豌豆蛋白對巴旦木飲料貯藏穩(wěn)定性的影響及其機理探究

夏軒澤,侯笑笑,李言,錢海峰,張暉,周素梅,王立*

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214000)2(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院,北京,100048)

巴旦木蛋白飲料是以巴旦木為原料,經(jīng)脫皮、磨漿、加入增稠劑及乳化劑剪切混勻,加入糖、鹽等調(diào)配、均質(zhì)、滅菌制得的一類植物蛋白飲料,由于其富含脂肪和蛋白[1],不含乳糖[2],常被用作乳糜瀉和乳糖不耐癥個體的牛奶來源替代品[3]。該產(chǎn)品體系是一個涉及膠體系統(tǒng)的混合成分系統(tǒng)[4],這種膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性對于維持巴旦木飲料所需的流變特性至關(guān)重要[5]。貯藏期間,植物蛋白飲料易出現(xiàn)蛋白沉淀、脂肪上浮,導(dǎo)致飲料發(fā)生不穩(wěn)定的分層、絮凝、聚結(jié)等狀況,從而影響飲料品質(zhì)和口感,縮短貨架期[6]。作為一種典型的植物蛋白飲料,市面上的巴旦木飲料常用酪蛋白酸鈉(sodium caseinate,SC)作為乳化劑,但由于牛奶蛋白具有一定的致敏性,因此,亟需開發(fā)以植物源蛋白為來源的替代品[7-9]。

豌豆蛋白(pea protein isolate,PPI)是豌豆淀粉(粉絲)生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物,尚未得到充分開發(fā)利用,在一定程度上造成了資源的浪費[10]。2019年,全球PPI的市場規(guī)模為2.155億美元,預(yù)計到2027年將達(dá)到3.87億美元[11]。PPI對人體有多種健康作用,包括預(yù)防腎病、降低患心血管疾病的風(fēng)險等[12],同時營養(yǎng)價值高、致敏性低、價格低[13],但其較差的乳化性限制了其在食品中的應(yīng)用,因此,一般先對其進(jìn)行改性處理[14]。

在本團(tuán)隊前期工作中,以PPI為原料,獲得了功能特性明顯改善的擠壓處理豌豆蛋白(extruded pea protein isolate,EPPI)、磷酸化處理豌豆蛋白(phosphorylated pea protein isolate,PPPI)以及擠壓聯(lián)合磷酸化處理豌豆蛋白(extruded co-phosphorylated pea protein isolate,EPPPI)[9]。在本研究中,以巴旦木飲料為模擬體系,以SC為參照對象,通過測定飲料的粒徑、電位、流變性質(zhì)及微觀形態(tài)等指標(biāo)的變化,研究改性PPI對飲料貯藏穩(wěn)定性的影響并探究其機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巴旦木,新疆喀什西澤果業(yè)開發(fā)有限公司;風(fēng)味蛋白酶,滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司;SC、PPI[堿溶酸沉法提取,(89.80±0.20)%],西安千葉草生物科技有限公司;穩(wěn)定劑A,丹尼斯克(中國)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型),上海碧云天生物技術(shù)有限公司;尼羅紅、尼羅藍(lán),美國sigma公司。

改性PPI的處理:EPPI:調(diào)整水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)至35%,經(jīng)60、80、95、105 ℃升溫程序,喂料速度10 kg/h,螺桿轉(zhuǎn)速300 r/min條件下擠出,再將擠出物置于40 ℃恒溫烘箱中平衡水分至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%以下,冷卻至室溫,粉碎后過80目篩,貯藏備用;PPPI:豌豆蛋白體積分?jǐn)?shù)3%、三聚磷酸鈉體積分?jǐn)?shù)2%、pH值8.0、反應(yīng)時間3.5 h、溫度30 ℃,4 ℃透析72 h,凍干,過篩,貯藏備用;EPPPI:將擠壓預(yù)處理的PPI進(jìn)行磷酸化處理,擠壓和磷酸化處理條件分別同上,協(xié)同處理后樣品經(jīng)過凍干,過篩,貯藏備用。

1.2 儀器與設(shè)備

T25 digital ULTRA-TURRAX?高性能分散機,德國IKA公司;AH-2010高壓均質(zhì)機,加拿大ATS公司;GI54DWS高壓滅菌器,致微(廈門)儀器有限公司;L550臺式低速大容量離心機,湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;T9型紫外分光光度計,北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Zetasizer nano ZS納米粒度及ZETA電位儀,英國馬爾文公司;DHR-3旋轉(zhuǎn)流變儀,美國TA公司;LSM880激光共聚焦顯微鏡,德國卡爾蔡司公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 巴旦木飲料的制備

以市面上銷售的巴旦木飲料配方制備巴旦木飲料,且按照敬思群等[15]的方法并稍做修改:將脫皮的巴旦木用濕法超細(xì)粉碎機濕磨,制備得到巴旦木原漿;在巴旦木原漿中添加風(fēng)味蛋白酶酶解,得到酶解巴旦木原漿;穩(wěn)定劑A與SC經(jīng)70～75 ℃水預(yù)剪切10 min后與巴旦木原漿、酶解原漿按比例混合,再加入糖、食用鹽、小蘇打調(diào)配,混合剪切后均質(zhì),灌裝于玻璃瓶中,121 ℃滅菌20 min。

實驗組設(shè)定:第1組不添加乳化劑SC(對照組,CON組),第2組為正常配方(市售產(chǎn)品組,SC組),第3～6組為添加不同改性處理PPI的實驗組:第3組采用未改性豌豆蛋白(untreated pea protein isolate,UPPI)替代SC(UPPI組),第4組采用EPPI替代SC(EPPI組),第5組采用PPPI替代SC(PPPI組),第6組采用EPPPI替代SC(EPPPI組)。

1.3.2 飲料離心沉淀率的測定

取10.00 g飲料于離心管中,室溫下3 000 r/min離心15 min,棄去上層液體,將離心管置于烘箱干燥,稱量沉淀物質(zhì)量m,離心沉淀率的計算見公式(1)。

(1)

式中:m,離心沉淀物質(zhì)量,g。

1.3.3 飲料界面蛋白吸附率的測定

取適量制備好的巴旦木飲料測定其界面蛋白吸附率,參考CHEN等[16]的方法測定界面蛋白吸附率和界面蛋白含量。取1 mL 飲料經(jīng)12 000 r/min室溫離心30 min,此時飲料分成兩相。用1 mL注射器吸取下層液體,用BCA法測定其蛋白濃度C2。界面蛋白吸附率(adsorption rate of interface protein,AP)和界面蛋白含量(Γ)按公式(2)和公式(3)計算。

(2)

(3)

式中:ρ1和ρ2,分別為巴旦木飲料的蛋白濃度和離心后下層溶液的蛋白質(zhì)量濃度,mg/mL;φ,油相分?jǐn)?shù),%;d3,2-SDS,巴旦木飲料在10 g/L SDS中的表面積平均粒徑,μm。

1.3.4 飲料粒徑及ζ-電位的測定

采用粒徑及電位分析儀測定巴旦木飲料的粒徑及電位,設(shè)置分散質(zhì)折射率為1.492,分散相折射率為1.33。

1.3.5 飲料表觀流變性質(zhì)的測定

采用流變儀測定巴旦木飲料流變性質(zhì)。選用40 mm平板,測定黏度時剪切速率為0.1～100 s-1;應(yīng)變掃描時應(yīng)變范圍為0.1%～100%,頻率掃描時頻率范圍為0.1～100 Hz。

1.3.6 飲料微觀形態(tài)的測定

取適量制備好的巴旦木飲料測定其微觀形態(tài),按照FENG等[17]的方法并稍做修改,在1 mL巴旦木飲料中加入10 μL尼羅藍(lán)和10 μL尼羅紅,振蕩搖勻后避光染色。取8 μL染色后樣品,采用LSM880高分辨率激光共聚焦顯微鏡觀察,激發(fā)波長為488和633 nm。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均至少重復(fù)3次,數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。采用Origin 2018制作圖表,并用SPSS 25對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豌豆蛋白對飲料貯藏穩(wěn)定性的影響

圖1顯示了添加SC和不同改性處理PPI的飲料在室溫貯藏1、3、5、7、14、30 d的照片。新鮮制備的飲料均保持穩(wěn)定;貯藏3 d后CON飲料上層出現(xiàn)輕度乳析現(xiàn)象,且在貯藏5、7 d時加劇,其他組飲料保持穩(wěn)定;貯藏14 d時,CON飲料分層明顯,UPPI飲料、EPPI飲料、PPPI飲料的上層也出現(xiàn)乳析現(xiàn)象,其中乳析程度UPPI>PPPI>EPPI;貯藏30 d時,CON飲料除上層乳析嚴(yán)重外,底部還出現(xiàn)半透明的水析,UPPI飲料、EPPI飲料、PPPI飲料乳析程度加劇,SC飲料和EPPPI飲料仍保持穩(wěn)定,這可能是由于擠壓聯(lián)合磷酸化處理顯著改善了PPI的乳化性,提高了飲料的穩(wěn)定性。

a-第1天;b-第3天;c-第5天;d-第7天;e-第14天;f-第30天

2.2 豌豆蛋白對飲料離心沉淀率的影響

離心沉淀率一般可以較為直觀地反映飲料的穩(wěn)定性,離心沉淀率越小,其穩(wěn)定性就越好。如圖2所示,CON飲料的離心沉淀率最大,添加UPPI、EPPI、PPPI的飲料次之。而添加SC或EPPPI后,飲料的離心沉淀率顯著降低(P<0.05),這表明添加改性后的PPI后,巴旦木飲料體系的穩(wěn)定性在改善,且以添加EPPPI的實驗組效果最為接近SC。

圖2 添加SC和不同改性處理PPI后飲料的離心沉淀率

2.3 豌豆蛋白對飲料界面蛋白吸附率的影響

由圖3可知,添加PPI后,飲料的界面蛋白吸附率含量顯著增加(P<0.05),但仍小于使用SC作為乳化劑的飲料。在添加SC或PPI的飲料中,UPPI組的界面蛋白吸附率最低,而經(jīng)擠壓處理和磷酸化處理后,飲料界面蛋白吸附率均得到提高,且添加EPPPI的飲料界面蛋白吸附率僅比添加SC的小3.51%,這可能是由于PPI經(jīng)改性處理后,表面疏水性增大,二硫鍵含量增加,促進(jìn)了PPI在油-水界面的吸附[18],有利于形成界面膜結(jié)構(gòu)以及飲料界面蛋白吸附率的增加,從而改善體系穩(wěn)定性。

圖3 添加SC和不同改性處理PPI后飲料的界面蛋白吸附率

2.4 豌豆蛋白對飲料ζ-電位及粒徑的影響

由圖4-a可知,所有飲料的ζ-電位均為負(fù)值,表明飲料中帶負(fù)電的粒子多于帶正電的粒子,這歸因于巴旦木蛋白的等電點以及添加的穩(wěn)定劑的特性。CON飲料的ζ-電位絕對值最小,UPPI飲料次之,改性處理后,飲料ζ-電位絕對值增加。這可能與改性處理后,PPI分子表面帶電基團(tuán)發(fā)生變化有關(guān),因而導(dǎo)致了飲料體系中的液滴電位改變。添加PPI或SC后,飲料的靜電排斥力增加,飲料樣品中的懸浮顆粒更不易聚集,穩(wěn)定性得到改善。此外,隨著時間推移,所有飲料的ζ-電位絕對值出現(xiàn)不同程度的減小,與RYAN等[19]報道的趨勢類似,這可能是由于在貯藏期間飲料液滴之間發(fā)生聚集,靜電排斥力減少。但SC飲料或者EPPPI飲料的ζ-電位絕對值減小程度較小,表明SC和EPPPI對飲料穩(wěn)定性的改善效果更好。

a-ζ-電位;b-粒徑

由圖4-b可知,與CON飲料相比,添加PPI或SC的飲料粒徑顯著減小(P<0.05),且添加改性處理后的PPI的飲料粒徑均小于UPPI的飲料粒徑。此外,隨著貯藏時間的增加,飲料粒徑均有所增加,但添加改性PPI或SC的飲料粒徑仍小于CON飲料或添加UPPI的飲料粒徑,表明添加SC或改性PPI有利于抑制懸浮顆粒的聚集。這可能是因為改性處理后,PPI分子表面活性提高,促進(jìn)其在油-水界面的吸附,使其乳化活性、乳化穩(wěn)定性改善[20],且飲料液滴間靜電排斥力增大,減少飲料液滴聚集,因此改性處理后飲料貯藏穩(wěn)定性得到改善。斯托克定律指出,液滴移動的速度與其黏度成反比,與其半徑的平方和水相油相之間的密度差成正比。經(jīng)飲料粒徑及ζ-電位實驗結(jié)果可知,PPI經(jīng)改性處理后,由其制備的飲料粒徑顯著減小(P<0.05),飲料液滴間靜電排斥力增加,能夠有效改善液滴間的聚集與飲料的分層沉淀,提高體系的穩(wěn)定性。

2.5 豌豆蛋白對飲料流變性質(zhì)的影響

許多食品乳狀液的穩(wěn)定性取決于組分相的流變特性,而飲料的流變學(xué)性質(zhì)常受到油相體積分?jǐn)?shù)、液滴尺寸、電荷和膠體相互作用的影響[21]。如圖5-a所示,所有飲料樣品在測試的剪切速率范圍內(nèi)都表現(xiàn)出典型的剪切稀化行為,飲料的黏度由小到大為:CON

a-黏度隨剪切速率變化的曲線;b-應(yīng)變掃描結(jié)果;c-G′頻率掃描結(jié)果;d-G″頻率掃描結(jié)果

對飲料進(jìn)行應(yīng)變掃描,以考察其在穩(wěn)定條件下的應(yīng)變范圍,結(jié)果如圖5-b所示。SC飲料表現(xiàn)出最大的彈性模量,其次是PPPI組,但SC飲料、PPPI飲料在應(yīng)變超過1%時G′降低,表明應(yīng)變大于1%后飲料空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞,而EPPI飲料、EPPPI飲料線性黏彈區(qū)延伸,對5%以內(nèi)的應(yīng)變?nèi)员３忠欢ǖ某惺苣芰?彈性模量基本不發(fā)生變化,說明擠壓、擠壓聯(lián)合磷酸化處理的PPI可以改善飲料穩(wěn)定性,而CON飲料、UPPI飲料的G′和線性黏彈區(qū)遠(yuǎn)小于其他飲料,表明CON飲料、UPPI飲料內(nèi)部空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)不夠穩(wěn)定。為保證實驗的準(zhǔn)確性,在飲料頻率掃描時選取0.5%作為其應(yīng)變值。

為了研究飲料的黏彈性,進(jìn)行了頻率掃描測量。由圖5-c、圖5-d可知,與應(yīng)變掃描的趨勢類似,SC飲料、PPPI飲料的G′最大,其次是EPPPI飲料和EPPI飲料,最后是UPPI飲料和CON飲料。所有飲料的G′和G″都隨著頻率增加而逐漸提高,并表現(xiàn)出一定的頻率依賴性,說明飲料的空間結(jié)構(gòu)以非共價鍵交聯(lián)為主[22]。此外,在整個頻率掃描范圍內(nèi),飲料的G′明顯大于G″,表明該飲料具有凝膠狀行為并形成了強大而穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)[23]。添加改性處理后的PPI,飲料的彈性模量G′明顯增加,這可能是由于改性處理增強PPI分子間作用力,形成了一定的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),從而改善黏彈性[24],有利于液滴在飲料中懸浮,從而提高飲料的穩(wěn)定性。

2.6 豌豆蛋白對飲料微觀形態(tài)的影響

由圖6顯示了飲料第1天、第7天、第30天時的CLSM觀察結(jié)果,藍(lán)色熒光信號和紅色熒光信號分別代表經(jīng)尼羅藍(lán)染色的蛋白和尼羅紅染色的油相。第1天時,飲料粒徑差異明顯,CON飲料最大,UPPI飲料次之,且粒徑分布不均勻;PPPI飲料、EPPI飲料粒徑較小,僅有小部分液滴分布不均勻;SC飲料和EPPPI飲料液滴粒徑小、分布均勻,CLSM觀察結(jié)果與測定的粒徑結(jié)果相一致。貯藏7 d后發(fā)現(xiàn),飲料液滴均有不同程度的增加,CON飲料液滴仍明顯大于其他樣品,且其液滴粒徑分布不均勻,小油滴被吸附到大油滴表面,從而使得油相出現(xiàn)融合或聚結(jié)等不穩(wěn)定現(xiàn)象;UPPI飲料也出現(xiàn)了較為明顯的液滴聚集;PPPI飲料、EPPI飲料液滴尺寸變大,但分布較為均勻;EPPPI飲料、SC飲料液滴尺寸最小,且分布均勻,這可能是因EPPPI飲料及SC飲料具有更大的表面電荷值,液滴上的電荷會影響液滴與液滴的相互作用并防止它們相互接觸和聚集[25]。飲料液滴尺寸增大這種情況在貯藏30 d時進(jìn)一步加劇,PPPI飲料、EPPI飲料也出現(xiàn)液滴聚結(jié)或絮凝現(xiàn)象,而EPPPI飲料液滴仍分布較為均勻,其粒徑僅略大于SC飲料,這可能是因為EPPPI表面疏水性大,有利于對油滴的包裹與覆蓋,ζ-電位增加以及黏度增加,有效防止液滴聚集[26]?？傮w來說,CLSM觀察結(jié)果與貯藏穩(wěn)定性實驗的結(jié)果相一致。

a-CON飲料;b-SC飲料;c-UPPI飲料;d-PPPI飲料;e-EPPI飲料;f-EPPPI飲料

3 結(jié)論

本研究探究了不同改性處理PPI對巴旦木飲料貯藏穩(wěn)定性的影響。實驗結(jié)果表明,添加未處理或改性處理的PPI后,較為明顯地改善了飲料貯藏穩(wěn)定性,降低了離心沉淀率。同時,飲料的界面蛋白吸附率含量顯著增加,粒徑減小,黏度增加,ζ-電位絕對值增加,液滴間靜電排斥力增大,減少聚集,進(jìn)一步改善飲料貯藏穩(wěn)定性。且與常用乳化劑SC相比,EPPPI實驗組效果最為接近SC,具有替代其作為乳化劑應(yīng)用在市售巴旦木飲料中的可能性。