基于數(shù)據(jù)挖掘探究苦蕎對胰腺癌的作用機制

常子惠，尼瑪央宗，黃海皎，拉巴扎西，高小麗，田朋佳，尹中江

（西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學院農(nóng)業(yè)研究所，西藏 拉薩 850000）

苦蕎麥Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn.為1年生草本植物，隸屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），原產(chǎn)于中國西南地區(qū)高寒地帶，現(xiàn)我國西北、西南、東北、華北都有種植。苦蕎是藥食同源的小宗雜糧作物，富含黃酮類物質(zhì)，其中蘆丁含量占黃酮含量的80%～90%［1］，而黃酮類物質(zhì)因其廣泛的降糖、降壓、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性一直是研究的熱點［2］，蘆丁更是被廣泛報道其抗腫瘤活性，具有廣闊的抗腫瘤前景［3］。胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）作為消化系統(tǒng)中的惡性腫瘤之一，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)往往就已是晚期，只能采用化學療法和放射療法進行治療，不僅完全治愈的可能不大，而且還有極大的副作用，因此，胰腺癌的早期篩查和預防就顯得十分重要。目前有不少與苦蕎抗腫瘤相關的報道，夏翱文［4］就報道過miRNA-877-3p 介導苦蕎黃酮抗胰腺癌的活性作用研究，可見苦蕎對抗擊胰腺癌有一定的效果。

利用網(wǎng)絡藥理學方法可以將藥物潛在靶點與疾病靶點相互聯(lián)系起來，從而揭示藥物活性成分、疾病及相關信號通路之間的互作關系。分子對接以受體特性以及受體與藥物分子之間相互作用方式為依據(jù)，通過計算機技術(shù)進行模擬對接，可以展現(xiàn)配體和受體分子在結(jié)合過程中的構(gòu)象變化。由于在線的TCMSP 數(shù)據(jù)庫中未包括苦蕎的化學成分信息，因此，利用文獻檢索方法確定苦蕎化學成分，通過化合物CAS 號在TCMSP 數(shù)據(jù)庫查詢潛在的藥物作用靶點，實施網(wǎng)絡藥理學分析與分子對接，預測苦蕎對胰腺癌的作用機制。

結(jié)合西藏蕎麥目前的研究及育種工作，根據(jù)國內(nèi)研究發(fā)展趨勢，立足自身條件，針對當前存在的許多基礎薄弱環(huán)節(jié)、研究不足等問題，從當前不同需求出發(fā)，制訂初、中、高級目標，解決制約產(chǎn)量穩(wěn)定提升的問題，并選育出高黃酮含量的品種（系），以滿足不同使用需求，加快符合西藏農(nóng)業(yè)發(fā)展新需求，及時解決新問題。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫平臺

本研究采用的數(shù)據(jù)庫平臺見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫平臺

1.2 方法

1.2.1 檢索化合物潛在的靶點與胰腺癌相關靶點

利用文獻查找到苦蕎化合物的成分信息，通過化合物的CAS 號可在TCMSP 中獲得化合物的MOLID、潛在的作用靶點及相關基因名［5］，再將得到的靶點與Uniport 數(shù)據(jù)庫比對進行g(shù)ene 名稱標準化。在GeneCards數(shù)據(jù)庫可獲得胰腺癌相關靶點的gene 名稱［6］，將化合物靶點和疾病相關靶點取交集分析，得到的交集靶點信息可分析苦蕎對胰腺癌的拮抗機制。

1.2.2 靶標蛋白互相作用核心網(wǎng)絡的構(gòu)建

將所得的公共靶基因在STRING 數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡分析，隱藏游離靶點，蛋白互作分值設為0.4，導出TSV 格式文件，導入Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡［7］。

1.2.3 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡

利用Cytoscape 3.7.1軟件對化合物、靶點、通路信息進行化合物-靶點-通路網(wǎng)絡的構(gòu)建。

1.2.4 靶點通路分析

運用R 語言ClusterProfiler 包對交集靶點進行GO 功能富集分析，可獲得交集靶點生物過程（Biological process，BP）、細胞組成（Cell composition，CC）、分子功能（Molecular function，MF）信息，以p＜0.05 加以篩選，繪制各類別排名前10 的GO 條目柱狀圖及KEGG前20條信號通路氣泡圖。

1.2.5 分子對接

使用Cytoscape 3.7.1軟件對構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡進行分析，根據(jù)蛋白互作網(wǎng)絡分析結(jié)果選擇degree 值靠前的靶點蛋白和化合物-靶點-通路網(wǎng)絡中degree 值靠前的化合物為分子對接對象。分別從PDB 數(shù)據(jù)庫和Pub-Chem 數(shù)據(jù)庫下載上述篩選出的靶點蛋白及關鍵化合物的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和化合物結(jié)構(gòu)文件，利用CB-Dock網(wǎng)絡平臺對靶點與化合物進行對接［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦蕎的活性成分

以1.2.1 方法搜集苦蕎的活性成分，主要活性化合物為黃酮類物質(zhì)，基本信息見表2。

表2 苦蕎活性成分的基本信息

2.2 苦蕎與胰腺癌的相關靶點

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫對篩選的8 個活性成分進行靶點預測，共得到319 個靶點，去除重復值后共得到162 個靶點。此外，在GeneCards 數(shù)據(jù)庫檢索得到14403 個PC 靶點。在Venny 2.1 在線工具平臺繪制162 個苦蕎靶點和14403 個PC 靶點韋恩圖，共得到156個共同靶點（圖1）。

圖1 苦蕎與胰腺癌靶點韋恩圖

2.3 靶標蛋白互相作用核心網(wǎng)絡

將苦蕎與PC 的156 個公共靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫進行PPI 網(wǎng)絡分析，獲得化合物靶標蛋白互作核心網(wǎng)絡數(shù)據(jù)。為了更直觀表示蛋白互作核心網(wǎng)絡關系，該數(shù)據(jù)用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡圖（圖2）。去除游離靶點后該網(wǎng)絡共有153 個節(jié)點，2648 條邊，其中，節(jié)點大小、顏色深淺代表degree 的大小。結(jié)果表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1（degree=104）、腫瘤壞死因子TNF（degree=100）、細胞腫瘤抗原p53（TP53，degree= 99）、白細胞介素-6（IL6，degree= 96）、血管內(nèi)皮生長因子VEGFA（degree= 91）、白細胞介素-1（IL-1B，degree= 89）、胱天蛋白酶3（CASP3，degree= 87）、表皮生長因子受體EGFR（degree= 85）這8 個靶點可能是苦蕎活性物質(zhì)與PC相互作用的關鍵靶點。

圖2 苦蕎與胰腺癌交集基因PPI網(wǎng)絡

2.4 GO分析和KEGG通路分析

用1.2.4方法對苦蕎與PC 的156個交集靶點做GO 和KEGG 富集分析。GO 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有1685個生物過程（BP）、71個細胞組成（CC）、176個分子功能（MF）條目（圖3）。156個靶點主要富集在脂多糖的響應、細菌源分子的響應、活性氧代謝過程、細胞對化學壓力的反應等生物過程；在細胞組成方面，主要富集在膜筏、膜微域、膜區(qū)域、等離子膜筏等；在分子功能方面體現(xiàn)在DNA 結(jié)合型轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等。

圖3 GO功能富集

KEGG 富集分析結(jié)果得到198 個通路，對其中前20 條通路（p＜0.05）做可視化分析，結(jié)果顯示，苦蕎與PC 的交集靶點主要富集在脂質(zhì)和動脈硬化、乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、PI3K-Akt 信號通路等（圖4）。

圖4 KEGG通路

2.5 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡

156 個公共靶點、苦蕎8 個化合物、KEGG 前20條通路用Cytoscape 軟件進行Network Analyze 分析，獲得化合物-靶點-通路網(wǎng)絡關系圖。結(jié)果表明，共有184 個節(jié)點，746 條邊（圖5）?？嗍w中MOL000098 槲皮素（degree=119）、MOL000422 山奈酚（degree=45）、MOL000472 大黃素（degree=27）、MOL006505 表兒茶素（degree=23）、MOL000415 蘆?。╠egree=16）、MOL000558 傘形花內(nèi)酯（degree=9）等成分與交集靶點間有較高的關聯(lián)度。

圖5 化合物-靶點-通路網(wǎng)絡

2.6 分子對接分析

選取2.3 分析結(jié)果中的8 個靶點蛋白（AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR）和2.5 分析結(jié)果中的5 個化合物（槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素、蘆丁）進行分子對接。靶點與配體之間的結(jié)合用Vina分值評價，得分小于0說明蛋白和化合物可以結(jié)合，得分越低靶點與配體之間結(jié)合越容易。對接結(jié)果顯示，苦蕎化學成分與上述靶點蛋白都具有良好的結(jié)合作用（圖6），效果最好的是蘆丁與IL6之間的分子對接（圖7）。

圖6 核心靶點與化合物的對接數(shù)值

圖7 蘆丁與IL6分子對接示例

3 討論

胰腺癌也稱“萬癌之王”，發(fā)現(xiàn)時多半已發(fā)展為晚期，病程進展快，治療效果差，預后差，總的5年生存率僅5%～9%。胰腺癌在病理上具有普遍異質(zhì)性，針對這一復雜疾病的精準診療手段目前仍不足，這是導致其預后不良的主要原因［9］。因此，早期的疾病精準診療和日常預防就顯得尤為重要。而苦蕎中含有豐富的黃酮類成分，并且是天然蘆丁的重要來源，在蘆丁的多種活性功能中，其抗腫瘤活性作用被廣泛研究。已有研究報道蘆丁能促進癌細胞的凋亡，從而抑制癌細胞的生長［10］。此外，苦蕎中的槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素等也具有多種生物活性。槲皮素被報道具有較強的抗氧化、抗炎和抗增殖性質(zhì)，且與雷公藤甲素的配伍對肺癌和食管癌細胞均有抗癌增效作用，并均呈現(xiàn)出良好的量效關系，具有良好的抗腫瘤前景［11］；山奈酚具有抗癌、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、疾病預防、抗炎等活性，對預防心血管疾病和損傷組織保護等有良好的藥理活性［12］；大黃素已被證明具有抗腫瘤作用，有研究表明大黃素主要通過促進細胞凋亡、抑制細胞增殖、抑制血管生成、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等起到抑制胰腺癌的作用［13］；表兒茶素也具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等活性，且槲皮素和表兒茶素聯(lián)用對炎癥相關性結(jié)腸癌、大腸腺癌等具有協(xié)同作用，可以起到良好的抑制效果［14-15］。本研究采用網(wǎng)絡藥理學和分子對接方法對苦蕎抑制胰腺癌的機制做了預測，得出苦蕎活性成分對胰腺癌的抑制主要與其活性成分影響AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR等介質(zhì)的表達有關。

通過分析交集靶點PPI 網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)，AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR 等關鍵靶點，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶AKT1被確定在胰腺癌等多種腫瘤中發(fā)揮致癌基因作用［16］；TNF為重要的炎癥細胞因子，可以激活巨噬細胞、間質(zhì)細胞及編碼炎癥相關細胞因子基因的啟動子，誘發(fā)炎癥反應［17］；其中TP53基因編碼包含轉(zhuǎn)錄激活、DNA結(jié)合和寡聚結(jié)構(gòu)域的蛋白，該蛋白參與多種細胞應激反應，調(diào)節(jié)靶基因的表達，從而誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老、DNA 修復或代謝改變，并根據(jù)生理環(huán)境和細胞類型誘導生長停滯或凋亡［18］；IL-6 是一種功能廣泛的多效性細胞因子，可調(diào)節(jié)多種細胞的生長與分化，具有調(diào)節(jié)免疫應答、急性期反應及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用［19］；VEGFA 可促進新生血管形成和使血管通透性增加，具有促進血管通透性增加、細胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖和血管形成等作用［20］；IL-1B 作為一個重要的炎癥介質(zhì)，能夠參與多種細胞活動，包括細胞增殖、分化和凋亡，有研究報道IL-1B 可以促進移植小鼠和人腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，包括肉瘤、黑色素瘤、胰腺導管腺癌、骨髓瘤和乳腺癌。最重要的是，IL-1B 及其受體也已被證明是間充質(zhì)和上皮細胞原發(fā)性癌變和轉(zhuǎn)移的重要驅(qū)動因素。在胰腺癌模型中發(fā)現(xiàn)IL-1B 是結(jié)締組織增生反應的重要驅(qū)動因素。腫瘤產(chǎn)生的IL-1B 激活了TME 中的星狀細胞，并誘導TAM 介導的免疫抑制、Th17 侵襲和結(jié)締組織增生。阻斷IL-1B 可增強抗PD-1 免疫治療的抗腫瘤活性。因此，在胰腺癌模型中，IL-1B 在結(jié)締組織反應和免疫逃避的協(xié)調(diào)中是至關重要的［21］。CASP3 為細胞凋亡途徑中最為關鍵的酶類之一，是細胞凋亡檢測的重要指標，參與執(zhí)行細胞凋亡的caspase的激活［22］。

本研究基于網(wǎng)絡藥理學及分子模擬對接的方法，以苦蕎活性成分為研究對象，綜合分析其干預胰腺癌的生物學途徑及通路，并用反向分子對接進行驗證，得出苦蕎主要活性成分槲皮素、山奈酚、大黃素、表兒茶素、蘆丁可能通過作用于AKT1、TNF、TP53、IL6、VEGFA、IL1B、CASP3、EGFR 等靶點調(diào)控脂質(zhì)和動脈硬化、乙型肝炎、人類巨細胞病毒感染、PI3K-Akt 信號通路，從而抑制促炎因子的釋放以減輕機體炎癥反應，同時調(diào)控細胞凋亡程序，抑制癌細胞擴散，從而起到對胰腺癌的防治作用。該機制主要呈現(xiàn)多分子、多靶點、多通路的特點，各成分間存在協(xié)同效應。

本研究結(jié)果僅是一種理論上的作用機制的探討，且數(shù)據(jù)挖掘主要依靠網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫，主要對苦蕎的黃酮類成分做了分析，其他化學成分是否也有活性未嘗得知，預測結(jié)論可能有一定偏差，后續(xù)還需進一步驗證苦蕎活性成分對胰腺癌的作用機制。

苦蕎作為藥食同源作物，在食品方面形式多樣，口味豐富，苦蕎食品、飲品的開發(fā)十分廣泛，藥品開發(fā)只注重其單一提取物的運用，如生物類黃酮散、生物類黃酮軟膏等產(chǎn)品，這顯得苦蕎藥用產(chǎn)品的開發(fā)比較局限，未能使其藥用價值完全發(fā)揮。因此，在利用苦蕎進行產(chǎn)品開發(fā)時應注重其各成分間協(xié)同增效的相互作用，才能發(fā)揮其最大價值。目前西藏蕎麥育種工作中苦蕎麥的培育主要以總黃酮含量穩(wěn)定>2%的品種（系）為主，在此標準下蘆丁含量能達到總黃酮的80%～90%，也為苦蕎麥的開發(fā)利用提供了支持保障。該研究以文獻分析為導向，旨在提升與促進西藏蕎麥綜合研究與實際應用工作。