云上黑山羊產(chǎn)羔性狀分子變異KASP驗證分析

朱蘭,歐陽依娜,趙小紅,王鵬,蘭蓉*

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,云南 昆明 650224; 2.云南立新羊業(yè)有限公司,云南 彌勒 652300; 3.云南省種羊繁育推廣中心,云南 尋甸 655200)

繁殖性狀關(guān)系到畜禽生產(chǎn)效率的高低,因此一直是家畜育種中重要的選育指標。云上黑山羊作為肉用黑山羊新品種,具有優(yōu)良的繁殖性狀[1],對這一優(yōu)良性狀相關(guān)分子基礎(chǔ)的研究是云上黑山羊高繁品系培育的前提。近年來的相關(guān)研究找到一些與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)的基因或變異位點[2],但經(jīng)過重復(fù)驗證的位點或基因還較少?；诖?本研究選取前期全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)研究中與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀存在潛在或顯著關(guān)聯(lián)的位點,應(yīng)用準確性和經(jīng)濟性都很高的競爭性等位基因特異性PCR(KASP)檢測方法,進行位點關(guān)聯(lián)性重復(fù)驗證,以期為云上黑山羊產(chǎn)羔性狀基因組選擇提供可靠檢測位點或基因。

1 材料方法

1.1 實驗材料

實驗樣本192個,來自云南立新羊業(yè)有限公司和云南省種羊繁育推廣中心云上黑山羊核心群母羊。頸靜脈采血,EDTA抗凝,4 ℃保存。根據(jù)5個SNP位點側(cè)翼序列設(shè)計引物,信息見表1。

表1 KASP檢測引物序列

1.2 實驗試劑及儀器

KASP試劑盒及引物合成均由LGC公司提供,去RNA酶水來自天根公司。實驗在產(chǎn)自英國 LGC 公司的SNPline基因分型平臺完成。

1.3 測定記錄指標

記錄場號、羊號、初產(chǎn)年度、初產(chǎn)季節(jié)、初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)、經(jīng)產(chǎn)胎次、經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù),并計算平均產(chǎn)羔數(shù)。

1.4 實驗方法

KASP檢測流程如圖1所示。應(yīng)用Primer 5軟件,根據(jù)位點上下50 bp序列設(shè)計引物,帶有兩種通用標簽并連接SNP位點的兩條正向引物和一條反向引物構(gòu)成引物混合液(Primer Mix),帶有不同熒光信號的檢測引物構(gòu)成主引物混合液(Master Mix)。PCR反應(yīng)包括三個階段,如圖2所示。每個PCR反應(yīng)包括:終濃度為5～50 ng模板2.5 μL、2×Master Mix 2.5 μL、Primer Mix 0.07 μL、2.5 μL去RNA酶水。三個階段PCR反應(yīng)程序具體如表2所示。

圖1 KASP實驗流程圖

圖2 KASP分型PCR反應(yīng)流程圖

表2 三個階段PCR反應(yīng)程序

1.5 數(shù)據(jù)掃描

PCR結(jié)束后,取出孔板,參照《ABI 7900HT Fast Real-Time PCR System 實驗操作規(guī)程》進行數(shù)據(jù)掃描,輸出位點多態(tài)性檢測圖譜。

1.6 數(shù)據(jù)分析方法

1.6.1遺傳多樣性分析

應(yīng)用GenAlEx 6.501軟件進行等位基因頻率、遺傳多樣性參數(shù)的計算,并進行 Hardy-Weinberg平衡檢驗。

1.6.2產(chǎn)羔性狀相關(guān)因素分析

應(yīng)用SAS 9.0的GLM過程分析5個位點多態(tài)性對初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均產(chǎn)羔數(shù)的影響,并對顯著相關(guān)位點的不同基因型進行最小二乘分析,采用一般線性模型如下:

y=Xβ+ZKγK+e

注:y為表型向量,Xβ為固定效應(yīng),ZKγK為待檢驗標記效應(yīng),e為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 遺傳多態(tài)性分析結(jié)果

KASP技術(shù)對192個樣本5個SNP位點平均檢出率為99.06%,多態(tài)性檢測圖譜層次清晰(圖3),5個位點均存在多態(tài)性,并計算各位點等位基因頻率(圖4);由表3可見,位點rs268244272和rs642265755處于Hardy-Weinberg不平衡(P<0.01),其他3個位點處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P>0.05),位點rs268244272在云上黑山羊群體中為低度多態(tài)性(PIC<0.25),其余4個位點均為中度多態(tài)性(0.25

圖3 5個位點多態(tài)性檢測圖譜

圖4 5個位點等位基因頻率

表3 5個位點遺傳多樣性參數(shù)

2.2 產(chǎn)羔性狀影響因素分析結(jié)果

2.2.1產(chǎn)羔性狀GLM分析結(jié)果

由表4可見,位點rs268244272對初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)影響極顯著(P<0.01),對平均胎產(chǎn)羔數(shù)影響顯著(P<0.05),其余4個位點對產(chǎn)羔性狀影響不顯著(P>0.05)。

表4 5個位點對產(chǎn)羔性狀影響的GLM分析

2.2.2顯著關(guān)聯(lián)位點產(chǎn)羔性狀最小二乘分析結(jié)果

位點rs268244272存在3種基因型:TT、CC和TC型。最小二乘分析表明(表5),TT型初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)最小二乘均數(shù)極顯著高于TC型(P<0.01),而平均胎產(chǎn)羔數(shù)TT型也顯著高于TC型(P<0.05)。

表5 位點rs268244272不同基因型產(chǎn)羔性狀最小二乘均數(shù)

3 討論

KASP(競爭性等位基因特異性PCR)技術(shù)是目前最為經(jīng)濟快速靈活的基因分型手段,全球各大種業(yè)公司均采用 KASP 技術(shù)進行基因分析研究[3],目前已經(jīng)發(fā)表了兩千多篇文獻,是一項成熟可靠的分型產(chǎn)品,對少量位點的檢測較其他分型技術(shù)更能顯現(xiàn)保證準確率而降低成本的優(yōu)越性。本研究5個位點192個樣本的KASP分型成功率在99%以上,檢測圖譜堿基分層清晰(圖3),每個位點均檢出多態(tài)性,說明KASP分型技術(shù)有效,所獲數(shù)據(jù)可以用于后續(xù)分析。

初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均胎產(chǎn)羔數(shù)是云上黑山羊繁殖性狀的主要選育指標,長期以來受人工選擇的強度較大。而本研究位點多態(tài)性與產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示,位點rs268244272與云上黑山羊初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)和平均胎產(chǎn)羔數(shù)均存在顯著關(guān)聯(lián),并且這個位點處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài),PIC值低于0.25,有效等位基因數(shù)僅為1.3,表明這一位點受到較強的人工選擇,表現(xiàn)出較低遺傳變異。這一結(jié)果與朱蘭等的研究結(jié)果基本一致[4],一方面再次驗證位點rs268244272與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀存在顯著關(guān)聯(lián),rs268244272作為云上黑山羊繁殖性狀選擇的分子標記較為可靠;另一方面為云上黑山羊繁殖性狀的選育成效提供了分子依據(jù),也說明通過長期的人工選育,云上黑山羊繁殖性狀關(guān)聯(lián)位點不斷純合。

4 結(jié)論

位點rs268244272與云上黑山羊初產(chǎn)產(chǎn)羔數(shù)極顯著相關(guān)(P<0.01),與平均胎產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05),再次驗證與云上黑山羊產(chǎn)羔性狀關(guān)聯(lián)的有效性,該位點可作為云上黑山羊產(chǎn)羔性狀分子標記。