雙歧桿菌源亞油酸異構(gòu)酶的原核表達(dá)及功能分析

嵇熠彬,梅永超,楊波,陳海琴

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無(wú)錫,214122)

共軛亞油酸(conjugated linoleic acid, CLA)是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱,是亞油酸(linoleic acid, LA)的立體和幾何異構(gòu)體[1]。其中,c9,t11-CLA和t10,c12-CLA等2種單體獲得了美國(guó)食品和藥物管理局安全認(rèn)證,大量研究證明CLA具有抗癌、預(yù)防心血管疾病、改善炎癥等功能[2-3],但是不同的單體具有不同的生理活性。c9,t11-CLA可以抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng),誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡,具有抗癌、改善炎癥等生理功能[2-3],而t10,c12-CLA具有減少脂質(zhì)積累的作用[4],并且t10,c12-CLA在某些動(dòng)物模型中會(huì)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、乳腺腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以及子宮癌細(xì)胞生長(zhǎng)等[5-6]。無(wú)論是為了研究不同CLA單體的生理功能,還是為了滿足特定的生理需求,獲得CLA單體都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

來(lái)源于短雙歧桿菌的亞油酸異構(gòu)酶(Bifidobacteriumbreveisomerase, BBI)是目前唯一已知的乳酸菌源的單酶轉(zhuǎn)化LA生成c9,t11-CLA的亞油酸異構(gòu)酶[7]。不同于植物乳桿菌中的多組分酶系,需經(jīng)水合、脫水、移位等5步反應(yīng)生成c9,t11-CLA[8-9],BBI可以經(jīng)單步反應(yīng)轉(zhuǎn)化LA生成c9,t11-CLA[7]。有研究表明,短雙歧桿菌CCFM683是一株具有較高CLA生物轉(zhuǎn)化能力的雙歧桿菌,不僅可以轉(zhuǎn)化LA生成c9,t11-CLA(轉(zhuǎn)化率高達(dá)90.3%),還可以轉(zhuǎn)化α-亞麻酸(α-linolenic acid, ALA)和γ-亞麻酸(γ-linolenic acid, GLA)生成相應(yīng)的共軛亞麻酸(conjugated linolenic acid, CLNA)[7]。

然而,短雙歧桿菌作為一種嚴(yán)格厭氧菌,對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求極為嚴(yán)苛;培養(yǎng)基成分復(fù)雜,培養(yǎng)成本昂貴,較難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)[10-11]。因此,實(shí)現(xiàn)BBI在合適宿主中的表達(dá)不僅具有工業(yè)化生產(chǎn)c9,t11-CLA的潛力,還有助于獲得一定量的純化蛋白來(lái)研究BBI的結(jié)構(gòu)與功能。大腸桿菌作為優(yōu)良的表達(dá)宿主,具有生長(zhǎng)速度快、培養(yǎng)成本低廉、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于目的基因的異源表達(dá)和工業(yè)化生產(chǎn)[12-13]。根據(jù)重組蛋白的不同表達(dá)需求特性,生物技術(shù)公司開(kāi)發(fā)了一系列商業(yè)化大腸桿菌宿主,如E.coliBL21(DE3)-pLysS菌株,它是在E.coliBL21(DE3)菌株的基礎(chǔ)上加入了可以表達(dá)T7溶菌酶的基因,能在不影響目的基因表達(dá)的同時(shí)降低背景表達(dá)水平,因此適用于表達(dá)某些對(duì)宿主有危害的重組蛋白;E.coliRosetta(DE3)菌株則補(bǔ)充了大腸桿菌中的6種稀有密碼子對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)RNA,它可以顯著提高外源基因的表達(dá)水平。

此外,目的蛋白異源表達(dá)時(shí)可以引入標(biāo)簽,組氨酸標(biāo)簽作為一種分子質(zhì)量小、對(duì)蛋白分泌、折疊影響較小的蛋白標(biāo)簽,一方面便于檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)量,另一方面也可以作為純化標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)快速純化[14]。盡管有上述優(yōu)勢(shì),但組氨酸標(biāo)簽添加的位置會(huì)對(duì)部分目的蛋白的表達(dá)量和活性產(chǎn)生重大影響,標(biāo)簽位置是目的蛋白異源表達(dá)時(shí)必須要考慮的影響因素之一[15]。

因此,本研究采用大腸桿菌作為表達(dá)宿主,將來(lái)源于短雙歧桿菌CCFM683的亞油酸異構(gòu)酶bbi基因在3種類型的大腸桿菌宿主中進(jìn)行異源表達(dá),通過(guò)改變標(biāo)簽位置、優(yōu)化蛋白表達(dá)條件,實(shí)現(xiàn)BBI蛋白的異源表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,初步探究了BBI對(duì)不同脂肪酸底物的偏好性,同時(shí)利用分子對(duì)接技術(shù)解釋其潛在的原因,這為進(jìn)一步揭示BBI的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定了研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21/pET-28a(+)-His-bbi、E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-His-bbi、E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliRosetta/pET-28a(+)-His-bbi,現(xiàn)保藏于江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心菌種庫(kù)。

1.1.2 試劑

異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG),上海生工生物工程公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒,碧云天生物技術(shù)公司;酸洗玻璃珠,美國(guó)BioSpec公司;LA(純度≥99%)、內(nèi)標(biāo)十五烷酸(C15∶0),Sigma-Aldrich公司;重氮甲烷、2.0 mol/L己烷溶液,百靈威科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及主要試劑配制

Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基(g/L):NaCl 10,胰蛋白胨10,酵母提取物5。

磷酸鹽破碎緩沖液(mg/L):KH2PO4901.9,K2HPO4587.422,pH=6.5。

LA母液(30 mg/mL):300 mg LA,20 mg吐溫-80加水定容至10 mL,充分乳化后用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃保存。ALA和GLA以同樣的方式進(jìn)行配制。

卡那霉素(100 mg/mL):1 g卡那霉素加水定容至10 mL,混合溶解后用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃保存。

氯霉素(34 mg/mL):340 mg氯霉素加無(wú)水乙醇定容至10 mL,充分溶解后用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌,-20 ℃保存。

十五烷酸內(nèi)標(biāo)(2 mg/mL):100 mg十五烷酸加正己烷定容至50 mL,充分溶解后分裝,-20 ℃保存。

1.1.4 儀器與設(shè)備

Trace 1300氣相色譜儀,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;組織破碎儀,寧波新芝生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)

將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的重組菌進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng),在含不同抗生素的LB平板上劃線培養(yǎng)至單菌落產(chǎn)生,挑取單菌落至5 mL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),以1%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至20 mL LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至OD600在0.6～0.8之間,添加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為0.2 mmol/L后16 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)。誘導(dǎo)結(jié)束后經(jīng)8 000×g離心5 min,收集菌體,保存于-80 ℃冰箱中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

IPTG濃度優(yōu)化:在不同濃度的IPTG(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L)下,重組菌于16 ℃誘導(dǎo)8 h,測(cè)定酶活力以確定IPTG的最佳濃度。

1.2.3 BBI活性檢測(cè)

KPB緩沖液重懸菌體,加入等體積的酸洗玻璃珠,通過(guò)組織破碎儀進(jìn)行破碎,提取粗蛋白用于活性檢測(cè)。取1 mg破碎的粗蛋白,加入10 μL LA母液定容至1 mL,于37 ℃、200 r/min反應(yīng)2 h,待反應(yīng)結(jié)束通過(guò)重氮甲烷甲酯化,利用氣相色譜法進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)[16]。

氣相色譜條件:初始溫度150 ℃,以5 ℃/min升溫至200 ℃,保持10 min;以4 ℃/min升溫至240 ℃,保持10 min。載氣He,進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度保持在240 ℃[17]。

BBI的粗酶活性檢測(cè)指標(biāo)為共軛脂肪酸的轉(zhuǎn)化率,即LA轉(zhuǎn)化生成CLA,LNA轉(zhuǎn)化生成CLNA的轉(zhuǎn)化率。CLA轉(zhuǎn)化率和CLNA轉(zhuǎn)化率的計(jì)算如公式(1)和公式(2)所示:

(1)

(2)

1.2.4 BBI序列信息分析及分子對(duì)接

使用ExPASy(http://www.expasy.ch/tools/)分析蛋白的基本理化性質(zhì)。利用RoseTTAFold(https://www.rosettacommol/Lmmol/Lol/Lons.org/software/servers#rosie)構(gòu)建BBI的三維結(jié)構(gòu)模型,從ZinC數(shù)據(jù)庫(kù)獲得LA、ALA和GLA的三維結(jié)構(gòu),使用拉氏圖提供的信息對(duì)蛋白模型進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。使用AutoDock 4.2軟件以構(gòu)建的BBI蛋白模型為受體,將3種脂肪酸分別作為配體進(jìn)行分子對(duì)接,對(duì)接參數(shù)采用默認(rèn)設(shè)置。

其中：是狀態(tài)向量；是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的量測(cè)輸出；是神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的估計(jì)輸出；是干擾輸入；；是連接權(quán)矩陣；是具有適當(dāng)維數(shù)的常數(shù)矩陣；是常數(shù)輸入；是初始條件，變時(shí)滯滿足，是已知常數(shù)；是神經(jīng)元的激活函數(shù)，滿足

2 結(jié)果與分析

2.1 BBI序列信息分析

2.1.1 BBI蛋白的理化性質(zhì)分析

使用ExPASy軟件分析顯示,BBI蛋白由330個(gè)氨基酸組成,理論分子質(zhì)量為37.18 kDa,分子式為C1753H2591N419O442S18,理論等電點(diǎn)8.63。該蛋白由20種氨基酸組成,其中含量最豐富的氨基酸為丙氨酸(占10.9%),含量最少的是組氨酸(占1.5%),帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)為16,帶正電荷的殘基總數(shù)為21。BBI的脂肪系數(shù)為98.76,親水系數(shù)為0.482,是疏水蛋白,其不穩(wěn)定指數(shù)為26.36,說(shuō)明其為穩(wěn)定蛋白。結(jié)合BBI在原始短雙歧桿菌CCFM683中為膜結(jié)合蛋白這一推測(cè),它在異源表達(dá)過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)量低或者重組蛋白無(wú)活性等情況[7]。

圖1 BBI蛋白的氨基酸組成

2.1.2 BBI蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與建模

BBI作為新發(fā)現(xiàn)的膜結(jié)合型亞油酸異構(gòu)酶,與已知結(jié)構(gòu)的蛋白同源性低,利用RoseTTAFold的從頭建模方式模擬其三維結(jié)構(gòu),結(jié)果見(jiàn)圖2-a。一個(gè)合理的模型構(gòu)象落在不允許區(qū)域的氨基酸殘基數(shù)目在總蛋白中的占比應(yīng)低于5%。由其構(gòu)象評(píng)估由圖2-b可知,BBI蛋白內(nèi)部92.9%的氨基酸殘基位于最適區(qū)域(紅色),0.3%的氨基酸殘基位于不允許區(qū)域(白色),所以構(gòu)建的模型結(jié)構(gòu)是合理的。β2腎上腺素能受體中有7段α螺旋,一部分形成了識(shí)別底物的底物結(jié)合口袋,另一部分接觸底物并形成不同構(gòu)象[18]。BBI蛋白分子中47.58%的氨基酸殘基處于α螺旋區(qū)域,其余肽鏈則以無(wú)規(guī)則卷曲和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)連接著10段α螺旋,這些螺旋不是完全筆直的,其中1/3的螺旋中存在著不利于螺旋形成的脯氨酸,形成略微彎折的螺旋結(jié)構(gòu),BBI整體呈桶狀,其結(jié)構(gòu)與β2腎上腺素能受體結(jié)構(gòu)相似,與底物結(jié)合的方式也可能相近。

2.2 組氨酸標(biāo)簽位置和不同大腸桿菌宿主對(duì)BBI粗酶活性的影響

2.2.1 組氨酸標(biāo)簽位置對(duì)BBI粗酶活性的影響

組氨酸標(biāo)簽作為一個(gè)分子質(zhì)量較小的常見(jiàn)標(biāo)簽,其仍會(huì)對(duì)目的蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。ESEN等[15]在研究甲酸脫氫酶(Chaetomiumthermophilumformate dehydrogenase,CtFDH)時(shí)發(fā)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽位于C端時(shí)CtFDH的比酶活力是其位于N端時(shí)的3倍。朱圣花[19]在研究重組人釉原蛋白(recombinant human amelogenin,rhAm)時(shí)發(fā)現(xiàn),當(dāng)組氨酸標(biāo)簽位于C端時(shí)rhAm完全不表達(dá),將其添加到N端時(shí)rhAm表達(dá)能力變強(qiáng)。因此,為確定組氨酸標(biāo)簽位置對(duì)BBI異源表達(dá)的影響,本文構(gòu)建了組氨酸標(biāo)簽分別位于N端和C端的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-His-bbi和pET-28a(+)-bbi-His,將其轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中。由圖3中E.coliBL21(黑色)可知,與空載對(duì)照相比,2株BBI大腸桿菌重組菌均具有轉(zhuǎn)化LA至CLA的能力,說(shuō)明目的基因成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中的異源表達(dá)。BBI在E.coliBL21(DE3)中表達(dá)時(shí),組氨酸標(biāo)簽位于BBI的C端時(shí)CLA轉(zhuǎn)化率(73.7%)明顯高于其位于N端時(shí)CLA轉(zhuǎn)化率(7.9%),組氨酸標(biāo)簽位于BBI的N端時(shí)可能影響了BBI蛋白的表達(dá)和酶活力。馬君燕等[20]發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆孢克魯維酵母外切菊粉酶的C端可能具有促進(jìn)酶和底物結(jié)合作用,加上組氨酸標(biāo)簽后影響其結(jié)合,從而影響酶的催化活性。由圖2-a可知,BBI蛋白分子中9段α螺旋共同構(gòu)成一個(gè)“桶”,形成一個(gè)空腔,若將組氨酸標(biāo)簽添加到N端可能對(duì)這個(gè)空腔的構(gòu)象產(chǎn)生影響,進(jìn)而影響底物與活性位點(diǎn)的結(jié)合。

圖3 不同大腸桿菌重組菌的轉(zhuǎn)化率

2.2.2 不同大腸桿菌宿主對(duì)BBI粗酶活性的影響

利用原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行異源表達(dá)時(shí)需要考慮很多因素,包括選擇合適的宿主、構(gòu)建合適的重組質(zhì)粒以及優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件等。職韶陽(yáng)等[21]在表達(dá)鳶尾素(irisin)時(shí)發(fā)現(xiàn)E.coliRosetta-irisin較E.coliBL21-irisin的表達(dá)量提高了2.3倍。因此,為探究不同類型的大腸桿菌表達(dá)宿主對(duì)BBI的影響,本研究將已獲得的2個(gè)重組載體在E.coliBL21、E.coliBL21-pLysS和E.coliRosetta中分別進(jìn)行表達(dá),共6個(gè)重組菌。由圖3可知,在3個(gè)大腸桿菌表達(dá)宿主中,組氨酸標(biāo)簽位于N端的粗酶活性均明顯弱于組氨酸標(biāo)簽位于C端時(shí)。同時(shí),重組質(zhì)粒pET-28a(+)-bbi-His分別在3個(gè)宿主中進(jìn)行表達(dá)時(shí),E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His(86.96%)和E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His(86.11%)這2種類型的大腸桿菌宿主中的粗酶活性略高于其在E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His(73.69%)中的活性。因此,選取重組菌株E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His、E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His作為后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的出發(fā)菌株。

2.3 BBI誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

IPTG作為強(qiáng)誘導(dǎo)劑,不能被菌體所代謝且具有一定的細(xì)胞毒性,影響菌體的生長(zhǎng)和蛋白的表達(dá)。誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)短會(huì)導(dǎo)致目的蛋白無(wú)法大量表達(dá),而誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則可能會(huì)因?yàn)榫w衰亡釋放有毒物質(zhì),從而導(dǎo)致目的蛋白降解或者活性減弱。因此,本研究對(duì)誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了單因素優(yōu)化,通過(guò)BBI粗酶活性檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

本研究考察了誘導(dǎo)劑IPTG的濃度對(duì)BBI表達(dá)的影響,結(jié)果如圖4-a所示,IPTG濃度在0.2～1.0 mmol/L之間時(shí),E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His粗酶活性隨著誘導(dǎo)劑濃度增加略微增強(qiáng),且粗酶活性高于其他2株重組菌[E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His]。綜合考慮粗酶活性及實(shí)驗(yàn)成本,將E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His和E.coliBL21 pLysS/pET-28a(+)-bbi-His的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度定為1.0 mmol/L,將E.coliBL21/pET-28a(+)-bbi-His的IPTG最佳誘導(dǎo)濃度定為0.6 mmol/L。

a-誘導(dǎo)劑IPTG濃度;b-誘導(dǎo)時(shí)間

本研究進(jìn)一步考察了誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BBI表達(dá)的影響,結(jié)果如圖4-b所示,在4～8 h內(nèi),BBI的粗酶活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高;在8～24 h內(nèi),BBI的粗酶活性隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低,因此最佳誘導(dǎo)時(shí)間為8 h。

綜上所述,BBI的最佳表達(dá)條件為E.coliRosetta/pET-28a(+)-bbi-His菌株以1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)8 h。

2.4 BBI對(duì)不同脂肪酸底物的偏好性分析

短雙歧桿菌CCFM683不僅可以轉(zhuǎn)化LA生成CLA,還可以轉(zhuǎn)化LNA生成CLNA[7]。本文為探究BBI對(duì)于不同游離脂肪酸的偏好性,以ALA、GLA和LA為底物測(cè)定轉(zhuǎn)化率。如圖5所示,BBI粗酶對(duì)ALA的利用能力最高,可達(dá)63.54%,其次為L(zhǎng)A,對(duì)GLA的利用能力最弱,僅為20.15%,這與BBI在短雙歧桿菌CCFM683中的表現(xiàn)出來(lái)的偏好性一致。因此,相較于LA和GLA,BBI粗酶更偏好轉(zhuǎn)化ALA。

圖5 BBI粗酶對(duì)不同脂肪酸底物的轉(zhuǎn)化率

通過(guò)AutoDock軟件將組氨酸標(biāo)簽位于BBI的C端的重組蛋白和3種底物(ALA、GLA和LA)分別進(jìn)行對(duì)接。選取了蛋白與底物的最佳復(fù)合結(jié)果,計(jì)算其結(jié)合自由能。ALA、GLA和LA對(duì)應(yīng)的結(jié)合自由能分別為-31.51、-30.17和-31.80 kJ/mol,均形成了2個(gè)氫鍵而無(wú)其他作用力。在分子對(duì)接中,結(jié)合自由能越低則構(gòu)象越穩(wěn)定,與蛋白質(zhì)結(jié)合力越強(qiáng)。一般認(rèn)為,結(jié)合自由能>-16.74 kJ/mol結(jié)合力極弱或無(wú)結(jié)合能力;-29.29 kJ/mol<結(jié)合自由能≤-16.74 kJ/mol結(jié)合力中等;結(jié)合自由能≤-29.29 kJ/mol結(jié)合力較強(qiáng)。因此,這3種底物與BBI的結(jié)合力均較強(qiáng),且三者的結(jié)合自由能相差不大,缺乏晶體結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)信息,對(duì)接結(jié)果可能存在誤差。同時(shí),由圖6可知,這3種底物都與Arg243形成氫鍵,推測(cè)其為BBI結(jié)合位點(diǎn)之一;由圖2-a(紅色殘基)可知,Arg243位于9段α螺旋形成的空腔內(nèi),與之前組氨酸標(biāo)簽位于N端時(shí)影響B(tài)BI與底物的結(jié)合推測(cè)一致。

a-LA;b-ALA;c-GLA

3 結(jié)論

c9,t11-CLA具有許多重要的生理功能,目前市售的CLA為多種同分異構(gòu)體的混合物。BBI是目前唯一已知的乳酸菌來(lái)源的的單酶轉(zhuǎn)化生成c9,t11-CLA的亞油酸異構(gòu)酶,具有很好的應(yīng)用前景。前期研究發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌CCFM683只能在生長(zhǎng)過(guò)程中轉(zhuǎn)化LA,其靜息細(xì)胞不具備轉(zhuǎn)化能力,同時(shí)BBI經(jīng)預(yù)測(cè)為九次跨膜蛋白,在短雙歧桿菌CCFM683中的表達(dá)量極低,為了解決這個(gè)問(wèn)題,對(duì)BBI進(jìn)行異源表達(dá)和優(yōu)化重組表達(dá)條件勢(shì)在必行[7]。

本研究在3種類型的大腸桿菌宿主中實(shí)現(xiàn)了BBI的異源表達(dá),并且探究了組氨酸標(biāo)簽位于C端和N端時(shí)對(duì)粗酶活性的影響,在此基礎(chǔ)上,通過(guò)對(duì)誘導(dǎo)劑IPTG的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,確定了組氨酸標(biāo)簽位于C端的重組質(zhì)粒在E.coliRosetta中進(jìn)行表達(dá),并以1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8 h,BBI的粗酶活性最高。在最佳誘導(dǎo)條件下,初步探究了BBI對(duì)不同底物的偏好性,確定了其對(duì)ALA的利用能力最強(qiáng),其次為L(zhǎng)A,最后是GLA。通過(guò)分子對(duì)接技術(shù),確定了BBI與底物的潛在結(jié)合位點(diǎn)Arg243位于空腔內(nèi),這與組氨酸位于目的蛋白N端時(shí)粗酶活性明顯較低這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。綜上,本研究為進(jìn)一步研究BBI的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定基礎(chǔ)。