梔子大黃湯在酒精性肝病小鼠模型中的保護(hù)作用

侯逸文， 張榮杰， 紀(jì)龍珊， 李 茜， 高月求， 李 曼

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a. 細(xì)胞免疫實(shí)驗(yàn)室， b. 肝病科， 上海 201203； 2 肝腎疾病病癥教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203；

酒精性肝?。ˋLD）是一種因過(guò)量飲酒導(dǎo)致迅速出現(xiàn)以黃疸和肝臟相關(guān)并發(fā)癥為特征的疾病，具有較高的短期病死率［1］。ALD是引起全球慢性肝病的主要原因之一［2］，也是全球最常見(jiàn)的晚期肝病之一［3］，其中僅酒精性相關(guān)的肝硬化和肝癌死亡數(shù)就占全球死亡人數(shù)的1%［4］。在美國(guó)，ALD 占其肝硬化病死率的48%［2］，而在我國(guó)，隨著社會(huì)的發(fā)展，飲酒人群比例和ALD的患者數(shù)量也逐年升高［5］。ALD 主要包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和酒精性肝硬化，嚴(yán)重的情況下甚至導(dǎo)致肝癌的發(fā)生［6］。酒精可以通過(guò)各種機(jī)制作用，最后導(dǎo)致脂肪在肝臟的沉積，而酒精在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物會(huì)引起免疫反應(yīng)，可能會(huì)造成炎癥和損傷［7］，隨著病情進(jìn)展和代謝產(chǎn)物的積累，最終可能會(huì)導(dǎo)致肝癌的形成。ALD 的治療方法主要有戒酒、營(yíng)養(yǎng)支持和預(yù)防肝硬化的發(fā)生及進(jìn)展［8］，除此之外，沒(méi)有針對(duì)ALD的具體治療方案［6］。戒酒只能減輕ALD 的部分癥狀，尋求有效的治療ALD、減緩ALD進(jìn)展的藥物是必要的。

ALD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜［9］，目前已知的機(jī)制主要涉及氧化應(yīng)激失衡，腸道內(nèi)毒素的增加，免疫炎癥信號(hào)通路的激活，以及飲酒對(duì)肝細(xì)胞的直接損傷等［10］。氧化應(yīng)激失衡由抗氧化能力和活性氧（ROS）之間的失衡引起的［11］。酒精的氧化代謝產(chǎn)物如乙醛和ROS在酒精性肝炎的臨床和病理譜中發(fā)揮著重要作用。酒精氧化代謝影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，擾亂多個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄控制，導(dǎo)致脂質(zhì)積累、纖維化、先天免疫和適應(yīng)性免疫的激活。此外，乙醇代謝激活天然免疫和獲得性免疫在ALD的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，乙醛和脂多糖誘導(dǎo)細(xì)胞釋放ROS、促炎細(xì)胞因子和趨化因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。

中草藥含有多種天然化合物，存在低毒性、多靶點(diǎn)等作用優(yōu)勢(shì)，在ALD 的預(yù)防和治療方面已受到廣泛關(guān)注［12］。ALD 在中醫(yī)學(xué)一般歸屬于“黃疸”“酒疸”［13］“傷酒”“酒脹”［14］等范疇。主要病機(jī)在于內(nèi)濕為患，寒濕內(nèi)蘊(yùn)或濕郁化熱，進(jìn)一步至脾虛肝郁，肝失疏泄，氣滯血瘀，最終導(dǎo)致肝、脾、腎等臟腑功能失常［1］?！督饏T要略》中張仲景對(duì)于酒疸的治則是“清解濕熱”，以“上下分消”為治法［15］，據(jù)此提出梔子大黃湯（ZZDHT）治療酒疸［16］，該方由梔子十四枚、大黃一兩、枳實(shí)五枚、豉一升組成。本研究顯示了ZZDHT 能夠減輕慢性酒精喂養(yǎng)加急性酒精灌胃ALD 小鼠模型（NIAAA 模型小鼠）的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)水平。通過(guò)采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、非靶向代謝組學(xué)和RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法，研究ZZDHT 治療ALD 的可能作用機(jī)制，以期為ALD的治療提供研究思路和參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.1.1 ZZDHT 活性成分篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），檢索“梔子”“大黃”“枳實(shí)”“淡豆豉”此4 味中藥的化合物，以口服利用度值（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件，過(guò)濾獲得復(fù)方的有效化合成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。使用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出來(lái)的中藥復(fù)方藥物靶點(diǎn)，借助Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)，將物種限定為Homo sapiens，將靶點(diǎn)全稱統(tǒng)一規(guī)范轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的基因symbol進(jìn)行校正，便于后期的分析與數(shù)據(jù)處理。

1.1.2 ZZDHT-ALD 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)可視化分析 使用GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank五個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)以“Alcoholic liver disease、alcohol-related liver diseases、alcohol-associated liver disease”為檢索詞獲取ALD 相關(guān)基因，將篩選到的藥物靶點(diǎn)基因和疾病相關(guān)基因取交集，得到藥物-疾病相關(guān)基因，使用jvenn 網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)（http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制交集基因Venn 圖。通過(guò)Cytoscape3.8.0 軟件對(duì)藥物-疾病相關(guān)基因進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)分析，得到中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.3 ZZDHT-ALD 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI）構(gòu) 建 使 用String 平 臺(tái)（https：//cn.string-db.org/）對(duì)交集基因進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，物種選擇“Homo sapiens”，設(shè)置互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.900，去除網(wǎng)絡(luò)圖中已斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)。將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，使用CytoNCA插件計(jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心性得分，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的Betweenness（BC）、Closeness（CC）、Degree（DC）、Eigenvector（EC）、LAC、Network（NC）各項(xiàng)得分均大于中位值進(jìn)行過(guò)濾，最終可以得到網(wǎng)絡(luò)的核心節(jié)點(diǎn)基因。

1.1.4 ZZDHT-ALD 基因本體（gene ontology，GO）分析及京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析 使用David數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）對(duì)核心基因進(jìn)行功能富集分析，以P<0.05 作為過(guò)濾條件，進(jìn)行GO 和通路富集分析。使用R-4.1.1軟件的ggpubr包繪制柱狀圖對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行展示。

1.2 ZZDHT 非靶代謝組分析 使用非靶代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)ZZDHT 在小鼠血清和肝臟中代謝物變化情況，配制兩倍中劑量濃度的梔子大黃湯予以小鼠灌胃，準(zhǔn)備36 只C57BL/6J 小鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和用藥組，每組18 只。用藥組前3 天早晚各灌胃ZZDHT 一次（0.1 mL/10 g），第3 天晚上禁食，第4 天早上灌胃一次，分別于間隔2 h及4 h后再灌胃一次。對(duì)照組灌胃對(duì)應(yīng)體積的生理鹽水。分別于最后一次灌胃后10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、6 h，隨機(jī)從2 組各取3 只小鼠麻醉后取小鼠血清和肝組織，血清每只取30 μL，肝組織每只取30 mg，分別混合18 只小鼠的血清和肝組織進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜分析。使用超高液相色譜技術(shù)，分離和鑒定ZZDHT 在血清和肝組織中的代謝物，對(duì)ZZDHT 有效成分進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 ZZDHT 改善NIAAA 模型小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物及造模飼料 采用8 周齡SPF級(jí)C57BL/6J 雄性小鼠。購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（滬）2019-0003。

ZZDHT 藥物來(lái)自上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房的免煎顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司）。Lieber-DeCarli 對(duì)照液體飼料，Lieber-DeCarli 酒精液體飼料，購(gòu)自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3.2 主要試劑 HE 染色試劑盒（北京酷來(lái)搏生物科技有限公司，貨號(hào)：SL7070-100ML），DAB 顯色試劑盒（茹創(chuàng)生物有限公司，貨號(hào)：220105），Trizol（碧云天生物科技有限公司，貨號(hào)：R0016 ECL），RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊公司，貨號(hào)：R223-01），RNA 擴(kuò)增試劑盒（南京諾唯贊公司，貨號(hào)：Q711-02），ALT、AST檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程有限公司，貨號(hào)：C009-2-1、C010-2-1）、組織固定液（Biosharp 公司，貨號(hào)：70081800），磷酸鹽緩沖液（美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：PWL101），檸檬酸鈉抗原修復(fù)液（Bioss公司，貨號(hào)：C02-02002），EDTA 抗原修復(fù)液（BBI 公司，貨號(hào)：E673003-0100），3%過(guò)氧化氫修復(fù)液（北京酷來(lái)搏生物科技有限公司，貨號(hào)：DZSL30222501）。

1.3.3 藥物制備 ZZDHT 由梔子15 g，大黃3 g，枳實(shí)10 g，淡豆豉15 g 組成［14］。按公式：小鼠的正常給藥劑量（g/kg）=成人用藥量（g）/成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量（kg）×9，配制ZZDHT，一劑藥溶于66 mL 蒸餾水中即為ZZDHT 中劑量用藥組［ZZDHT（M）］，溶于33 mL 蒸餾水中，為高劑量用藥組［ZZDHT（H）］，溶于132 mL 蒸餾水中，為低劑量用藥組［ZZDHT（L）］。配制好的藥物放在4 ℃冰箱，備用。

1.3.4 模型制備、給藥與取材 NIAAA 模型小鼠制備［17-18］：C57BL/6J雄性小鼠50只，8周齡，體質(zhì)量20～30 g，SPF級(jí)。（1）對(duì)照飲食制備：稱量218.8 g對(duì)照飲食飼料，加入1 L滅菌純水充分混勻，制備成1 L對(duì)照液體飲食。（2）酒精飲食制備：稱量148 g酒精飲食飼料，加入950 mL滅菌純水充分混勻，制備成950 mL的酒精飲食，再加入50 mL無(wú)水乙醇混合（保存用于第2天的酒精液體飲食使用時(shí)再加入相應(yīng)比例酒精），配制成酒精液體飲食，按照比例每次配制2天用量，除液體飲食外不予其他食物和水。將50只C57BL/6J雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、ZZDHT（L）組、ZZDHT（M）組、ZZDHT（H）組，每組10只。對(duì)照組和模型組予等量生理鹽水灌胃，各用藥組予相應(yīng)的ZZDHT劑量灌胃。灌胃量為0.1 mL/10 g小鼠體質(zhì)量，在造模當(dāng)日起給藥，每天1次，給藥時(shí)間為10天，第11天稱重后，模型組和用藥組用單劑酒精灌胃（5 g/kg體質(zhì)量）1次，對(duì)照組用單劑量麥芽糖糊精灌胃（9 g/kg 體質(zhì)量），灌胃9 h后進(jìn)行取材，使用3%戊巴比妥鈉（80～100 mg/kg）腹腔注射麻醉后摘眼球取血，斷頸處死后肝臟取材。血液室溫靜置1 h后離心（4 ℃，3 500 r/min，15 min）取上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。剝離小鼠肝臟，切取兩塊肝大葉中部約0.5 cm×0.5 cm肝組織分別置于4%多聚甲醛固定和OCT膠液氮速凍，剩余肝組織保存于-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.5.1 小鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)小鼠血清ALT、AST和TG表達(dá)水平。

1.3.5.2 小鼠血清和組織ELISA 檢測(cè) 將血清稀釋5倍后，在微孔酶標(biāo)板分別加入樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，再加入辣根過(guò)氧化物酶100 μL，37 ℃恒溫孵育60 min，棄液拍干，洗滌液洗滌5次后，每孔加底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min，加終止液50 μL 并在15 min 內(nèi)于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。

1.3.5.3 肝組織qPCR檢測(cè) 提取肝組織總RNA，將4 μL的HiScript Ⅱ Q RT SuperMix和16 μL的RNA溶液（1 μg總RNA）制成20 μL的上樣體系，在50 ℃、15 min，85 ℃、5 s的條件下，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。cDNA 與引物和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 混合在95 ℃、2 min，95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，讀取Ct值。以2-△△Ct方法計(jì)算結(jié)果。

1.3.5.4 肝組織HE 染色 肝組織固定24 h后，依次經(jīng)過(guò)50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，無(wú)水乙醇，逐級(jí)脫水。二甲苯中透明40 min。包埋，以4 μm 進(jìn)行切片，貼片。

石蠟切片置于70 ℃烤箱中，烤片1 h，脫蠟，依次通過(guò)100%乙醇，90%乙醇，每種醇溶液10 min，進(jìn)行水化。蘇木素染色2 min，自來(lái)水沖洗。伊紅染色液染色20 s，自來(lái)水沖洗，鏡下觀察染色情況。中性樹(shù)脂封片。

1.3.5.5 肝組織油紅染色 將冰凍切片置室內(nèi)回溫5～10 min，試劑一應(yīng)用液染色10～15 min，37 ℃蒸餾水洗滌5～20 s，試劑二復(fù)染液染色3～5 min，蒸餾水洗30～60 s，滴加試劑三水性封固劑進(jìn)行封片，隨后鏡檢。

1.3.5.6 肝組織髓過(guò)氧化物酶（MPO）免疫組化染色石蠟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、水化?？乖迯?fù)：將切片浸泡于1×EDTA/檸檬酸鈉抗原修復(fù)液中，再置于微波爐中，高火5 min，低火15 min 修復(fù)。室溫冷卻。PBS 洗滌3 次，每次5 min。免疫組化筆畫圈后用3%的過(guò)氧化氫阻斷劑封閉30 min。PBS 洗滌3 次，每次5 min。用10% BSA 溶液室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過(guò)夜。室溫平衡20 min。PBS 洗3 次，每次5 min。二抗室溫孵育1 h。PBS 洗3 次，每次5 min。DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。中性樹(shù)脂封片。

1.3.5.7 肝組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）檢測(cè)［19］稱取肝組織并按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入生理鹽水并勻漿，離心取上清液，一部分上清液用BCA 測(cè)定蛋白濃度。后續(xù)測(cè)定SOD 和MDA。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 ZZDHT 活性成分及ALD 相關(guān)基因的篩選通過(guò)TMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)共檢索得到符合篩選標(biāo)準(zhǔn)活性成分53 個(gè)，對(duì)應(yīng)227 個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)GeneCards、OMIM、PharmGkb、TTD和DrugBank上檢索得到ALD相關(guān)基因8 685 個(gè)，將兩者取交集后得到222 個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)（圖1）。使用Cytoscape3.8.0 軟件對(duì)這些靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，得到ZZDHT的復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖（附錄A）。

圖1 ZZDHT和ALD交集靶點(diǎn)venn圖Figure 1 Venn diagram of ZZDHT and ALD intersection target

2.1.2 ZZDHT-ALD 的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和可視化 使用String 平臺(tái)中對(duì)222 個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過(guò)Cytoscape3.8.0 軟件CytoNCA 插件對(duì)PPI構(gòu)建結(jié)果進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，以BC、CC、DC、EC、LAC、NC 各項(xiàng)得分均大于分?jǐn)?shù)中位值進(jìn)行過(guò)濾，最終篩選出45 個(gè)核心節(jié)點(diǎn)基因，186 條邊。根據(jù)Degree 值的大小對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，排名前10 位的節(jié)點(diǎn)分別為MAPK3、JUN、TP53、MAPK1、RELA、MYC、MAPK14、TNF、FOS、AKT1（附錄B）。

2.1.3 ZZDHT-ALD 的GO 功能分析和KEGG 通路富集分析 通過(guò)對(duì)45個(gè)核心基因進(jìn)行功能富集分析，結(jié)果顯示45 個(gè)核心基因涉及功能和通路與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中GO 富集到response to oxygen-containing compound、cellular response to oxygencontaining compound、response to lipid等主要功能，KEGG富集到interleukin-6 signaling、TNF signaling pathway、alcoholic liver disease、inflammatory mediator regulation of TRP channels 和AMPK signaling pathway 等主要通路（圖2、3）。

圖2 核心靶點(diǎn)的GO富集分析圖Figure 2 GO enrichment analysis of core target

圖3 核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析圖Figure 3 KEGG enrichment analysis diagram of core target

2.2 非靶代謝組分析 通過(guò)對(duì)ZZDHT 組小鼠和對(duì)照組小鼠肝組織和血清的非靶代謝組分析，以|logFC|>1進(jìn)行篩選，得到ZZDHT在小鼠肝臟中差異代謝物225個(gè)，在血清中差異代謝物227 個(gè)，共同代謝物126個(gè)（圖4）。

圖4 ZZDHT在肝臟和血清中的差異代謝物交集venn圖Figure 4 Venn diagram of different metabolites of ZZDHT in liver and serum

通過(guò)KEGG進(jìn)行代謝物通路富集分析，結(jié)果顯示，肝 臟 代 謝 物 與Glycerolipid metabolism、Inflammatory mediator regulation of TRP channels、Biosynthesis of unsaturated fatty acids 和Fatty acid biosynthesis 等通路有關(guān)；血清代謝物與AMPK signaling pathway、Oxidative phosphorylation 和Inflammatory mediator regulation of TRP channeis等通路有關(guān)。肝臟和血清中代謝通路均與脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激緊密相關(guān)（圖5、6）。

圖5 肝臟差異代謝物KEGG富集分析圖Figure 5 Analysis of KEGG enrichment of liver differential metabolite

圖6 血清差異代謝物KEGG富集分析圖Figure 6 Enrichment analysis of serum differential metabolite KEGG

2.3 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠的調(diào)節(jié)作用

2.3.1 ZZDHT 對(duì)NIAAA 模型小鼠肝臟和脾臟的改善 對(duì)照組肝臟表面光滑有亮澤，脾臟紅潤(rùn)，大小適中；模型組小鼠肝臟表面有粗糙顆粒感，脾臟有輕微淤血；ZZDHT（L）組小鼠肝臟表面有輕微粗糙感，脾臟紅潤(rùn)，大小適中；ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組小鼠肝臟表面較光滑，脾臟紅潤(rùn)，大小適中（圖7）。

圖7 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟和脾臟大體觀的改善作用Figure 7 The improvement effect of ZZDHT on the liver and spleen of NIAAA model mice

2.3.2 ZZDHT 降低NIAAA 模型小鼠血清ALT、AST和TG 水平 與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清AST、ALT 和TG 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（L）、ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組小鼠血清AST、ALT 和TG 水平均明顯降低（P值均<0.05），各用藥組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值均>0.05）（圖8）。

圖8 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠血清ALT、AST和TG表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用Figure 8 The regulatory effect of ZZDHT on the expression level of serum ALT， AST and TG in NIAAA mice

2.3.3 ZZDHT 對(duì)NIAAA 模型小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響 HE 結(jié)果顯示，對(duì)照組肝細(xì)胞形態(tài)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)正常；模型組見(jiàn)嚴(yán)重脂肪變性壞死，組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；ZZDHT（L）、ZZDHT（M）和ZZDHT（H）組肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥浸潤(rùn)明顯輕于模型組，各用藥組組間無(wú)明顯差異，ZZDHT（L）組脂肪變性小氣泡略多于其他用藥組（圖9）。

圖9 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝組織結(jié)構(gòu)的影響（HE染色）Figure 9 The effect of ZZDHT on the liver tissue structure of NIAAA model mice （HE staining）

2.3.4 ZZDHT 減少NIAAA 模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積肝組織油紅染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組脂肪浸潤(rùn)明顯加重（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）脂肪浸潤(rùn)明顯減輕（P<0.05）（圖10）。

圖10 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的改善作用（油紅染色）Figure 10 Improvement effect of ZZDHT on liver lipid deposition in NIAAA model mice （oil red staining）

2.3.5 ZZDHT 減少NIAAA 模型小鼠肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn) MPO 染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組MPO 陽(yáng)性數(shù)量明顯增多，與模型組相比，ZZDHT（M）組陽(yáng)性數(shù)量明顯減少（圖11）。

圖11 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的改善作用（免疫組化染色）Figure 11 Improvement effect of ZZDHT on liver neutrophil infiltration in NIAAA model mice （IHC staining）

2.3.6 ZZDHT 改善NIAAA 模型小鼠肝臟氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)

2.3.6.1 肝組織 與對(duì)照組相比，模型組Ly6g、Ncf1、Ncf2、IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組Ly6g、Ncf1、Ncf2、IL-6、TNF-α、IL-1β 水平均明顯降低（P值均<0.05）（圖12）。與對(duì)照組相比，模型組SOD 水平明顯降低（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組SOD 水平明顯升高（P<0.05）；與對(duì)照組相比，模型組MDA、4-HNE、Gp91 和P22 水平均明顯升高（P值均<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組MDA、4-HNE、Gp91 和P22水平均明顯降低（P值均<0.05） （圖13、14）。

圖12 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟氧化應(yīng)激和炎性因子的調(diào)節(jié)作用Figure 12 The regulatory effect of ZZDHT on liver oxidative stress and inflammatory factors in NIAAA model mice

圖13 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟SOD、MDA和4-HNE蛋白水平的調(diào)節(jié)作用Figure 13 Regulation of ZZDHT on liver SOD， MDA and 4-HNE protein levels in NIAAA model mice

圖14 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠肝臟Gp91和P22基因水平的調(diào)節(jié)作用Figure 14 Regulation of ZZDHT on Gp91 and P22 gene levels in liver and liver of NIAAA model mice

2.3.6.2 血清 與對(duì)照組相比，模型組4-HNE水平明顯升高（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組4-HNE水平明顯降低（P<0.05）。與對(duì)照組相比，模型組GSHPx 水平均明顯降低（P<0.05），與模型組相比，ZZDHT（M）組GSH-Px水平均明顯升高（P<0.05）（圖15）。

圖15 ZZDHT對(duì)NIAAA模型小鼠血清4-HNE和GSH-Px的調(diào)節(jié)作用Figure 15 The regulatory effect of ZZDHT on serum 4-HNE and GSH-Px in NIAAA model mice

3 討論

梔子大黃湯出自《金匱要略》，為其治療酒疸的方藥，《金匱要略》中原文為“心中懊憹而熱，不能食，時(shí)欲吐，名曰酒疸”［13］。酒疸是由于嗜酒傷中，濕熱內(nèi)蘊(yùn)所致；酒熱傷胃，所以心中懊憹而熱；飲酒過(guò)多，助濕蘊(yùn)熱，影響脾胃的升降，故不能食，時(shí)欲吐；濕熱熏蒸肝膽，膽汁外溢肌表而身黃［15］。由此可見(jiàn)，酒疸與嗜酒過(guò)度發(fā)病有關(guān)，所以跟ALD 病因一致，同屬一類疾病。酒為濕熱之品，飲酒無(wú)節(jié)會(huì)導(dǎo)致濕熱之邪內(nèi)蘊(yùn)，膽熱液溢，浸淫肌膚而發(fā)黃疸。梔子大黃湯由梔子、大黃、淡豆豉和枳實(shí)組成，其中梔子，歸心經(jīng)、肺經(jīng)、三焦經(jīng)，有清熱利濕、瀉火除煩的功效，可除酒疸之“心中懊憹而熱”。大黃，歸脾胃經(jīng)、肝經(jīng)、大腸經(jīng)、心包經(jīng)，有清熱瀉下的功用［20］，《金匱要略》原文中有“酒疸，心中熱，欲吐者，吐之愈”，“酒黃疸者，或無(wú)熱，靖言了了，腹?jié)M欲吐，鼻燥。其脈浮者先吐之，沉弦者先下之”［21］。大黃因其清瀉之力，可用“沉弦著下之”退盡酒疸之熱毒，而梔子和大黃的通用功效為利膽退黃，祛除黃疸尿赤，“酒疸”屬于“黃疸”一類，病情嚴(yán)重者會(huì)有身目黃赤之狀，此二味藥可共奏祛黃之效。淡豆豉由遍身濕熱導(dǎo)致的心中懊憹或熱痛，可通過(guò)梔子大黃湯的上下分消盡數(shù)消除，淡豆豉、梔子可上清濕熱，枳實(shí)、大黃可中泄熱濕，使?jié)駸釓纳?、下（二焦）分消而解。其中酒疸脈浮者，當(dāng)先吐之，吐之可用淡豆豉；脈沉弦者，當(dāng)先下之，下之用大黃，因此梔子大黃湯同時(shí)兼有吐、下的功能。

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起與發(fā)展，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析中藥復(fù)方“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的技術(shù)日益成熟。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選ZZDHT 中化學(xué)成分的靶點(diǎn)基因，并與ALD 靶點(diǎn)基因進(jìn)行映射，發(fā)現(xiàn)222 個(gè)交集靶點(diǎn)基因。將這些靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO 富集和KEGG 通路分析、化學(xué)成分-靶點(diǎn)-通路及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，探討ZZDHT“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用機(jī)制。

ALD 因過(guò)量飲酒導(dǎo)致，后期體內(nèi)病理變化涉及多基因突變、一系列分子事件的動(dòng)態(tài)變化，如信號(hào)通路活化、炎性細(xì)胞聚集、炎性因子過(guò)表達(dá)及氧化應(yīng)激等。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得出ZZDHT 與ALD 的核心靶點(diǎn)基因多富集在氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)通路，非靶代謝組分析得出ZZDHT 與ALD 核心通路與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)通路有關(guān)。Chu 等［22］動(dòng)物和細(xì)胞研究顯示，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致ALD 的重要原因，具有抗氧化和抗炎作用的藥物才能更有效的保護(hù)肝臟。而Ncf1 和Ncf2 是NADPH 氧化酶復(fù)合體的重要功能亞基［23-24］。Kim 等［25］動(dòng)物研究顯示，與抗氧化應(yīng)激相關(guān)基因的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠肝損傷。ALD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但是乙醇的氧化代謝產(chǎn)物ROS 和乙醛在ALD 中起著促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展的作用［26］，乙醛同時(shí)還促進(jìn)ROS 的產(chǎn)生，ROS 的增加會(huì)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激［27］。ALD 的特征之一是肝臟中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)，它通過(guò)產(chǎn)生ROS、釋放蛋白酶和產(chǎn)生促炎介質(zhì)來(lái)對(duì)抗細(xì)菌感染，并加重肝細(xì)胞損傷、肝臟炎癥和纖維化。酒精會(huì)增加中性粒細(xì)胞向肝臟的募集，募集的中性粒細(xì)胞可以通過(guò)其標(biāo)志物L(fēng)y6G和MPO 來(lái)檢測(cè)到［9］。中性粒細(xì)胞募集后釋放有害介質(zhì)，如過(guò)氧化氫、彈力酶、氯胺和蛋白酶-3，這些物質(zhì)都與ALD 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)［28］。中性粒細(xì)胞的移動(dòng)促進(jìn)了它們與趨化因子修飾的內(nèi)皮細(xì)胞的接觸，從而被誘導(dǎo)激活。完全激活可能是一個(gè)由促炎性細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β 和IL-6，啟動(dòng)的兩個(gè)步驟的過(guò)程。而中性粒細(xì)胞被激活時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的ROS 和自由基。有研究表明，AMPK 通路的激活可調(diào)節(jié)自噬，自噬在去除脂滴中起重要作用［29］，活化AMPK可以減少脂質(zhì)堆積［30-31］，促進(jìn)脂肪酸氧化［32］。有臨床研究［28］表明，IL-6 的活性改變?cè)贏LD 的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。同時(shí)有動(dòng)物研究［11］顯示，抑制IL-6的表達(dá)可改善乙醇誘導(dǎo)的肝損傷。而IL-1β對(duì)ALD中的脂肪變性和炎癥反應(yīng)有促進(jìn)作用［33］。本研究結(jié)果顯示，ZZDHT 能顯著降低ALD 小鼠模型炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 和中性粒細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)Ly6g、Ncf1、Ncf2 的水平，同時(shí)能顯著改善肝組織SOD、MDA、4-HNE 和血清氧化應(yīng)激指標(biāo)4-HNE、GSH-Px，有效降低肝臟ALT、AST、TG 水平，提示ZZDHT 可能通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟炎癥和氧化應(yīng)激狀況，改善ALD。

綜上所述，ZZDHT 可有效改善NIAAA 模型小鼠的肝臟脂質(zhì)沉積和炎癥損傷，非靶向代謝組學(xué)結(jié)果提示，ZZDHT 可能通過(guò)多條通路干預(yù)ALD 小鼠肝臟中氧化應(yīng)激和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善小鼠肝臟狀態(tài)，為后續(xù)進(jìn)一步研究其具體分子作用機(jī)制提供了一定參考方向。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2023年2月9日經(jīng)由上海南方模式生物研究中心倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：2023-0003，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：侯逸文負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；張榮杰、紀(jì)龍珊、李茜參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；高月求、李曼負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。