豇豆泡菜中產(chǎn)生物胺菌株的篩選鑒定及其產(chǎn)胺特性研究

黃巖,鮮雙,李倩,陳其青,徐飛,陳安均*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625014)2(四川李記醬菜調(diào)味品有限公司,四川 眉山,620030)

生物胺是一類廣泛存在于發(fā)酵食品中的呈堿性的低分子有機(jī)含氮有機(jī)化合物,人體過量攝入會引發(fā)各種不良反應(yīng),其中組胺的毒性最強(qiáng)[1]。游離氨基酸的脫羧作用是食品中生物胺的主要生成途徑,包括三大要素:存在游離氨基酸;存在能產(chǎn)生相應(yīng)游離氨基酸脫羧酶的微生物;適宜微生物生長繁殖及發(fā)揮酶活性的環(huán)境條件[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),食品中常見的產(chǎn)胺微生物包括:腸桿菌科、假單胞菌屬、乳酸菌、酵母菌等[3-4]。張黎明等[5]從腌魚中篩選到25株產(chǎn)生物胺菌株,分屬于腸桿菌屬、不動桿菌屬、產(chǎn)氣單胞菌屬、摩根氏菌屬、肥桿菌屬、希瓦氏菌屬、普羅威登斯菌屬和嗜鹽單胞菌屬8個種屬。泡菜作為我國代表性的傳統(tǒng)發(fā)酵制品之一,在其制作過程中,往往會由于部分微生物的作用而產(chǎn)生生物胺。唐垚等[6]從四川泡菜中篩選出11株產(chǎn)生物胺的細(xì)菌,包括解鳥氨酸拉烏爾菌、弗氏檸檬酸桿菌、特基拉芽孢桿菌和阿耶波多氏芽孢桿菌。食品中產(chǎn)胺微生物的種類及數(shù)量與生物胺含量密切相關(guān),明確泡菜中產(chǎn)胺微生物種類,通過控制其生長及產(chǎn)酶活性,對泡菜中生物胺的防控意義重大。

環(huán)境因子(pH、鹽度、溫度等)對食品中的微生物生長以及各種酶活都有明顯的影響[7]。喬娜[8]研究發(fā)現(xiàn)通過添加乳酸顯著降低pH值進(jìn)而抑制鯉魚冷藏過程中生物胺的形成,延長魚的貨架期。XIE等[9]研究了不同鹽濃度的大豆醬在自然發(fā)酵過程中生物胺的變化,發(fā)現(xiàn)生物胺含量與鹽度呈負(fù)相關(guān)。趙慶志等[10]研究了鮐魚在不同貯藏溫度下生物胺變化情況,發(fā)現(xiàn)低溫可以有效地控制生物胺的積累。

基于以上研究,本研究以傳統(tǒng)豇豆泡菜為對象,對產(chǎn)生物胺菌株進(jìn)行分離篩選及鑒定,探究菌株在不同生長環(huán)境條件下的產(chǎn)胺特性,進(jìn)而控制生物胺的形成,提高泡菜的食用安全性,為泡菜發(fā)酵過程中生物胺的防控提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)原料

新鮮豇豆及香辛料,雅安市雨城區(qū)蒼坪路農(nóng)貿(mào)市場;泡菜鹵水,實(shí)驗(yàn)室自制多輪循環(huán)使用的老壇。

1.1.2 主要試劑

NaCl、NaOH、NaHCO3、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3、鹽酸、氨水、葡萄糖、溴甲酚紫、吐溫-80、乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級),成都科隆化學(xué)品有限公司;氨基酸(色氨酸、組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸),上海生工生物工程股份有限公司;生物胺(色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺),美國西格瑪試劑公司;色譜級丹磺酰氯,上海麥克林生化科技有限公司;5′-磷酸吡哆醛,上海凜恩科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

胰蛋白胨、酵母浸粉、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基(violet red bile agar,VRBA)、MRS培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)、LB肉湯培養(yǎng)基、MRS肉湯培養(yǎng)基、YPD肉湯培養(yǎng)基,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C雷磁pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;HC-2062高速離心機(jī),安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;DNP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;DSX-30L手提式高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;HR40-IIA2生物安全柜,青島海爾特種電器有限公司;Ultimate 3000高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜制作方法

將洗凈后的新鮮豇豆晾干至表面無水氣,將純凈水煮沸后添加食鹽(60 g/L)和白糖(20 g/L)攪拌至完全溶解,冷卻至常溫。香辛料添加量以豇豆質(zhì)量為基準(zhǔn),紅辣椒20 g/kg、生姜10 g/kg、大蒜10 g/kg、花椒2 g/kg。稱取500 g豇豆,按照料液質(zhì)量比1∶4裝壇,最后加入體積分?jǐn)?shù)1%的白酒,鹽水水封后進(jìn)行發(fā)酵。

1.3.2 微生物分離純化

分別從不同發(fā)酵時期無菌操作均勻吸取25 mL泡菜發(fā)酵液,轉(zhuǎn)移至225 mL無菌生理鹽水中,制得10倍稀釋液,振蕩均勻,依次梯度稀釋得到10-7樣品稀釋液,選取適宜梯度的樣液,分別涂布于VRBA、MRS、YPD平板上,在28 ℃或37 ℃培養(yǎng)48 h后,根據(jù)菌落形態(tài)特征差異,每個平板隨機(jī)挑選3～7個單菌落進(jìn)行分離純化,連續(xù)平板劃線2～3次,確保得到純的單菌落。對單個菌株進(jìn)行編號,將純化后的菌株接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)24 h,最后保存在25%(體積分?jǐn)?shù))甘油中凍藏于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 產(chǎn)生物胺菌株的篩選

參考蒙菊[11]的方法,氨基酸肉湯培養(yǎng)基(1 L):5 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、氨基酸各5 g(色氨酸、組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸),5 g NaCl、0.06 g溴甲酚紫、1 g葡萄糖、0.2 g MgSO4·7H2O、0.05 g MnSO4·4H2O、0.04 g FeSO4·7H2O、0.1 g CaCO3、0.5 mL吐溫-80、0.05 g磷酸吡哆醛,最后用1 mol/L HCl溶液將pH調(diào)至5.3左右。

將分離純化得到的菌株活化后,分別接種于氨基酸肉湯培養(yǎng)基中,同時設(shè)立空白對照,在37 ℃溫度下培養(yǎng)48 h,觀察培養(yǎng)基顏色變化?？瞻讓φ张囵B(yǎng)基顏色呈棕色,若培養(yǎng)基呈紫色或酪氨酸沉淀消失,表示待測菌株為產(chǎn)胺陽性菌,若培養(yǎng)基呈黃色,表示待測菌株為產(chǎn)胺陰性菌。

1.3.4 產(chǎn)生物胺菌株的鑒定

將產(chǎn)生物胺陽性菌株分別接種于LB肉湯培養(yǎng)基中,于37 ℃活化培養(yǎng)24 h,10 000 r/min離心10 min獲取菌體,后送至擎科生物科技有限公司進(jìn)行提取、純化、擴(kuò)增與測序。選擇通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進(jìn)行BLAST同源性檢索,利用MEGA11進(jìn)行比對分析后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,以確定菌株種屬。

1.3.5 產(chǎn)生物胺菌株的產(chǎn)胺能力分析

將產(chǎn)生物胺陽性菌株按相同體積分?jǐn)?shù)接種于氨基酸肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)48 h,將培養(yǎng)液離心(10 000 r/min,15 min)后取上清液進(jìn)行稀釋,取1 mL稀釋液利用高效液相色譜儀進(jìn)行生物胺含量測定。生物胺測定方法參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測定》及翟鳳梅等[12]的方法,并稍作修改。

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

首先分別將6種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品(色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺)用0.1 moL/L HCl溶液配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,再將標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液混合配制為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。將標(biāo)準(zhǔn)混合使用液分別稀釋為2.5、5、10、15、25、50 mg/L的生物胺混標(biāo)使用液,對生物胺混標(biāo)使用液進(jìn)行衍生化后上機(jī)測定,制得生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5.2 樣品衍生化

取1 mL待測樣品稀釋液,依次加入200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL飽和NaHCO3溶液、2.0 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL),在40 ℃水浴條件下暗反應(yīng)45 min,然后加入100 μL的氨水終止衍生化反應(yīng),最后用乙腈定容至5 mL,過孔徑為0.22 μm的有機(jī)系濾膜于進(jìn)樣瓶中,利用高效液相色譜儀進(jìn)行分析檢測。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱:Sepax HP C18;流動相A超純水;流動相B乙腈;流速0.8 mL/min;紫外檢測波長254 nm;柱溫35 ℃;進(jìn)樣量20 μL;采用梯度洗脫,洗脫程序共35 min,包括5個階段,在0～15 min,A流動相體積分?jǐn)?shù)由30%降為25%,B流動相體積分?jǐn)?shù)則由70%上升到75%;在15～20 min,A流動相體積分?jǐn)?shù)由25%降至20%,B流動相體積分?jǐn)?shù)則由75%上升到80%;在20～25 min,A流動相體積分?jǐn)?shù)由20%降至10%,B流動相體積分?jǐn)?shù)則由80%上升到90%;在25～28 min,A流動相體積分?jǐn)?shù)由10%升至25%,B流動相體積分?jǐn)?shù)則由90%降到75%;在28～35 min,A流動相體積分?jǐn)?shù)由25%升至40%,B流動相體積分?jǐn)?shù)則由75%降到60%。

1.3.6 環(huán)境因子對生物胺菌株產(chǎn)胺能力的影響

根據(jù)泡菜發(fā)酵工藝結(jié)合微生物生長條件,設(shè)置具有不同梯度pH值(3.5、4.5、5.5和6.5)、鹽度(20、40、60和80 g/L)和溫度(10、20、28和37 ℃)的氨基酸肉湯培養(yǎng)基,將具有代表性的高產(chǎn)胺菌株活化后,取1 mL菌懸液按照體積分?jǐn)?shù)10%接種至氨基酸肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃(溫度梯度組除外)靜置培養(yǎng)48 h,對培養(yǎng)液進(jìn)行離心稀釋后待測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016對試驗(yàn)數(shù)據(jù)均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算,利用SPSS 26對試驗(yàn)數(shù)據(jù)間的顯著性進(jìn)行分析,顯著水平為P<0.05,使用Origin 2021進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜中產(chǎn)生物胺菌株的分離篩選

如圖1所示,在泡菜發(fā)酵過程中,經(jīng)分離純化后得到77株菌株,包括43株乳酸菌、26株腸桿菌和8株酵母菌。將菌株活化后分別接種于氨基酸肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,觀察培養(yǎng)基顏色變化,呈紫色為產(chǎn)胺陽性菌株。經(jīng)過初步篩選,發(fā)現(xiàn)共26株細(xì)菌具有形成生物胺的能力,包括20株腸桿菌和6株乳酸菌。

圖1 氨基酸肉湯培養(yǎng)基顯色結(jié)果

2.2 泡菜中產(chǎn)生物胺菌株的鑒定

利用16S rRNA基因測序技術(shù)對初篩得到的26株產(chǎn)生物胺陽性菌進(jìn)行鑒定,26株菌株分別屬于8個不同種屬,其中包括10株腸桿菌(Enterobactersp.)、4株克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、2株勒克氏菌(Leclerciasp.)、2株萊略特菌(Lelliottiasp.)、1株假檸檬酸鹽桿菌(Pseudocitrobactersp.)、1株泛菌(Pantoeasp.)、5株魏斯氏菌(Weissellasp.)、1株乳桿菌(Lactiplantibacillussp.),選擇不同種屬的代表菌株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建,如圖2所示。相關(guān)研究表明,腸桿菌是四川泡菜中中除乳酸菌株外數(shù)量最多的細(xì)菌,也是發(fā)酵蔬菜中常見的產(chǎn)生物胺菌屬[13-14]。

圖2 產(chǎn)胺菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 產(chǎn)生物胺菌株產(chǎn)胺能力分析

2.3.1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖及線性回歸方程

圖3是生物胺混合標(biāo)品HPLC色譜峰圖,可以看出6種生物胺在35 min內(nèi)可以得到很好的分離,每個峰形都是獨(dú)立且對稱的,基線平穩(wěn)無拖尾現(xiàn)象,說明樣品中的生物胺可在此方法下進(jìn)行良好的分離檢測。

1-色胺;2-腐胺;3-尸胺;4-組胺;5-酪胺;6-亞精胺

以峰面積(y)為縱坐標(biāo),生物胺標(biāo)品濃度(x)為橫坐標(biāo)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制,具體信息如表1所示,6種生物胺在2.5～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與濃度之間具有良好的線性關(guān)系,且相關(guān)系數(shù)都高于0.999 5,表明此方法可以有效地對樣品中的6種生物胺進(jìn)行測定。

表1 生物胺標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.3.2 產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺含量檢測結(jié)果

將初篩得到的26株產(chǎn)胺陽性菌株分別接種于5 g/L的氨基酸肉湯培養(yǎng)基于37 ℃下培養(yǎng)48 h,利用高效液相色譜儀對培養(yǎng)液中的生物胺進(jìn)行檢測,具體結(jié)果如表2所示。可以發(fā)現(xiàn),篩得的菌株以產(chǎn)腐胺和尸胺為主,具有產(chǎn)生物胺能力的乳酸菌產(chǎn)總胺含量均低于10 mg/L,而20株腸桿菌的生物胺產(chǎn)量均超過了1 000 mg/L,其中C7菌株產(chǎn)胺能力最強(qiáng),產(chǎn)胺量高達(dá)7 400.13 mg/L,且是唯一具有產(chǎn)組胺能力的菌株。這與相關(guān)研究結(jié)果類似,蒙菊[11]對分離自發(fā)酵酸魚中的腸桿菌、乳酸菌和葡萄球菌的產(chǎn)胺性能進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)腸桿菌的產(chǎn)生物胺活性遠(yuǎn)強(qiáng)于其他菌株。李梅等[15]研究發(fā)現(xiàn),腐胺和尸胺是四川泡菜中的含量最高的2種生物胺。因此,對于生物胺的防控來說,雖然在整個泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌數(shù)量占有絕對優(yōu)勢,但在發(fā)酵初期占一定優(yōu)勢的腸桿菌才是對生物胺積累有重要貢獻(xiàn)的菌群[16],因此選擇5株(C3、C6、C7、C16、C19)具有代表性的高產(chǎn)胺腸桿菌菌株作進(jìn)一步研究,其中C6株和C19株為腸桿菌屬,C3、C7、C16為克雷伯氏菌屬。圖4為部分菌株生物胺測定色譜峰圖。

表2 菌株產(chǎn)生物胺能力的測定結(jié)果

a-C3;b-C6;c-C7;d-C16;e-C19

2.4 環(huán)境因子對產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺能力的影響

在泡菜發(fā)酵過程中,多種因素共同決定了生物胺含量的高低,包括前體游離氨基酸含量、產(chǎn)胺微生物種類與數(shù)量、微生物生長與產(chǎn)胺環(huán)境條件等。環(huán)境條件對產(chǎn)胺微生物生長及產(chǎn)酶活性影響明顯,不同環(huán)境條件下產(chǎn)胺菌株的產(chǎn)胺能力有很大的差別。為了具體探究泡菜中產(chǎn)胺菌株在不同生長環(huán)境下的產(chǎn)胺特性,共挑選了5株高產(chǎn)胺腸桿菌菌株在不同pH、鹽度和溫度下分別進(jìn)行培養(yǎng),對培養(yǎng)液中生物胺含量進(jìn)行了分析。

2.4.1 pH對產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺能力的影響

pH值高低決定了泡菜發(fā)酵過程中微生物菌群的組成結(jié)構(gòu),根據(jù)泡菜發(fā)酵過程中pH值變化情況,設(shè)置了3.5、4.5、5.5、6.5四個pH梯度,以探究pH值對產(chǎn)生物胺菌株產(chǎn)胺能力的影響。如圖5所示,5株菌株在pH 4.5或pH 5.5時產(chǎn)胺量最高,這可能是由于在較低pH環(huán)境下,產(chǎn)胺菌株生長受到抑制,誘導(dǎo)其分泌氨基酸脫羧酶對游離氨基酸進(jìn)行脫羧反應(yīng),生成呈堿性的生物胺以抵抗低酸環(huán)境對菌株自身生長造成的影響[17]。而較高pH環(huán)境會導(dǎo)致對應(yīng)氨基酸脫羧酶基因表達(dá)量降低,過低的pH值會嚴(yán)重影響菌株生長繁殖以及酶活性。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

除了C7株外,其他4株菌在pH 3.5時幾乎沒有生物胺產(chǎn)生,說明低pH值對生物胺的形成有很大影響,低pH可強(qiáng)烈抑制菌株形成生物胺。因此,在泡菜發(fā)酵過程中可以考慮外源添加有機(jī)酸或接種優(yōu)良發(fā)酵劑以快速降低泡菜發(fā)酵體系的pH值,減少生物胺的積累[18-19]。

2.4.2 鹽度對產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺能力的影響

鹽度是泡菜發(fā)酵過程中的重要理化指標(biāo),不僅可決定泡菜口感和風(fēng)味,還會影響微生物的生長代謝[20]。由圖6可知,腐胺和組胺的含量隨鹽度的升高而明顯減少,鹽度對于腐胺和組胺的形成有強(qiáng)烈的抑制作用,當(dāng)鹽度升高至80 g/L時,幾乎無腐胺和組胺產(chǎn)生,這一研究結(jié)果與呂佳良[21]的結(jié)論相似。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

尸胺的產(chǎn)量受鹽度的影響則相對較小,C3菌株在20 g/L和40 g/L鹽度下的尸胺產(chǎn)量未表現(xiàn)出較為明顯的差異,而C7株、C16株和C19株在鹽度提高至60 g/L時,其尸胺產(chǎn)量都未出現(xiàn)明顯降低,這可能是由于負(fù)責(zé)形成尸胺的賴氨酸脫羧酶的分子結(jié)構(gòu)對Na+的耐受性更高而導(dǎo)致的,Na+可以作用于氨基酸脫羧酶的肽鍵,通過破壞酶分子結(jié)構(gòu)而使其酶活性降低[22]。所以只有將鹽濃度控制在80 g/L及以上時,才能整體上最大程度地減少生物胺的積累。

2.4.3 溫度對產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺能力的影響

溫度是泡菜發(fā)酵過程中影響微生物生長和酶活的關(guān)鍵環(huán)境因子之一。如圖7所示,不同菌株產(chǎn)生物胺含量受溫度影響程度不同,同一菌株在產(chǎn)生不同種類生物胺時受溫度影響也不同。其中,大部分產(chǎn)胺菌株的鳥氨酸脫羧酶及組氨酸脫羧酶活性受溫度影響較為明顯,與10 ℃相比,提高發(fā)酵溫度增加了腐胺和組胺的生成量。而菌株產(chǎn)尸胺能力受溫度的影響則較低,在10 ℃時已經(jīng)具備較強(qiáng)的產(chǎn)胺能力,而C7菌株更是有著比其他溫度下更強(qiáng)的產(chǎn)尸胺能力,可能是由于賴氨酸脫羧酶在較低溫度下就能夠發(fā)揮足夠的活性。有研究也證明了這一現(xiàn)象,CVETKOVI等[23]發(fā)現(xiàn)較高溫度可以加快發(fā)酵甘藍(lán)中生物胺的積累,且對腐胺和組胺的形成更為顯著。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以傳統(tǒng)四川泡菜為原料,利用氨基酸肉湯培養(yǎng)基從泡菜發(fā)酵過程中篩選得到26株產(chǎn)胺菌株,利用16S rRNA基因技術(shù),結(jié)合NCBI進(jìn)行同源性搜索比對,鑒定26株來自于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、勒克氏菌屬、假檸檬酸鹽桿菌屬、萊略特菌屬、泛菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬共8個屬。利用高效液相色譜對菌株的產(chǎn)生物胺能力分析,發(fā)現(xiàn)腸桿菌具有很強(qiáng)的產(chǎn)胺能力,主要產(chǎn)胺種類為腐胺和尸胺,腐胺、尸胺和組胺最高生成量分別達(dá)到了4 829.67、2 987.84和2 212.52 mg/L。對其中高產(chǎn)胺菌株產(chǎn)胺特性研究發(fā)現(xiàn),pH值和鹽度可以顯著降低生物胺含量,菌株產(chǎn)胺能力受溫度影響相對較小,當(dāng)pH為3.5或鹽度為80 g/L時,大部分菌株基本無法產(chǎn)生物胺。相比較而言,鳥氨酸脫羧酶對pH、鹽度和溫度都比較敏感,組氨酸脫羧酶則對鹽度更為敏感,而賴氨酸脫羧酶則對pH更敏感。

以上研究結(jié)果為控制四川泡菜中生物胺的積累提供了一定理論參考,但鑒于不同菌株對環(huán)境的抗逆性存在差異性,要更好地達(dá)到限制泡菜中生物胺的目的,不能只依靠單一的因素對產(chǎn)胺菌株進(jìn)行限制,還應(yīng)當(dāng)考慮添加更多的柵欄因子共同作用,如具有抑菌作用的香辛料、優(yōu)良發(fā)酵劑及胺氧化酶等。