蜜生假絲酵母LGL-2 發(fā)酵油菜蜂花粉酵素工藝優(yōu)化及品質(zhì)評(píng)價(jià)

廖 湘，鄧俊霞，白衛(wèi)東，肖更生，賴秋萍，王 宏,*，劉功良,*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510225；2.廣東桂嶺蜂業(yè)科技股份公司，廣東梅州 514199）

蜂花粉是蜜蜂從蜜粉源植物花蕊內(nèi)采集的花粉粒與其自身腺體分泌物加工而成的一種混合物，富含豐富的酚類化合物，具有降血脂、促進(jìn)免疫和抗菌等活性[1-2]。此外，植物來(lái)源和地理位置不同的蜂花粉組分不同，有報(bào)道表明可通過(guò)酚類化合物的組成辨別蜂花粉的植物來(lái)源和地理位置[3]。油菜蜂花粉外觀為淡黃色，多呈長(zhǎng)球形或圓球形，是中國(guó)目前產(chǎn)量占比最高的蜂花粉，同時(shí)也是中國(guó)開(kāi)發(fā)利用最多的蜂花粉品種[4-5]，具有較好的開(kāi)發(fā)基礎(chǔ)。

近年來(lái)，酵素產(chǎn)品越來(lái)越受消費(fèi)者歡迎。食品原料經(jīng)發(fā)酵制備成食用酵素，不僅可以提高食品原料的活性成分，而且還能賦予特殊的發(fā)酵香氣[6]。蘇春雷等[7]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后的余甘子酵素總酚含量比發(fā)酵前高；Tohamy 等[8]觀察到發(fā)酵埃及蜂花粉制品具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性；王印壯等[9]將葡萄果實(shí)發(fā)酵成酵素后，發(fā)現(xiàn)原料風(fēng)味物質(zhì)更為豐富；Yan 等[10]研究表明酵母菌在改善蜂花粉營(yíng)養(yǎng)特性方面具有優(yōu)勢(shì)。目前油菜蜂花粉已被中國(guó)衛(wèi)生部以普通食品管理辦法納入“食品新資源名單”，具有較大的開(kāi)發(fā)潛力[11]，利用源自蜂蜜的酵母LGL-2 將油菜蜂花粉制成酵素有望提升蜂花粉品質(zhì)和附加值。

目前，蜂花粉產(chǎn)品品類單一，關(guān)于油菜蜂花粉發(fā)酵制品風(fēng)味分析的報(bào)道較少。因此，為豐富蜂花粉發(fā)酵菌種資源，提高蜂花粉產(chǎn)品品類以及質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)以油菜蜂花粉為原料，采用響應(yīng)面法探究影響油菜蜂花粉酵素總酚含量的因素，制備品質(zhì)優(yōu)良的油菜蜂花粉酵素，并對(duì)油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物、揮發(fā)性成分與抗氧化活性進(jìn)行分析比較，以期為蜂花粉產(chǎn)品的發(fā)酵工藝優(yōu)化、風(fēng)味品質(zhì)評(píng)價(jià)以及綜合性開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜蜂花粉 廣州市譚山蜂業(yè)有限公司；蜜生假絲酵母LGL-2（CCTCC M 2016787） 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（YPD）活化培養(yǎng)；沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸、鞣花酸、丁香酸、芥子酸、蘆丁和槲皮素（標(biāo)準(zhǔn)品） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；無(wú)水乙醇、乙腈、甲酸等 均為國(guó)產(chǎn)分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

7890A-5975C 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)Agilent 公司；57328-U 萃取纖維頭 美國(guó)Agilent 公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、M20A 二極管陣列檢測(cè)器 日本Shimadzu 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；722 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；SWCJ-1F 超凈臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LDZX-50FBS 高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；ZQZY-98CES 振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司；1508X高速冷凍離心機(jī) 上海力申科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油菜蜂花粉酵素發(fā)酵工藝 油菜蜂花粉酵素的制作工藝如圖1 所示，主要包括殺菌、接種、發(fā)酵等步驟，將發(fā)酵制得的油菜蜂花粉酵素經(jīng)真空冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 油菜蜂花粉酵素發(fā)酵工藝流程Fig.1 Fermentation process of rape bee pollen jiaosu

1.2.2 菌種的活化與擴(kuò)培 蜜生假絲酵母LGL-2 的活化參照張敏倩等[12]的方法。將活化后的蜜生假絲酵母LGL-2 按照體積分?jǐn)?shù)2%接種至液體YPD 培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 在發(fā)酵溫度30 ℃、接種量10%、底物含量25%條件下，180 r/min 恒溫培養(yǎng)，收集不同發(fā)酵時(shí)間（0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 h）的油菜蜂花粉酵素，待測(cè)。

1.2.3.2 發(fā)酵溫度對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 以10%接種量將蜜生假絲酵母LGL-2 接種在25%底物含量培養(yǎng)液中，分別在24、26、28、30、32、34 和36 ℃和180 r/min 的搖床中培養(yǎng)42 h，收集樣品待測(cè)。

1.2.3.3 接種量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

分別以體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%和30%的接種量，將蜜生假絲酵母LGL-2 接種在底物含量25%的培養(yǎng)液中，在30 ℃，180 r/min 的搖床中培養(yǎng)42 h，收集樣品待測(cè)。

1.2.3.4 底物含量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 以10%接種量將蜜生假絲酵母LGL-2 分別接種在5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%底物含量培養(yǎng)液中，于30 ℃和180 r/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)42 h，收集樣品待測(cè)。

1.2.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量和底物含量作Box-Behnken 設(shè)計(jì)，并且以油菜蜂花粉酵素總酚含量作為響應(yīng)值，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.5 酚類化合物的提取 在2 g 樣品凍干粉末中加入100 mL 蒸餾水，超聲波（100%，70 ℃）輔助提取2 h，離心后取上清液作為樣品溶液用于隨后試驗(yàn)。

1.2.6 總酚含量測(cè)定 油菜蜂花粉及其酵素的總酚含量測(cè)定參照王小超等[13]與田文禮等[14]的方法，并稍作修改。配制0.1 mg/mL 的樣品溶液，精密吸取1.0 mL 樣品溶液于試管中，分別加入0.5 mL 福林酚，2 mL 超純水，充分搖勻，1 min 后加入7.5%無(wú)水碳酸鈉溶液5 mL，充分混勻，在暗處放置50 min，以不添加樣品溶液為空白，在760 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0109x+0.0268（R2=0.9986）?？偡雍勘硎緸閙g 沒(méi)食子酸當(dāng)量（GAE）/g。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算油菜蜂花粉及其酵素的總酚質(zhì)量濃度，并按下式計(jì)算總酚含量。

式中：c 為稀釋樣品對(duì)應(yīng)標(biāo)曲的沒(méi)食子酸濃度（mg/L）；V 為樣品體積（L）；m 為樣品質(zhì)量（g）；t 為稀釋倍數(shù)。

1.2.7 游離酚類化合物測(cè)定 參考徐元元等[15]的方法，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定油菜蜂花粉及其酵素的游離酚類化合物。將從油菜蜂花粉及其酵素中提取的酚類化合物過(guò)0.22 μm 濾膜后進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10 μL。色譜柱型號(hào)為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。柱溫為30 ℃，流動(dòng)相A 為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸，流動(dòng)相B 色譜級(jí)乙腈，梯度洗脫程序?yàn)?.00～5.00 min，5%～10% B；5.01～10.00 min，10% B；10.01～22.00 min，10%～17%B；22.01～50.00 min，17～50% B；50.01～75.00 min，50%～95% B；75.01～78.00 min，5% B，流速為1 mL/min。以標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間與紫外-可見(jiàn)光光譜圖確定樣品酚類化合物組成。對(duì)香豆酸、槲皮素、蘆丁在320 nm波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，丁香酸、鞣花酸、沒(méi)食子酸和芥子酸在280 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定峰面積，外標(biāo)法定量。

1.2.8 揮發(fā)性香氣成分富集與分析

1.2.8.1 揮發(fā)性香氣成分富集 頂空固相微萃取方法參考程婭婭[16]并略作修改。吸取8 mL 油菜蜂花粉溶液與油菜蜂花粉酵素，分別置于20 mL 樣品瓶中并加入2.5 g 氯化鈉和磁力轉(zhuǎn)子，45 ℃平衡25 min后插入活化完全的纖維萃取頭45 ℃吸附40 min，于250 ℃解吸5 min。

1.2.8.2 GC-MS 條件 色譜條件：采用HP-INNO WAX毛細(xì)管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣（He）流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量0.5 μL，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始35 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持10 min，總運(yùn)行時(shí)間約為52 min；質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度為250 ℃，質(zhì)譜接口溫度270 ℃；質(zhì)量掃描范圍：m/z 20～450。

1.2.8.3 揮發(fā)性成分的定性與定量分析 檢測(cè)結(jié)果在圖譜庫(kù)NIST 11 上檢索解析，結(jié)合特征離子峰、基峰等信息在譜庫(kù)中篩選出相似度≥80（最大值為100）的化合物，采用峰面積歸一化法計(jì)算得到各揮發(fā)性香氣成分的相對(duì)百分含量。

1.2.9 相對(duì)氣味活度值（ROAV）計(jì)算 相對(duì)氣味活度值可以用于評(píng)定各類揮發(fā)性香氣成分對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味貢獻(xiàn)程度，貢獻(xiàn)程度最大的揮發(fā)性香氣成分ROAV值為100。ROAV≥1 表明該揮發(fā)性香氣成分為樣品中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，ROAV 值越大表示該成分對(duì)樣品整體風(fēng)味影響越大[17]。

式中：Cmax與Tmax分別表示對(duì)貢獻(xiàn)程度最大揮發(fā)性香氣成分的相對(duì)含量（%）及感覺(jué)閾值（mg/kg）；C1與T1表示各待測(cè)成分的相對(duì)含量（%）和感覺(jué)閾值（mg/kg）。

1.2.10 抗氧化活性測(cè)定

1.2.10.1 DPPH 法測(cè)定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液及樣品溶液100 μL 與100 μL DPPH反應(yīng)液混合后，于室溫避光反應(yīng)30 min，517 nm 處測(cè)定吸光度，Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0016x+0.0112（R2=0.9905）?？寡趸钚砸运苄跃S生素E 類似物（Trolox）當(dāng)量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.2.10.2 ABTS 法測(cè)定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液與樣品溶液20 μL 于96 孔板中，加入180 μL ABTS 工作液，充分混勻后于37 ℃避光靜置6 min，734 nm 處測(cè)定吸光度，Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0012x+0.0518（R2=0.9888）。抗氧化活性以Trolox 當(dāng)量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.2.10.3 FRAP 法測(cè)定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標(biāo)準(zhǔn)液與樣品溶液20 μL 于96 孔板中，再加入180 μL FRAP 工作液，搖勻后避光放置于37 ℃反應(yīng)15 min，593 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度，Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=0.0016x+0.2104（R2=0.9867）?？寡趸钚砸訲rolox 當(dāng)量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0 和Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次平行，測(cè)定結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析進(jìn)行Duncan’s 差異分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜂花粉酵素發(fā)酵工藝條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖2 所示，在發(fā)酵時(shí)間從0 h 增加到60 h 的過(guò)程中，油菜蜂花粉總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間的增加而明顯提高，發(fā)酵時(shí)間達(dá)到42 h 時(shí)，總酚含量達(dá)到最大值，此時(shí)油菜蜂花粉總酚含量為8.63±0.02 mg GAE/g，在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的乙醇可以提高部分酚類化合物的溶解性，進(jìn)而提高測(cè)定總酚含量[18]；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于42 h 時(shí)，油菜蜂花粉總酚含量不再隨發(fā)酵時(shí)間的增加呈上升趨勢(shì)，蜜生假絲酵母LGL-2 在發(fā)酵50 h左右時(shí)進(jìn)入發(fā)酵平穩(wěn)期，此時(shí)酚類化合物水解、氧化與溶解、合成等反應(yīng)達(dá)到相對(duì)平衡位點(diǎn)，故選取42 h作為最佳發(fā)酵時(shí)間。Kaprasob 等[19]研究發(fā)酵腰果梨發(fā)酵過(guò)程中活性成分變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵中后期的總酚含量變化相對(duì)平穩(wěn)，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相符。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖3 所示，當(dāng)發(fā)酵溫度范圍在24～30 ℃時(shí)，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨著溫度的上升而逐漸提高，發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)總酚含量達(dá)到最大值8.83±0.15 mg GAE/g；當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)30 ℃后，總酚含量隨溫度升高而下降，因此選取30 ℃作為最佳發(fā)酵溫度。微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的酶不僅可以水解蜂花粉的細(xì)胞壁，使其營(yíng)養(yǎng)成分與活性成分更好地釋放[11]，也可能會(huì)抑制酵母細(xì)胞內(nèi)與酚類化合物合成相關(guān)酶的活性，導(dǎo)致油菜蜂花粉酵素總酚含量降低，過(guò)高與過(guò)低的溫度均會(huì)抑制酶的活性。張敏倩等[12]在利用蜜生假絲酵母LGL-2 制備海藻糖時(shí)，發(fā)現(xiàn)蜜生假絲酵母LGL-2 的最佳發(fā)酵為28 ℃左右，與本研究結(jié)果有差異。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.3 接種量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響如圖4 所示，當(dāng)LGL-2 接種量從5%提升到20%時(shí)，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨著接種量的提高而提高，接種量為20%時(shí)總酚含量達(dá)到最大值10.94±0.20 mg GAE/g；當(dāng)接種量大于20%，總酚含量隨著接種量的提高反而明顯下降，因此選取20%接種量作為L(zhǎng)GL-2 的最佳接種量。當(dāng)接種量過(guò)高時(shí)，發(fā)酵底物不足為酵母提供充足的營(yíng)養(yǎng)，從而抑制酵母發(fā)酵。張笑瑩等[20]優(yōu)化雪花梨酵素制備工藝時(shí)，同樣發(fā)現(xiàn)酵母菌接種量與酵素總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的峰形趨勢(shì)。

圖4 接種量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.4 底物含量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖5 所示，當(dāng)?shù)孜锖坑?%升高至30%時(shí)，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨底物含量的升高而提高，發(fā)酵液的底物含量為30%時(shí)總酚含量達(dá)到最大值10.26±0.23 mg GAE/g；總酚含量在底物含量達(dá)到30%后隨著底物含量的提高反而呈下降趨勢(shì)，因此選取30%底物含量作為發(fā)酵最佳底物含量。底物含量過(guò)高會(huì)引起外界滲透壓增大，酵母的生長(zhǎng)將會(huì)受到抑制，進(jìn)而影響酚類化合物的釋放。張敏倩等[12]的研究中也發(fā)現(xiàn)底物添加量過(guò)高會(huì)反抑制蜜生假絲酵母LGL-2 的代謝的現(xiàn)象。

圖5 底物含量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.5 Effect of substrate content on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.2 油菜蜂花粉酵素發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面法對(duì)油菜蜂花粉酵素發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，以發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和底物含量（D）為自變量，油菜蜂花粉酵素總酚含量（Y）為響應(yīng)值，得出油菜蜂花粉酵素總酚含量的四因素三水平的結(jié)果如表2 所示。利用Design Expert 軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，得到油菜蜂花粉酵素總酚含量（Y）對(duì)發(fā)酵時(shí)間（A）、發(fā)酵溫度（B）、接種量（C）和底物含量（D）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

Y=-548.523+0.93A+29.61B+1.99C+5.02D-7.71E-3AB-3.83E-3AC-1.50E-3AD+2.50E-3BC-0.06BD+3.70E-3CD-5.69E-3A2-0.46B2-0.05C2-0.05D2

由表3 可知，模型P＜0.0001，說(shuō)明該模型極其顯著；失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該模型擬合得較好；R2=0.9132，可知該模型對(duì)綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的擬合程度較高；RAdj2=0.8263，說(shuō)明該模型能解釋82.63%響應(yīng)值的變化，具有較好預(yù)測(cè)能力。方差分析中的顯著性分析可以評(píng)價(jià)自變量對(duì)因變量的影響程度。在所有作用因素中，對(duì)總酚含量影響顯著（P＜0.05）的因素有：B 和BD；影響極顯著（P＜0.01）的因素有：A、D、B2、C2和D2。各單因素對(duì)總酚的影響順序依次為A＞D＞B＞C。

表3 回歸方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

根據(jù)回歸方程擬合的響應(yīng)面圖能直觀反映各實(shí)驗(yàn)因素的交互作用，若響應(yīng)曲面的坡度越陡峭，表明交互作用越強(qiáng)[21]。如圖6 所示，相較于圖6A～圖6D及圖6F，圖6E 的等高線更為密集且曲面坡度陡峭，說(shuō)明發(fā)酵溫度與底物含量的交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響更強(qiáng)，這與方差分析的結(jié)果相符合。

圖6 兩因素交互作用對(duì)總酚含量的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of the interaction between two factors on total phenol content

2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)Design-expert 軟件分析得到油菜蜂花粉酵素發(fā)酵最優(yōu)工藝條件為：發(fā)酵時(shí)間47.91 h，發(fā)酵溫度29.92 ℃，接種量20.31%，底物含量30.48%。考慮到實(shí)際性操作，將最優(yōu)工藝條件調(diào)整為發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度30 ℃，接種量20%，料液比30%，以修正后的工藝條件進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，得到蜂花粉酵素的總酚含量為11.48±0.27 mg GAE/g，接近模型預(yù)測(cè)值11.66 mg GAE/g，兩者相對(duì)誤差為1.58%，試驗(yàn)結(jié)果吻合度較高，證明該響應(yīng)面方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性。

2.4 油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物組成

多酚是蜂花粉中主要的活性物質(zhì)之一[22]。HPLC檢測(cè)結(jié)果如表4 所示，在油菜蜂花粉及其酵素中共檢出5 種酚類化合物，其中包括酚酸（沒(méi)食子酸、對(duì)香豆酸和鞣花酸）與黃酮類化合物（蘆丁、槲皮素）。可以明顯地看到，油菜蜂花粉酵素中的酚類化合物含量均高于發(fā)酵前樣品。在酚酸類化合物中，沒(méi)食子酸從0.52 mg/g 提高至1.90 mg/g，提升幅度最大；黃酮類化合物中提升最明顯的是槲皮素，從0.11 mg/g 提高至0.21 mg/g。油菜蜂花粉及其酵素中蘆丁含量分別是1.79 與2.41 mg/g，由此可見(jiàn)蘆丁是油菜蜂花粉及其酵素中含量最高的酚類化合物之一，即油菜蜂花粉酵素的主要酚類化合物是蘆丁。此外，丁香酸和芥子酸均未檢出。

表4 油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物組成Table 4 Phenolic compounds of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

Zhang 等[23]檢測(cè)油菜蜂花粉的酚類化合物組分時(shí)，發(fā)現(xiàn)油菜蜂花粉中含有異鼠李素、山奈酚、蘆丁、槲皮素等酚類化合物，其中蘆丁的含量最高，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。肖興英等[24]通過(guò)對(duì)中國(guó)不同產(chǎn)地油菜蜂花粉檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的同一植物來(lái)源蜂花粉所含酚類化合物存在差異。有研究報(bào)道，在微生物產(chǎn)生的酶解作用下，可以將原料中部分不溶性結(jié)合酚釋放[25]，與本研究中酚類化合物含量經(jīng)發(fā)酵后提高的現(xiàn)象一致。此外，油菜蜂花粉酵素中仍可能存在其他未被檢出的酚類化合物。

2.5 油菜蜂花粉及其酵素的揮發(fā)性香氣成分

利用氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）測(cè)定油菜蜂花粉及其酵素的揮發(fā)性香氣成分，共鑒定出26 種揮發(fā)性化合物，包括醛類（8 種）、醇類（6 種）、酯類（5 種）、酮類（4 種）、酸類（2 種）、萜烯類（1 種）（見(jiàn)表5）。發(fā)酵后酯類物質(zhì)與醇類物質(zhì)明顯增多，新增2 種酯類物質(zhì)與4 種醇類物質(zhì)，而醛類物質(zhì)、酮類物質(zhì)和酸類物質(zhì)在發(fā)酵后種類均有所減少，其中醛類物質(zhì)從8 種減少至1 種，酮類物質(zhì)從3 種減少至2 種，酸類物質(zhì)在發(fā)酵后未檢出。Yan 等[26]提出大部分產(chǎn)香型酵母在發(fā)酵過(guò)程中能夠合成酯類物質(zhì)以改良產(chǎn)品風(fēng)味。吳昊遠(yuǎn)[27]采用乳酸菌將油松松花粉發(fā)酵制備成風(fēng)味乳飲料，同樣檢出正戊醇、苯甲醛和正己酸等成分。Bleve 等[28]在發(fā)酵橄欖時(shí)觀察到除苯甲醛外，所有檢測(cè)到的醛類物質(zhì)濃度均在發(fā)酵過(guò)程中下降。這些研究結(jié)果與油菜蜂花粉酵素中揮發(fā)性成分的變化一致。

表5 油菜蜂花粉及其酵素的揮發(fā)性香氣成分相對(duì)含量Table 5 Volatile aroma components and their relative contents of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

各揮發(fā)性香氣成分被感知到的最低濃度稱為“氣味閾值”，揮發(fā)性香氣成分的含量與其閾值之比的大小反映該物質(zhì)對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)程度[17]，表6顯示了發(fā)酵對(duì)油菜蜂花粉揮發(fā)性香氣成分ROAV 的影響，共有7 種物質(zhì)被鑒定為油菜蜂花粉酵素的關(guān)鍵性揮發(fā)性香氣成分（ROAV≥1）。整體上，發(fā)酵前后的油菜蜂花粉中關(guān)鍵性揮發(fā)性香氣成分有較大差異，其中異戊醇對(duì)油菜蜂花粉酵素的貢獻(xiàn)度最大。據(jù)報(bào)道，異戊醇具有香甜氣味，在酵母發(fā)酵的葡萄糖代謝途徑中可以得到[29]。發(fā)酵前，油菜蜂花粉中醛類化合物的總ROAV 值最高，其中ROAV 值最高的醛類化合物為正己醛（64.96），其次是正辛醛（64.84），這些物質(zhì)帶有青草味[30]。此外，反式-2,4-庚二烯醛和正己酸分別帶有令人不愉快魚(yú)腥味和汗臭味[31-32]。經(jīng)發(fā)酵后，反式-2,4-庚二烯醛和正己酸的ROAV 值降低，而苯乙醇、辛酸乙酯、庚酸乙酯和癸酸乙酯的ROAV值明顯提高，表明發(fā)酵可有效降低令人不愉快的風(fēng)味并增強(qiáng)油菜蜂花粉的水果香和玫瑰香氣味[33-34]。此外，蔡秋萍[35]通過(guò)HS-SPME 提取與GC-MS 分析在油菜蜂花粉中共鑒定出40 種特征揮發(fā)性香氣成分，同時(shí)結(jié)合在線嗅聞鑒定分析發(fā)現(xiàn)油菜蜂花粉具有甜奶脂味、花果香以及不良的膏脂油蛤味與腥味，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致。

表6 油菜蜂花粉及其酵素的揮發(fā)性香氣成分ROAV 值Table 6 ROAV of volatile aroma compounds in rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

2.6 油菜蜂花粉及其酵素的抗氧化活性

通過(guò)蜜生假絲酵母LGL-2 發(fā)酵制得的油菜蜂花粉酵素采用DPPH、ABTS 和FRAP 方法分析。如表7 所示，其抗氧化活性當(dāng)量分別為42.38±1.84、113.82±0.54 和89.90±0.91 μmol TE/g，相比于發(fā)酵前分別提高67.51%、13.90%和145.71%，且具有顯著性（P＜0.05）。Aylanc 等[36]對(duì)天然發(fā)酵的蜂花粉與未發(fā)酵的蜂花粉分別進(jìn)行體外模擬消化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)天然發(fā)酵的蜂花粉在各個(gè)消化階段均具有更高的抗氧化活性，本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)人工發(fā)酵制得的油菜蜂花粉酵素同樣可觀察到抗氧化活性增強(qiáng)的現(xiàn)象。研究表明，抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量呈正相關(guān)[37]，推測(cè)油菜蜂花粉酵素抗氧化活性的提高可能與酚類化合物含量提高有關(guān)。

表7 油菜蜂花粉及其酵素的抗氧化活性Table 7 Antioxidant activity of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

3 結(jié)論

本文對(duì)制備油菜蜂花粉酵素的工藝及品質(zhì)進(jìn)行研究，在采用單因素實(shí)驗(yàn)考察發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、接種量和底物含量對(duì)油菜蜂花粉酵素總酚含量影響的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵工藝條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到最優(yōu)工藝條件：發(fā)酵時(shí)間48 h、發(fā)酵溫度30 ℃、接種量20%、底物含量30%，此時(shí)總酚含量可達(dá)11.48 mg GAE/g。在此條件下發(fā)酵制備的油菜蜂花粉酵素中酚類化合物含量、揮發(fā)性酯類物質(zhì)種類、醇類物質(zhì)種類以及體外抗氧化活性均有所提高。此外，ROAV 值分析結(jié)果表明油菜蜂花粉經(jīng)發(fā)酵后具有不良?xì)馕兜某煞諶OAV 值下降，同時(shí)產(chǎn)生風(fēng)味良好的物質(zhì)。綜上所述，本研究拓寬了蜜生假絲酵母LGL-2的應(yīng)用場(chǎng)景，探究了油菜蜂花粉及其酵素的主要酚類化合物組成、揮發(fā)性風(fēng)味成分以及抗氧化活性變化，為油菜蜂花粉酵素的研究及高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)，經(jīng)蜜生假絲酵母LGL-2 發(fā)酵制得的油菜蜂花粉酵素營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高、風(fēng)味更佳，具有良好的開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)前景。目前，本文僅對(duì)油菜蜂花粉及其酵素的揮發(fā)性成分與體外抗氧化活性進(jìn)行探究，為進(jìn)一步闡明油菜蜂花粉酵素的風(fēng)味成分及生物活性，未來(lái)可繼續(xù)探究油菜蜂花粉發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生的非揮發(fā)性風(fēng)味成分組成，并開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)深入研究其體內(nèi)活性。