腹魚(yú)FGF 基因?yàn)镕GF13 基因；FGF13 基因有FGF13a-1、FGF13a-2、FGF13b 等3 種基因，進(jìn)一步比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與FGF13a-2 同源性最高，為99.01%，與FGF13b、FGF13a-1 比對(duì)，同源性分別為86.84%、98.52%。由此確定該基因?yàn)镕GF13a-2 基因。

使用Conserved Domain 軟件對(duì)編碼的氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)[7]，結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明昆明裂腹魚(yú)FGF 基因含有受體結(jié)合位點(diǎn)和肝素結(jié)合位點(diǎn)等2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域分別位于基因的前半部分和后半部分，F(xiàn)GF 基因編碼的蛋白屬于FGF 轉(zhuǎn)錄因子超家族成員。

使用SOPMA 在線工具對(duì)FGF 編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)[8]，結(jié)果如圖5 所示。FGF 基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)共有4 種，α-螺旋有52 個(gè)氨基酸，占比為22.41%；β-轉(zhuǎn)角有19 個(gè)氨基酸，占比為8.19%；延伸鏈有50 個(gè)氨基酸，占比為21.55%；無(wú)規(guī)卷曲占比為47.84%。

圖5 FGF 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

FGF 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明其蛋白質(zhì)中主要為無(wú)規(guī)則卷曲，有少量的α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈，與預(yù)測(cè)的FGF 基因蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，如圖6 所示。

圖6 FGF 基因的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析

2.4.3 FGF 基因核酸序列進(jìn)化分析

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得金線鲃（Sinocyclocheilus grahami）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio）、鯽魚(yú)（Carassius auratus）、斑馬魚(yú)（Danio rerio）、紅腹食人魚(yú)（Pygocentrus nattereri）、大蓋巨脂鯉（Colossoma macropomum）、墨西哥脂鯉（Astyanax mexicanus）、遮目魚(yú)（Chanos chanos）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）、巴丁魚(yú)（Pangasianodon hypophthalmus）、大西洋鮭（Salmo salar） FGF 基因的核酸序列，運(yùn)用MEGA 軟件與昆明裂腹魚(yú)FGF 基因序列進(jìn)行進(jìn)化分析[9]，核苷酸序列的同源性如圖7 所示。

3 分析與討論

利用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序與三代測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF 基因787 bp 序列僅有2 bp 的堿基差別，表明三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄文庫(kù)測(cè)序所得基因序列具有較高的準(zhǔn)確性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因結(jié)構(gòu)的初步預(yù)測(cè)與分析。FGF 基因ORF 長(zhǎng)度為699 bp，編碼232 個(gè)氨基酸，分子式為C1180H1885N339O32-8S11；相對(duì)分子質(zhì)量為26 421.68 Da；等電點(diǎn)（PI） 為9.99；不穩(wěn)定系數(shù)為51.98。對(duì)獲得的基因序列與相關(guān)近源物種及區(qū)域品種構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，確立其進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示與金線鲃、鯉魚(yú)、鯽魚(yú)、斑馬魚(yú)的親緣關(guān)系較近。通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，與鯉魚(yú)的FGF13 基因同源性最高，為99.50%；將FGF13a-1、FGF-13a-2、FGF13b 等3 種基因與FGF 基因全長(zhǎng)編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示與FGF13a-2 同源性最高，為99.01%，與FGF13b、FGF13a-1 比對(duì)，同源性分別為86.84%、98.52%。由此初步確定昆明裂腹魚(yú)FGF 基因?yàn)镕GF13a-2 基因。該研究結(jié)果與FGF13 基因的同源性較高，可確定所獲得FGF基因?yàn)镕GF13 基因家族成員[10]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF 基因含有受體結(jié)合位點(diǎn)和肝素結(jié)合位點(diǎn)2 個(gè)結(jié)構(gòu)域，對(duì)FGF 基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行親疏水性預(yù)測(cè)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，昆明裂腹魚(yú)FGF 蛋白具有轉(zhuǎn)錄因子超家族成員的蛋白結(jié)構(gòu)特征[11]。昆明裂腹魚(yú)FGF 基因的研究為進(jìn)一步分析基因在組織中的表達(dá)及基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ)，也為昆明裂腹魚(yú)相關(guān)基因與發(fā)育關(guān)系研究奠定了一定基礎(chǔ)。