結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床分期的相關(guān)性及對手術(shù)治療預(yù)后的指導(dǎo)價值探究

孫 兵,岳世國

孫兵,岳世國,金華市中醫(yī)醫(yī)院外二科 浙江省金華市 321017

0 引言

結(jié)腸癌為臨床常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來,受人口老齡化趨勢、國民飲食習(xí)慣及結(jié)構(gòu)改變等影響,其發(fā)病率不斷攀高,且以每年4.2%速率遞增[1-3].結(jié)腸癌惡性程度較高,病理特征是影響其治療決策及預(yù)后的重要因素[4,5],因此,探究影響結(jié)腸癌病理特征的分子標(biāo)志物尤為關(guān)鍵.微小RNA(miRNA)作為一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA,不僅在正常細胞生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用,還參與調(diào)控腫瘤細胞增殖、分化及凋亡等過程[6-8].相關(guān)研究指出,miR-302b-3p在結(jié)腸癌中表達過低,可能扮演抑癌基因角色[9],但關(guān)于其與病理特征及預(yù)后關(guān)系的研究并不常見.長鏈非編碼RNA(LncRNA)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類RNA分子,可作為分子海綿體與染色質(zhì)修飾因子或miRNA相結(jié)合,調(diào)控靶基因表達[10,11].研究指出,LncRNA母系印記基因3(MEG3)在卵巢癌、胰腺癌及腎上腺癌等多種腫瘤細胞中表達缺失,可能發(fā)揮抑癌基因功能[12,13].LncRNA MEG3、miR-302b-3p均為抑癌基因,關(guān)于二者在惡性腫瘤中是否存在協(xié)同效應(yīng)尚無研究.基于此,本研究觀察結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,探究其與臨床分期的關(guān)系及對預(yù)后的指導(dǎo)價值,并分析其交互作用對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的影響,旨在為結(jié)腸癌治療提供參考.

1 材料和方法

1.1 材料 選取2017-01/2022-03金華市中醫(yī)醫(yī)院97例結(jié)腸癌患者,其中男55例,女42例,年齡43-77(62.87±5.25)歲.入組標(biāo)準(zhǔn): 納入標(biāo)準(zhǔn): 均符合結(jié)腸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[14],并經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實;年齡＞18歲,既往無腫瘤相關(guān)治療史;知情、同意本研究.排除標(biāo)準(zhǔn): 合并其他惡性腫瘤者;轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌者;結(jié)腸多原發(fā)癌或息肉、結(jié)腸轉(zhuǎn)移癌、腺瘤樣結(jié)腸癌者;伴有心、腎或肝等重要器官功能障礙者;合并免疫或血液系統(tǒng)疾病者;伴有潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病等結(jié)腸疾病者;合并新冠肺炎者;因疫情封控或其他原因中斷隨訪者.

1.2 方法 LncRNA MEG3、miR-302b-3p檢測: 取術(shù)中切除結(jié)腸癌組織及癌旁組織標(biāo)本,以熒光定量PCR法檢測,Trizol法提取細胞總RNA,反轉(zhuǎn)獲取cDNA,上機進行PCR檢測,反應(yīng)條件設(shè)置為: 預(yù)變性95 ℃、2 min,變性95℃、30 s,退火60 ℃、30 s,延伸72 ℃、30 s,循環(huán)40次.比較閾值法定量分析數(shù)據(jù),LncRNA MEG3、miR-302b-3p分別以GAPDH、U6為內(nèi)參基因,檢測基因相對表達量=2-ΔΔCt.

結(jié)腸癌治療及預(yù)后: 97例結(jié)腸癌患者均接受根治性手術(shù)治療,并進行為期1年隨訪,隨訪方式為門診復(fù)查,3個月/次,隨訪終點為腫瘤復(fù)發(fā),針對疑似復(fù)發(fā)腫瘤進行穿刺活檢,確認是否復(fù)發(fā).根據(jù)結(jié)腸癌患者1年內(nèi)復(fù)發(fā)情況判定預(yù)后.1.3 觀察指標(biāo) 觀察比較不同組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關(guān)性;比較不同LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達患者復(fù)發(fā)情況,分析結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)影響因素,評價LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達對結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值.

統(tǒng)計學(xué)處理SPSS 23.0分析,計量資料用(mean±SD)表示,t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,兩兩比較用LSD-t檢驗,計數(shù)資料用n(%)表示,卡方檢驗,卡普蘭-邁耶曲線(K-M)比較不同LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達患者復(fù)發(fā)情況,采用Cox回歸模型分析復(fù)發(fā)影響因素,相乘、相加模型分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的影響,繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達對結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價值.P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達 結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均低于癌旁組織(P＜0.05).表1.

表1 不同組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達比較(mean±SD)

2.2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關(guān)性 對LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征進行相關(guān)性分析顯示,結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與性別、年齡、腫瘤大小無關(guān)(P＞0.05),與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05).表2.

表2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與臨床病理特征的相關(guān)性

2.3 復(fù)發(fā)情況 結(jié)腸癌患者以中位值為界,分為高表達組與低表達組,結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3、miR-302b-3p高表達組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率分別為2.70%(1/37)、5.00%(2/40),分別低于LncRNA MEG3、miR-302b-3p低表達組20.00%(12/60)、19.30%(11/57),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).圖1.

圖1 無復(fù)發(fā)K-M曲線.K-M曲線: 卡普蘭-梅爾曲線.

2.4 復(fù)發(fā)相關(guān)因素的Cox分析 以結(jié)腸癌患者1年內(nèi)復(fù)發(fā)為因變量,分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為自變量,賦值(表3),進行Cox回歸分析,結(jié)果顯示,分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均為結(jié)腸癌復(fù)發(fā)危險因素,癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均為結(jié)腸癌復(fù)發(fā)保護因素(P＜0.05).表4.

表3 賦值量表

表4 復(fù)發(fā)相關(guān)因素的Cox分析

2.5 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的影響

2.5.1 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的影響: 以結(jié)腸癌復(fù)發(fā)為因變量,將LncRNA MEG3、miR-302b-3p及二者乘積作為自變量納入回歸方程,構(gòu)建模型1、模型2.校正混雜因素后發(fā)現(xiàn),LncRNA MEG3、miR-302b-3p均對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)有影響(P＜0.05);LncRNA MEG3與miR-302b-3p間并無相乘交互效應(yīng),差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05).表5.

表5 相乘交互作用

2.5.2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p交互作用對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的影響: 以LncRNA MEG3＜中位值、miR-302b-3p＜中位值為暴露,否則為非暴露.LncRNA MEG3、miR-302b-3p同時暴露的協(xié)同效應(yīng)是LncRNA MEG3或miR-302b-3p單純暴露產(chǎn)生效應(yīng)的15.888倍,且二者同時暴露時,結(jié)腸癌復(fù)發(fā)風(fēng)險中有56.98%歸因于二者協(xié)同作用.表6.

2.6 LncRNA MEG3、miR-302b-3p對結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的預(yù)測價值 以癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為源數(shù)據(jù),結(jié)腸癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)為陽性,未復(fù)發(fā)為陰性,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,LncRNA MEG3、m i R-302b-3p預(yù)測結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)的曲線下面積(area under the curve,AUC)(95%CI)分別為0.720(0.620-0.807)、0.767(0.670-0.847),二者聯(lián)合預(yù)測AUC(95%CI)為0.892(0.813-0.946),明顯高于LncRNA MEG3、miR-302b-3p單獨預(yù)測,最佳敏感度及特異度分別為92.31%、83.33%.圖2.

圖2 LncRNA MEG3、miR-302b-3p預(yù)測結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的ROC曲線. ROC曲線: 受試者工作特征曲線.

3 討論

miRNA表達異?？烧T發(fā)腫瘤等多種疾病,隨著生物信息技術(shù)不斷優(yōu)化,miRNA成為腫瘤治療靶點.迄今為止,已發(fā)現(xiàn)500多個人類基因組中的miRNA廣泛參與惡性腫瘤發(fā)生、腫瘤細胞增殖及凋亡等病理生理過程[15,16].研究顯示,部分miRNA發(fā)揮抑癌基因作用,其在腫瘤細胞或組織中表達缺失或低表達,調(diào)控miRNA表達為腫瘤治療新方向[17,18].本研究中結(jié)腸癌組織miR-302b-3p表達低于癌旁組織,提示miR-302b-3p可能為結(jié)腸癌抑癌基因.相關(guān)功能學(xué)分析指出,miR-302b-3p可通過與ERBB4的3’-非編碼區(qū)域結(jié)合,致使ERBB4表達下調(diào),從而影響細胞增殖、侵襲,并加速凋亡進程,發(fā)揮抑癌基因作用[19,20].在一項miR-302b在結(jié)腸癌組織的研究中顯示,miR-302b在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者中表達顯著低于分化較好、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移患者[21].進一步研究顯示,miR-302b-3p表達與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05),提示結(jié)腸癌患者癌組織miR-302b-3p表達與病理特征有關(guān),miR-302b-3p表達下調(diào)預(yù)示著更強的腫瘤侵襲性,推測可作為結(jié)腸癌預(yù)后預(yù)測指標(biāo).

LncRNA作為繼miRNA后發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA,同樣在人類疾病中發(fā)揮至關(guān)重要作用,尤其是在腫瘤發(fā)生、演變過程中扮演重要角色[22].LncRNA調(diào)控基因表達涉及表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后三個層面,主要通過轉(zhuǎn)錄激活、染色體修飾及干擾等方式調(diào)控[23,24].作為首個被發(fā)現(xiàn)具有腫瘤抑制作用的LncRNA,MEG3在人體正常組織中表達較高,特別是在腦垂體中表達最高,但在多種腫瘤細胞系中表達較少或缺乏[25].既往文獻表明,LncRNA MEG3可促使細胞循環(huán)停滯,對腫瘤細胞增殖及侵襲行為發(fā)揮抑制作用,并可促進腫瘤細胞凋亡,阻礙腫瘤的發(fā)生[26].現(xiàn)階段,臨床認為LncRNA MEG3發(fā)揮抑癌作用的途徑較多,其中DNA甲基化、影響血管新生、p53途徑及Rb途徑等已經(jīng)研究證實,致使LncRNA MEG3基因沉默或表達下調(diào),造成正常細胞增殖異常發(fā)生癌變[27,28].有學(xué)者指出,結(jié)腸癌患者癌組織LncRNA MEG3表達明顯下調(diào)[29,30],與本研究結(jié)果一致,充分說明其在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌基因作用,且本研究中LncRNA MEG3表達與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05),提示LncRNA MEG3表達與結(jié)腸癌患者病理特征有關(guān),而病理特征是影響患者預(yù)后的重要因素,因此,本研究認為LncRNA MEG3表達可能與結(jié)腸癌患者預(yù)后有關(guān).

本研究中結(jié)腸癌組織中LncRNA MEG3、miR-302b-3p高表達組1年內(nèi)復(fù)發(fā)率分別低于LncRNA MEG3、miR-302b-3p低表達組,且Cox回歸分析顯示,癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均為結(jié)腸癌復(fù)發(fā)保護因素,提示LncRNA MEG3、miR-302b-3p可能是結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的重要預(yù)測指標(biāo).此外,本研究還顯示,LncRNA MEG3與miR-302b-3p存在交互作用,可增加結(jié)腸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險,推測LncRNA MEG3可通過miR-302b-3p促進結(jié)腸癌增殖、侵襲和遷移,從而參與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程,但其具體機制不明,有待臨床進一步研究證實.基于LncRNA MEG3、miR-302b-3p對結(jié)腸癌預(yù)后的交互作用,以癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達為源數(shù)據(jù),結(jié)腸癌患者術(shù)后1年內(nèi)復(fù)發(fā)為陽性,未復(fù)發(fā)為陰性,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示二者聯(lián)合預(yù)測AUC最大,為0.892,最佳敏感度及特異度分別為92.31%、83.33%,具有良好預(yù)測效能.

4 結(jié)論

綜上所述,結(jié)腸癌患者癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達下調(diào),與臨床分期有關(guān),臨床檢測其表達可用于明確腫瘤惡性程度、預(yù)測手術(shù)治療預(yù)后,為臨床后續(xù)治療方案調(diào)整提供參考依據(jù).但本研究尚存在一定不足,受限于科研經(jīng)費等問題,未進行長期隨訪,且缺乏細胞實驗、動物實驗,有待臨床日后延長隨訪時間,增設(shè)細胞實驗及動物實驗,進一步證實二者協(xié)同效應(yīng)對預(yù)后的影響.

文章亮點

實驗背景

結(jié)直腸癌發(fā)病率高,病程惡化快,僅通過常規(guī)篩查較難早發(fā)現(xiàn)早治療,長非編碼RNA與微小RNA在腫瘤的不同時期都會發(fā)生表達變化,適宜早發(fā)現(xiàn),對患者的治療和預(yù)后均有一定影響.

實驗動機

在結(jié)腸癌中miR-302b-3p表達較低,LncRNA母系印記基因3(MEG3)在卵巢癌、胰腺癌及腎上腺癌等多種腫瘤細胞中表達缺失,表明這兩種RNA與癌癥的發(fā)生與發(fā)展有著一定的聯(lián)系.

實驗?zāi)繕?biāo)

miR-302b-3p與LncRNA MEG3均與癌癥的抑制有較大的關(guān)系,但是在結(jié)直腸癌的不同臨床分期以及手術(shù)預(yù)后中是否存在差異性,且二者是否在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng),對結(jié)直腸癌患者的診斷具有重要意義.

實驗方法

通過經(jīng)典的分子檢測方法對癌癥患者的組織樣本進行核酸提取和檢測,分析表達的差異性,并對術(shù)后患者進行定期隨訪,了解預(yù)后情況.

實驗結(jié)果

結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達均低于癌旁組織,結(jié)腸癌組織LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達與分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),二者聯(lián)合預(yù)測曲線下面積(95%CI)明顯高于LncRNA MEG3、miR-302b-3p單獨預(yù)測.

實驗結(jié)論

結(jié)腸癌患者癌的LncRNA MEG3、miR-302b-3p表達,與臨床分期有一定的關(guān)系,可作為判斷癌癥惡性進展和預(yù)測手術(shù)治療預(yù)后的檢測標(biāo)志物,為臨床的治療提供參考.

展望前景

LncRNA MEG3、miR-302b-3p在結(jié)直腸癌患者中同時檢測可以更靈敏發(fā)現(xiàn)臨床分期.但是本研究仍存在一定的缺陷,如長期隨訪時間較短,缺少臨床前實驗的支持等.接下來重點補充臨床前實驗的事實和數(shù)據(jù),以期更好地驗證說明LncRNA MEG3、miR-302b-3p在結(jié)直腸癌分期檢測中的重要性.