陸勝勇,傅曼琴,徐玉娟,謝大森,余元善,溫靖,肖更生*
1(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510610)2(仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 輕工食品學(xué)院,廣東 廣州,510225)3(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州,510640)
冬瓜[Benincasahispida(Thb.) Cogn.]是葫蘆科草本植物,我國(guó)南北地區(qū)均有種植,且種植面積大,產(chǎn)量高,是僅次于黃瓜的第二大瓜類(lèi)蔬菜[1]。冬瓜富含營(yíng)養(yǎng)成分,含有多種功能活性成分,低鈉高鉀,且具有較高的藥用價(jià)值,能清熱利水、減肥降脂、防治心腦血管疾病等,有一定的保健或治療效果[2-3]。冬瓜藥食價(jià)值高,但其物質(zhì)基礎(chǔ)研究較少,功效成分未有明確的解釋。因此,冬瓜的化學(xué)成分分析對(duì)其藥食價(jià)值說(shuō)明和精深加工指導(dǎo)具有重要的科學(xué)意義。張曉蕾等[4]利用GC-MS對(duì)冬瓜皮和果肉測(cè)定鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[bis(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP]發(fā)現(xiàn),DEHP含量果皮顯著高于果肉;盛留洋等[5]對(duì)生腌冬瓜和熟腌冬瓜的研究發(fā)現(xiàn),兩者的揮發(fā)性物質(zhì)有顯著性差異;李楊等[6]在冬瓜皮不同干燥工藝研究中發(fā)現(xiàn),烘箱60 ℃、烘箱105 ℃、常溫30 ℃和微波干燥中,活性成分保留效果最好的干燥工藝為烘箱60 ℃干燥。冬瓜貯運(yùn)性好,有較長(zhǎng)的貨架期,具有良好的加工性能,是現(xiàn)代農(nóng)產(chǎn)品加工的良好原料和調(diào)節(jié)市場(chǎng)供需關(guān)系的的重要蔬菜[7]。冬瓜傳統(tǒng)的加工產(chǎn)品以餡料、蜜餞以及果脯為主,此外,常見(jiàn)的還有冬瓜醬、冬瓜果凍、冬瓜保健飲料等[8],往往只利用冬瓜果肉,產(chǎn)生8%的冬瓜皮和4%的冬瓜瓤被作為廢棄物直接丟棄[9-10]。
冬瓜瓤作為一種副產(chǎn)物,潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高,現(xiàn)有的研究中,冬瓜瓤可以加工成飲料及其發(fā)酵酒[11],除此,并沒(méi)有更多的研究或產(chǎn)品開(kāi)拓冬瓜瓤市場(chǎng)。目前,冬瓜瓤的化學(xué)成分分析鮮有報(bào)道,制約著冬瓜瓤精深加工利用,對(duì)提高冬瓜的經(jīng)濟(jì)附加值有一定的局限。因此,本研究首次運(yùn)用廣泛靶向代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)冬瓜瓤代謝物進(jìn)行分離鑒定,分析其化學(xué)成分,為冬瓜副產(chǎn)物精深加工及品質(zhì)調(diào)控提供參考依據(jù),對(duì)于延長(zhǎng)冬瓜產(chǎn)業(yè)鏈,促進(jìn)冬瓜產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展具有重要意義。
黑皮冬瓜,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。
甲醇、乙腈(色譜純),Merck &Co.Inc.;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO,色譜純),BioBioPha/Sigma-Aldrich;三吡啶三吖嗪(tripyridine triazine,TPTZ)、DPPH(98%)、Trolox(分析標(biāo)準(zhǔn)品),上海源葉生物科技有限公司;乙酸鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
101-3ABS鼓風(fēng)干燥箱,上??坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司;Scientz-100F冷凍干燥機(jī),寧波新芝生物科技股份有限公司;MM 400研磨儀,德國(guó)Retsch公司;Nexera X2超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC),日本SHIMADZU公司;4500 QTRAP串聯(lián)質(zhì)譜(tandem mass spectrometry, MS/MS),德國(guó)Applied Biosystems公司。
1.3.1 冬瓜不同部位的總黃酮、總酚及抗氧化測(cè)定
將冬瓜皮、肉、瓤和籽進(jìn)行干燥、研磨,參考王立抗等[12]測(cè)定冬瓜瓤總黃酮、總酚,其中總黃酮結(jié)果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含蘆丁當(dāng)量(rutinum equivalent,RE,mg RE/g)表示,總酚結(jié)果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含沒(méi)食子酸當(dāng)量(gallic acid equivalent,GAE,mg GAE/g)表示;取冬瓜4個(gè)部位的總酚提取液測(cè)定其鐵離子還原力、DPPH自由基清除力和ABTS陽(yáng)離子自由基清除力,其中結(jié)果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含Trolox當(dāng)量(mg TE/g)表示。
鐵離子還原力:FRAP-Trolox抗氧化活性測(cè)定,參考DINARDO等[13]的方法,取1 mL樣液加入3 mL FRAP工作液[0.3 mol/L乙酸鈉水溶液∶10 mmol/L TPTZ鹽酸(40 mmol/L)溶液∶20 mmol/L FeCl3水溶液=10∶1∶1, 體積比],室溫避光反應(yīng)10 min,593 nm測(cè)定吸光值,每個(gè)樣品測(cè)定3次,以Trolox為對(duì)照品;
DPPH自由基清除力:DPPH-Trolox抗氧化活性測(cè)定參考SHARMA等[14]的方法,取1 mL樣液加入5 mL DPPH-乙醇溶液(130 μmol/L)室溫避光反應(yīng)30 min,517 nm測(cè)定吸光值,每個(gè)樣品重復(fù)3次,Trolox為對(duì)照品。
ABTS陽(yáng)離子自由基清除力:ABTS-Trolox抗氧化活性測(cè)定,參考MZID等[15]的方法,配制7 mmol/L ABTS陽(yáng)離子儲(chǔ)備液,使用時(shí)無(wú)水乙醇稀釋使其吸光值為0.70±0.02。0.5 mL樣液,加入3 mL ABTS陽(yáng)離子稀釋液,室溫避光反應(yīng)30 min,734 nm測(cè)定吸光值,每個(gè)樣品重復(fù)3次,Trolox為對(duì)照品。
1.3.2 冬瓜瓤UPLC-MS/MS樣品制備
參考CHEN等[16]的方法,將冬瓜瓤進(jìn)行真空冷凍干燥,研磨至粉末狀。準(zhǔn)確稱取0.100 0 g粉末,1.2 mL提取液(70%甲醇)溶解,渦旋6次(間隔30 min/次,每次渦旋30 s),得到的樣液放置于4 ℃過(guò)液,離心10 min(12 000 r/min),將上清液過(guò)微孔濾膜(孔徑0.22 μm),保存濾液于進(jìn)樣瓶用于UPLC-MS/MS分析。
1.3.3 UPLC-MS/MS采集分析
1.3.3.1 UPLC條件
色譜柱:Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動(dòng)相程序:流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量4 μL。
UPLC流動(dòng)相洗脫方法:A相為超純水-0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)的甲酸,B相乙腈-0.1%的甲酸,0~9 min,95%~5% A、5%~95% B,9~10 min,5% A、95% B,10~11 min,5%~95% A、95%~5% B,11~25 min,95% A、5% B。
1.3.3.2 MS/MS條件
由三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀(Q TRAP),AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(tǒng)(配備了ESI Turbo離子噴霧接口),由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運(yùn)行正負(fù)2種離子模式。ESI源操作參數(shù)參考ZHOU等[17]的方法,離子源氣體Ⅰ,氣體Ⅱ和簾氣分別設(shè)置為50、60、25.0 psi,參數(shù)設(shè)置為高。
采用Excel、Origin 2018對(duì)1.3.1節(jié)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖,運(yùn)用SPSS對(duì)結(jié)果進(jìn)行顯著性差異分析?;谖錆h邁維生物公司自建數(shù)據(jù)庫(kù)與代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫(kù),根據(jù)二級(jí)譜信息和三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)進(jìn)行代謝物定性定量。利用軟件Analyst 1.6.3處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),利用Origin 2018等軟件進(jìn)行作圖分析。
黃酮、多酚類(lèi)化合物在植物的抗氧化活性中起重要作用[18]。由圖1可知,冬瓜中不同部位黃酮含量存在顯著性差異,其中冬瓜肉總黃酮含量最高,為2.45 mg RT/g,瓤中次之,為1.90 mg RT/g,冬瓜籽含量最低。冬瓜各部位總多酚含量介于0.31~2.36 mg GAE/g,4個(gè)部位的總多酚含量存在顯著性差異,冬瓜瓤含量最高,為2.36 mg GAE/g,冬瓜肉次之,為1.73 mg GAE/g,冬瓜籽含量最低。
a-冬瓜各部位總黃酮和總酚;b-DPPH自由基清除能力;c-ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力;d-鐵離子還原力
基于冬瓜各部位多酚提取物,測(cè)定其還原力、DPPH自由基清除力、ABTS陽(yáng)離子自由基清除力,結(jié)果表明,不同部位提取物均有不同程度的還原力和自由基清除力,其中冬瓜瓤部位的還原力(2.38 mg TE/g)、DPPH自由基清除能力(1.60 mg TE/g)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力(68.11 mg TE/g)均是最強(qiáng),冬瓜肉次之,冬瓜籽最弱。因此,相較于冬瓜皮、肉和籽,冬瓜瓤的抗氧化能力最強(qiáng)。因此,本研究選取冬瓜瓤為研究對(duì)象,基于UHPLC-QqQ-MS分析其化學(xué)成分。
通過(guò)對(duì)質(zhì)控(quality control,QC)樣本質(zhì)譜檢測(cè)分析的MRM代謝物檢測(cè)多峰圖(多物質(zhì)提取的離子流譜圖)進(jìn)行重疊展示分析,可以看到重復(fù)樣本不同物質(zhì)的離子峰值重疊性比較好(圖2-a),質(zhì)控樣本的總離子流圖如圖2-b所示,QC樣品總離子流圖的基線穩(wěn)定,其重復(fù)性好,峰分離度高。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程具有穩(wěn)定性,檢測(cè)結(jié)果可靠。
a-MRM代謝物檢測(cè)多峰圖;b-QC樣本總離子流圖
2.3.1 代謝物分類(lèi)
通過(guò)冬瓜瓤代謝組學(xué)數(shù)據(jù),共鑒定出825種代謝物,圖3根據(jù)代謝物的結(jié)構(gòu)對(duì)冬瓜瓤的代謝物進(jìn)行一級(jí)分類(lèi),分為11類(lèi)。其中初生代謝物451個(gè)(59.01%),包括氨基酸及其衍生物(114個(gè),21.41%)、脂質(zhì)(123個(gè),13.28%)、有機(jī)酸(74個(gè),10.82%)、糖及醇類(lèi)(58個(gè),6.68%)、核苷酸及其衍生物(62個(gè),5.62%)、維生素(20個(gè),1.22%);次生代謝物374個(gè)(40.99%),包括酚酸類(lèi)(161個(gè),21.10%)、生物堿(57個(gè),7.84%)、黃酮(92個(gè),7.36%)、木脂素和香豆素(51個(gè),3.63%)、萜類(lèi)(13個(gè),1.06%)。
a-初生代謝物;b-次生代謝物
2.3.2 初生代謝物分析
為了研究冬瓜瓤中的重要化合物及主要特性,表1篩選冬瓜瓤中相對(duì)含量≥0.5%的初生代謝物,共計(jì)27種,是總代謝物的35.88%,包括氨基酸及其衍生物(8種,15.86%)、脂質(zhì)(8種,8.28%)、有機(jī)酸(5種,6.19%)、核苷酸及其衍生物(4種,3.72%)、糖及醇類(lèi)(2種,1.84%)。
2.3.2.1 氨基酸及其衍生物
氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位,冬瓜瓤氨基酸及其衍生物種類(lèi)及含量豐富,共檢測(cè)出114種氨基酸及其衍生物,由表1可知,相對(duì)含量≥0.5%的氨基酸及其衍生物有L-谷氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-天門(mén)冬氨酸鈣、反-4-羥基-L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、3-氨基丙酸甲酯鹽酸鹽。其中L-色氨酸(0.96%)是8種必需氨基酸之一,其在癩皮病、精神分裂癥、抑郁癥、高血壓及疼痛等方面有良好的療效[19-20];L-谷氨酸(3.91%)是最主要呈鮮味氨基酸之一,還包括天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸及其鈉鹽,此外,含量較多的L-精氨酸、組氨酸也有重要的生理作用和營(yíng)養(yǎng)功能[21]。
2.3.2.2 核苷酸及其衍生物
核苷酸是組成DNA和RNA的基本單位,是生物體內(nèi)重要的低分子化合物,核苷酸參與多種調(diào)節(jié)和代謝,通過(guò)參與細(xì)胞代謝和更新,改善細(xì)胞活力,提高機(jī)體自身功能和自我調(diào)節(jié)能力,也可改善食物的感官特征[22]。本研究從冬瓜瓤中檢測(cè)到62種核苷酸及其衍生物,由表1可知,其相對(duì)含量≥0.5%的核苷酸及其衍生物有2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸、鳥(niǎo)苷、腺苷、阿糖腺苷。
2.3.2.3 糖及醇類(lèi)
糖是生物體所需要的必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),參與生物體的合成與代謝,冬瓜瓤中共鑒定出58種糖及醇類(lèi),包括24種糖、14種醇、15種糖酸以及5種糖醇衍生物。冬瓜瓤中相對(duì)含量≥0.5%的糖及醇類(lèi)代謝物有D-木糖酸、葡萄糖酸,此外,還積累了果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖。
2.3.2.4 有機(jī)酸
有機(jī)酸和糖的比例影響著果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì),冬瓜瓤中有機(jī)酸的種類(lèi)和含量豐富,共檢測(cè)出74種有機(jī)酸,其中相對(duì)含量≥0.5%的有機(jī)酸有2,3-二羥基-3-甲基丁酸、琥珀酸、丙醇二酸、4-胍基丁酸、檸檬酸(表1)。其中琥珀酸(1.28%),可賦予食物鮮味;丙醇二酸(1.15%)是具有較強(qiáng)功能活性的有機(jī)酸,丙醇二酸能有效抑制糖類(lèi)轉(zhuǎn)化為脂肪,減少脂肪堆積,在減肥方面有較好的效果[23],此外,還能防治高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化,是衡量原料及其加工品保健功能的重要指標(biāo)之一[24]。
2.3.2.5 脂質(zhì)
脂質(zhì)廣泛存在生物體中,是生物體所需的重要營(yíng)養(yǎng)素之一,也是細(xì)胞重要的組成成分。冬瓜瓤中共鑒定出123種脂類(lèi)物質(zhì),主要為溶血磷脂(53種,30.69%)和脂肪酸(60種,68.42%),還包括甘油酯(8種,0.77%)、鞘脂(2種,0.11%);相對(duì)含量≥0.5%的脂類(lèi)物質(zhì)有亞油酸、棕櫚醛、肉豆蔻酸、巖芹酸、11-十八碳烯酸、溶血磷脂酰膽堿 18∶1、溶血磷脂酰膽堿 18∶1(2n異構(gòu))、十八碳-9E,13E,15Z-三烯酸(表1)。冬瓜瓤中含量最高亞油酸(1.97%),是功能性多不飽和脂肪酸,是人體的必需脂肪酸,適量的亞油酸,能降低膽固醇[25]。另外含量較高的肉豆蔻酸(1.21%)可減少皮膚炎癥和傷害感受,還具有抗氧化和抗糖尿病作用,可應(yīng)用于食品調(diào)味劑[26]。
2.3.3 次生代謝物分析
表2篩選冬瓜瓤中相對(duì)含量≥0.5%的次生代謝物,共22種,占總代謝物的28.26%,包括酚酸類(lèi)(9種,15.66%)、黃酮(4種,5.95%)、生物堿(6種,5.67%)、木質(zhì)素和香豆素(2種,1.70%)、萜類(lèi)(1種,0.65%)。
表2 冬瓜瓤主要的次生代謝物
2.3.3.1 黃酮
冬瓜瓤中的黃酮種類(lèi)和含量非常豐富,共檢測(cè)出92種黃酮類(lèi)代謝物,主要是黃酮、二氫黃酮、黃酮醇,還包括查爾酮、二氫黃酮醇、花青素、黃酮碳糖苷、異黃酮共10個(gè)亞類(lèi),具有顯著的抗氧化、抗炎癥、提高免疫力、降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的生物學(xué)活性[27]。相對(duì)含量≥0.5%的黃酮類(lèi)代謝物有苜蓿素-7-O-葡萄糖二酸苷(2.07%)、4′-羥基-5,7-二甲氧基黃酮(2.41%)、川陳皮素(0.90%)、桔皮素(0.57%),4′-羥基-5,7-二甲氧基黃酮、川陳皮素、桔皮素是多甲氧基黃酮化合物,現(xiàn)有研究中,它們具有體內(nèi)體外化學(xué)預(yù)防作用,包括抗癌、抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化和神經(jīng)保護(hù),通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)級(jí)聯(lián)、基因轉(zhuǎn)錄以及蛋白質(zhì)功能和酶活性來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞生理功能[28]。
2.3.3.2 生物堿
生物堿是一類(lèi)含氮的有機(jī)化合物,具有顯著的生物活性,冬瓜瓤共檢測(cè)出57種生物堿代謝物,分屬于吡啶類(lèi)(5種)、吡咯類(lèi)(3種)、酚胺類(lèi)(14種)、生物堿類(lèi)(26種)、吲哚類(lèi)(9種)。相對(duì)含量≥0.5%的生物堿有左旋肉堿(2.21%)、膽堿(1.00%)、葫蘆巴堿(0.73%)、組氨醇(0.60%)、乙酰左旋肉堿鹽酸鹽(0.58%)和煙胺(0.55%),其中含量最多的是左旋肉堿,是廣泛存在于生物體內(nèi)的活性物質(zhì),是通過(guò)刺激脂肪分解和β氧化來(lái)調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝,并伴有相應(yīng)的基因表達(dá)變化和抑制脂肪原基因表達(dá),具有抗肥胖作用[29];含量較多的膽堿是構(gòu)成生物膜的重要組成成分,是人類(lèi)必須的營(yíng)養(yǎng)素,可以促進(jìn)腦發(fā)育和提高記憶力、促進(jìn)脂肪代謝和體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基代謝,還可以降低血清膽固醇,預(yù)防心血管疾病[30-31];此外,葫蘆巴堿(0.73%)能促進(jìn)人體新陳代謝,具有降血糖[32]、降血脂[33]和抗腫瘤的活性作用[34]。
2.3.3.3 酚酸類(lèi)
酚酸是廣泛分布在植物中的一類(lèi)生物活性物質(zhì),賦予植物顏色、風(fēng)味等,具有抗炎、抗血栓、抗糖尿病等藥理特性[35]。冬瓜瓤酚酸的種類(lèi)和含量豐富,共鑒定出161中酚酸類(lèi)代謝物,相對(duì)含量≥0.5%的酚酸類(lèi)代謝物有3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷、脫氫二松柏醇-γ′-O-葡萄糖苷、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷、香草醛、1-O-龍膽酰-D-葡萄糖、芐基-(2″-O-木糖基)葡萄糖苷,其中含有0.76%的香草醛,是一種重要的調(diào)味化合物,具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香,起增香和定香作用,廣泛應(yīng)用在食品和飲料的添加劑以及各種藥物配方的掩蔽劑等[36]。
2.3.3.4 木脂素和香豆素
木脂素和香豆素廣泛分布在植物和人類(lèi)食物來(lái)源中,有多種藥理特性,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肝臟損傷等[37-38]。冬瓜瓤中共檢測(cè)出51種木脂素和香豆素代謝物,其中木脂素27種,香豆素24種。相對(duì)含量≥0.5%的木脂素代謝物有松脂醇-4-O-葡萄糖苷、松脂醇-4,4′-O-二-O-葡萄糖苷。東莨菪內(nèi)酯是冬瓜瓤中相對(duì)含量較高的代謝物,占冬瓜瓤代謝物的0.22%,是一種具有多種藥理作用的活性物質(zhì),如抗腫瘤、降血壓和降血糖等[39]。
比較冬瓜皮、肉、瓤和籽4個(gè)部位,冬瓜瓤總黃酮含量?jī)H次于冬瓜肉,且總酚含量最高;此外冬瓜瓤總酚提取液的鐵離子還原力(2.38 mg TE/g)、DPPH自由基清除力(1.60 mg TE/g)和ABTS陽(yáng)離子自由基清除力(68.11 mg TE/g)均是最強(qiáng),因此冬瓜瓤的抗氧化能力最強(qiáng)。本研究首次采用廣泛靶向代謝組學(xué)方法,分離鑒定冬瓜瓤的代謝物,檢測(cè)出825種代謝物,其中,初生代謝物451種(59.01%),次生代謝物374種(40.99%)。氨基酸、核苷酸、脂質(zhì)、有機(jī)酸,糖及醇類(lèi)代謝物為冬瓜瓤主要的初生代謝物,黃酮、酚酸類(lèi)、生物堿類(lèi)代謝物為冬瓜瓤中主要的次生代謝物。
本研究通過(guò)分析冬瓜瓤各類(lèi)代謝物數(shù)量和豐度,揭示冬瓜瓤中代謝物對(duì)冬瓜副產(chǎn)物營(yíng)養(yǎng)和活性的貢獻(xiàn)。本研究結(jié)果為冬瓜瓤副產(chǎn)物精深加工和利用提供了理論依據(jù)。