SPME-GC-MS 結(jié)合多元統(tǒng)計方法探究冷萃與熱萃對咖啡萃取液香氣的影響

陸羽霜，施政廷，楊震南

（杭州味全食品有限公司，浙江杭州 310018）

咖啡作為僅次于水的第二大最常飲用的飲料，在70 多個國家均有種植，具有廣闊的市場和較高的經(jīng)濟(jì)價值[1]，因其獨特且宜人的風(fēng)味受到消費者的歡迎。而咖啡的風(fēng)味質(zhì)量主要由化學(xué)成分決定，包括有助于香氣特性的揮發(fā)性化合物和影響味道的非揮發(fā)性化合物。這些風(fēng)味化合物會受到許多復(fù)雜因素的顯著影響，如加工方法、烘焙程度和沖泡方法[2]。

近年來，沖泡過程作為最接近咖啡消費的最后一步，越來越引起食品制造商的興趣。提取參數(shù)對咖啡的感官品質(zhì)和風(fēng)味感知起著關(guān)鍵作用，如咖啡粉粒度、提取時間、溫度和壓力[3]。按沖泡溫度分為經(jīng)典熱沖泡咖啡和最近較為流行的冷沖泡咖啡。一般來說，高溫增加了水分子的動能，這有利于化合物從咖啡粉浸出。同時，高溫會影響咖啡中揮發(fā)性化合物的釋放，從而改變感官感知[4]。

氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）常被用于檢測和鑒定不同咖啡不同處理條件下的揮發(fā)性化合物，固相微萃?。⊿PME）的優(yōu)勢為樣品使用量少且處理簡單以及可對食品中釋放的揮發(fā)物進(jìn)行實際測量，當(dāng)兩者結(jié)合使用時，SPME-GC-MS 是分析來自咖啡基質(zhì)中頂空釋放香氣的有效技術(shù)[5]。蘇雨馨[6]通過GC-MS對咖啡冷萃和熱萃后的香氣物質(zhì)進(jìn)行了比較與分析。朱曉紅[7]對不同萃取溫度下的哥倫比亞咖啡萃取液進(jìn)行了香氣物質(zhì)分析，三種萃取溫度萃取液的香氣成分基本一致，含量有所不同。Córdoba 等[8]通過對哥倫比亞中等烘焙度的阿拉比卡冷萃咖啡和熱萃咖啡揮發(fā)物的對比研究，發(fā)現(xiàn)冷萃咖啡的總呋喃和吡喃豐度高于熱萃咖啡。在以往的感官研究中，也經(jīng)常報道熱萃咖啡和冷萃咖啡之間存在顯著差異[3,9]。但到目前為止，國內(nèi)外關(guān)于導(dǎo)致熱萃咖啡和冷萃咖啡之間感官差異的化合物的研究報道非常有限。

香氣是決定咖啡品質(zhì)最重要的關(guān)鍵因素之一，然而目前關(guān)于咖啡香氣的研究較多關(guān)注于不同產(chǎn)地或品種之間的比較，以及冷萃與熱萃間香氣成分差異的相關(guān)報道較少。本研究的目的是通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（SPME-GC-MS）和氣味活性值（OAV）計算比較熱萃咖啡和冷萃咖啡中的芳香活性化合物，再結(jié)合多元統(tǒng)計分析將感官品評得分和香氣物質(zhì)含量結(jié)合起來，首次探討了西達(dá)摩和云南咖啡豆經(jīng)冷萃和熱萃后不同香氣成分與感官屬性之間的潛在相關(guān)性，旨在為冷萃與熱萃咖啡萃取液的研究開發(fā)、改進(jìn)與應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西達(dá)摩/云南咖啡豆（2022） 由廣東順大食品有限公司統(tǒng)一烘焙，中深度烘焙并密封保存于牛皮紙單向閥包裝袋中；1,2-二氯苯（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；正構(gòu)烷烴（C8～C40 標(biāo)準(zhǔn)品） 上海創(chuàng)賽科技有限公司產(chǎn)品。

TRACE 1310-TSQ 9000 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Thermo Scientific 公司；萃取頭（50/30 μm 二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷） 美國Supelco公司；PRE 1 Z 咖啡豆烘焙機(jī) 德國Probat 儀器公司；VTA-6S3 咖啡豆研磨機(jī) 德國MAHLKONIG儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 冷萃方法：30 g 樣品研磨粉，使用60 g 0 ℃水浸濕后，以每3 秒1 滴的速度來冰滴萃取6 小時。熱萃方法：94±2 ℃萃取10 min。豆水比1:9（w:w）。參考工業(yè)加工，將熱萃和冷萃咖啡稀釋至2%總?cè)芙夤腆w（TDS）進(jìn)行感官和隨后的儀器分析。每個實驗重復(fù)三次咖啡制備。

1.2.2 香氣成分測定 頂空固相微萃取條件：將處理好的咖啡萃取液樣品5 mL 轉(zhuǎn)移到20 mL 的專用樣品瓶中，然后加蓋密封。將樣品在60 ℃下平衡40 min，然后在相同溫度下萃取吸附30 min；將揮發(fā)性化合物解吸5 分鐘，然后通過分流進(jìn)樣（進(jìn)樣口溫度250 ℃；分流比5:1）進(jìn)樣到GC-MS 系統(tǒng)中。

氣相色譜條件：在TG-5 MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）上進(jìn)行分離。氦氣以1 mL/min的恒定流速用作載氣。升溫程序：40 ℃保持5 min，以1 ℃/min 升至90 ℃，再以3 ℃/min 升溫至110 ℃，最后以8 ℃/min 升至210 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：以電子碰撞（EI）電離模式（70 eV）運行，掃描范圍為35～450 m/z；傳輸線溫度設(shè)置為240 ℃；離子源溫度設(shè)置為280 °C。所有樣品均用GC-MS 隨機(jī)分析。

定性定量方法：根據(jù)文獻(xiàn)[10-14]，通過與譜庫（NIST 14.0）檢索比較，選擇匹配度大于80%的物質(zhì)；相同色譜條件下，用C8～C40 的正構(gòu)烷烴對各化合物的保留指數(shù)（RI）進(jìn)行計算，并與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比較。

式中：RI 為待測物質(zhì)保留指數(shù)；n 表示待測物質(zhì)的碳數(shù)；RT（x）為待測物質(zhì)的保留時間；RT（n）為待測物質(zhì)流出前正構(gòu)烷烴的保留時間；RT（n+1）為待測物質(zhì)流出后正構(gòu)烷烴的保留時間。

結(jié)合各色譜峰的峰面積進(jìn)行香氣相對含量分析，并根據(jù)檢測出的各香氣成分峰面積與內(nèi)標(biāo)（1,2-二氯苯）峰面積的比值進(jìn)行相對定量。

1.2.3 揮發(fā)性風(fēng)味成分的OAV 值計算 OAV 按式（2）計算：

式中：Ci表示揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度（μg·kg-1）；OTi表示任一組分在水中的香氣閾值（μg·kg-1）。

1.2.4 感官特征評價 感官評價在室溫下進(jìn)行。咖啡樣品從冰箱中取出，室溫下放置至20±3 ℃進(jìn)行品嘗。由10 名專業(yè)訓(xùn)練的不分年齡、性別的咖啡品鑒師（Q grader）評估熱萃和冷萃咖啡的香氣感官屬性強度。根據(jù)文獻(xiàn)[9]并配合實際形成咖啡的香氣感官描述評價，最終確定的詞匯包括：青香、堅果香、爆谷物香、熏烤香、果香、焦甜香，強度評分范圍為1～9 分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用NIST 14 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫結(jié)合賽默飛質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對各化合物進(jìn)行檢索，通過匹配度并參照相關(guān)文獻(xiàn)[2-5]報道綜合確定其化學(xué)成分；使用SPSS進(jìn)行顯著性檢驗；使用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和繪制感官雷達(dá)圖；通過SIMCA 14.1 和Origin Pro 9.0 軟件進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和熱圖聚類分析，可視化熱萃和冷萃咖啡的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 冷萃與熱萃對咖啡揮發(fā)性物質(zhì)的影響

2.1.1 冷萃與熱萃咖啡揮發(fā)性物質(zhì)的種類、含量及OAV 值 如表1 所示，在冷萃與熱萃咖啡液中共鑒定出69 種揮發(fā)性化合物，包括呋喃類化合物13 種，酮類化合物10 種等，吡嗪類化合物9 種，醛類化合物8 種，酯類化合物6 種，酚類化合物6 種，吡咯類化合物6 種，吡啶類化合物4 種及7 種其他類化合物。為了進(jìn)一步評價香氣化合物對咖啡風(fēng)味譜的貢獻(xiàn)，測定了OAV 值。一般認(rèn)為，當(dāng)揮發(fā)性化合物的OAV ≥1 時對整體香氣的貢獻(xiàn)較大，揮發(fā)性化合物的OAV＞10 時則被確定為重要香氣成分[15]。由表1可知，咖啡萃取液中共有39 種揮發(fā)性化合物的濃度均超過了各自的閾值，即OAV＞1。

表1 冷萃與熱萃咖啡揮發(fā)性物質(zhì)的含量及OAV 值Table 1 Content and OAV of volatile compounds in cold brew and hot brew coffee

呋喃類化合物是4 種咖啡萃取液中種類及含量最多的物質(zhì)，主要是由碳水化合物在咖啡烘烤熱降解時形成以及在脂質(zhì)熱氧化過程中通過硫胺素的降解和核苷酸的分解形成[16]。由表1 可知，在西達(dá)摩和云南這兩種咖啡豆萃取中，冷萃中的呋喃類化合物總含量均高于熱萃中的含量，約為1.5 倍，X-Cold（ 474.38 mg/kg） ＞X-Hot（ 348.83 mg/kg） ， Y-Cold（507.20 mg/kg）＞Y-Hot（301.23 mg/kg）。雖然呋喃在咖啡中含量豐富，但由于呋喃的識別閾值較高，對咖啡香氣的貢獻(xiàn)有限，由表1 的OAV 值可知，13 種呋喃類化合物中只有5 種呋喃的OAV＞1（乙酸糠酯、2-正丁基呋喃、糠醛、糠醇和5-甲基-糠醛）。冷萃中這幾種物質(zhì)的OAV 值均高于熱萃中，其中差異最為顯著的為乙酸糠酯，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的2～3 倍，乙酸糠酯的香氣屬性常被描述為甜香及果香[17]。其次差異較為明顯的為2-正丁基呋喃和糠醛，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的1.2 倍，2-正丁基呋喃的香氣屬性常被描述為溫和的甜香、酒香及果香，糠醛則被描述為甜香和類似烤面包的焦糖香[17]?？反己?-甲基-糠醛的OAV 值在冷萃和熱萃中差異不顯著。

吡嗪類化合物在4 種咖啡萃取液中含量也較為豐富，它主要由還原糖和氨基酸或蛋白質(zhì)之間的美拉德反應(yīng)形成[18]。由表1 可知，在西達(dá)摩和云南這兩種咖啡豆萃取中，冷萃中的吡嗪類化合物總含量也均高于熱萃中的含量。在西達(dá)摩咖啡萃取液中，冷萃的總含量約是熱萃的1.4 倍：X-Cold（173.51 mg/kg）＞X-Hot（123.63 mg/kg）；在云南咖啡萃取液中，冷萃的總含量約是熱萃的2 倍：Y-Cold（207.47 mg/kg）＞YHot（115.38 mg/kg）。吡嗪的閾值較低，在咖啡風(fēng)味中起著至關(guān)重要的作用，由表1 的OAV 值可知，共有6 種呋喃的OAV＞1（2,3-二乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、2-乙基-3-甲基砒嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪）。其中差異最為顯著的為2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，西達(dá)摩冷萃中的OAV 值約為熱萃中的5 倍，云南冷萃中的OAV 值約為熱萃中的10 倍，2,3-二乙基-5-甲基吡嗪的氣味屬性常被描述為堅果香及烤土豆味[19]。其次差異較為明顯的為3-乙基-2,5-甲基吡嗪，冷萃中的OAV 值約為熱萃中的2～3 倍，3-乙基-2,5-甲基吡嗪的香氣屬性常被描述為可可及烤堅果味[19]。2-乙基-3-甲基砒嗪、2,5-二甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪和2-乙基吡嗪差異不顯著。

醛酮類化合物雖然在4 種咖啡萃取液中含量不高，但因其閾值較低，對咖啡的香氣也起著比較重要的作用。從表1 中可以看出，冷萃中的醛類和酮類化合物總含量也均高于熱萃中的含量。在測得的所有醛類化合物中（2-甲基丁醛、異戊醛、異丁醛、己醛、苯乙醛、2,5-二甲基苯甲醛、苯甲醛、2-甲基-2-丁烯醛），其OAV 值均大于1。其中，2-甲基丁醛、異戊醛、異丁醛和己醛在冷萃和熱萃中均存在差異，且冷萃的OAV 值大于熱萃。2-甲基丁醛主要提供可可、堅果、谷物、麥芽香，異戊醛、異丁醛和己醛主要提供青香、果香[20]。共有5 種酮類物質(zhì)的OAV＞1（2,3-戊二酮、2-壬酮、丁二酮、3-己酮和2-戊酮），其中2,3-戊二酮、2-壬酮和3-己酮在冷萃和熱萃中差異較為顯著，2,3-戊二酮和2-壬酮提供黃油、奶油、焦糖香氣，并帶有烤堅果底香，3-己酮帶有甜香、果香及朗姆酒香[21-22]。

在酯類化合物中，冷萃中的總含量也高于熱萃，6 種酯類化合物中有4 種的OAV＞1（異戊酸甲酯、丁酸乙酯、壬酸乙酯和丙酸乙烯酯）。其中，異戊酸甲酯、丁酸乙酯和壬酸乙酯在冷萃和熱萃中均存在差異，且冷萃的OAV 值大于熱萃。異戊酸甲酯、丁酸乙酯和壬酸乙酯的氣味屬性常被描述為果香，異戊酸甲酯和丁酸乙酯偏向蘋果和菠蘿樣果香，壬酸乙酯則偏向葡萄樣果香，且有一定的玫瑰香氣[23]。

吡啶和吡咯類化合物都與葫蘆巴堿或者羥基氨基酸等前體物質(zhì)有關(guān)[24]，在總含量上，冷萃的吡啶和吡咯類化合物也都高于熱萃。在香氣活性值方面，2-乙酰吡啶、吡啶和1-糠基吡咯的OAV＞1，吡啶類大多呈現(xiàn)谷物香、爆米花香及堅果香等，1-糠基吡咯回呈現(xiàn)果蔬味和榛子味等[25]。

酚類化合物咖啡烘焙末段干餾的產(chǎn)物，如4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚是綠原酸在烘焙過程中降解產(chǎn)生的?？Х壤漭秃蜔彷椭蟹宇惢衔锏淖兓厔莶煌?，苯酚和愈創(chuàng)木酚的含量兩者差異不顯著，冷萃中的2-乙酰間苯二酚和含量高于熱萃中的，而4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚的變化趨勢為：熱萃＞冷萃。 苯酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚的OAV＞1，這些物質(zhì)會有一些香草、香料、木香及煙熏等風(fēng)味屬性[26]。

除上述物質(zhì)外，芳樟醇在冷萃和熱萃中的差異也比較顯著，其OAV 值也遠(yuǎn)大于1，對咖啡的風(fēng)味有較大的貢獻(xiàn)度，其風(fēng)味屬性常被描述為柑橘香和花香。因多數(shù)萜烯醇都具有香氣活性高、閾值低的特點，使它成為了大多數(shù)茶葉的關(guān)鍵呈香組分，特別是芳樟醇類化合物[27]，而其體現(xiàn)出的花果香在咖啡中也能帶來令人愉悅的感受。由實驗結(jié)果可知，冷萃能保留更多的芳樟醇，在萃取時可注意溫度來提升咖啡的花果香。

一般情況下，高溫使飽和蒸汽壓升高，從而使揮發(fā)性化合物的損失增加[28]。這可以用來解釋冷萃咖啡中呋喃、吡嗪、醛酮、吡咯和吡啶等化合物的含量比熱萃中高，這與之前的研究是一致的[8]。熱萃和冷萃咖啡中酚類化合物的變化趨勢不同，可能是沖泡方式通過提取溫度和時間對酚類化合物濃度產(chǎn)生不同程度的影響，后續(xù)可進(jìn)行深入研究。

2.1.2 冷萃與熱萃咖啡揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析

將上述咖啡萃取液中OAV 值＞1 的重要揮發(fā)性物質(zhì)繪制成熱圖見圖1。從熱圖聚類分析層面可以看出，不同咖啡豆的熱萃聚為一類，冷萃聚為另一類，說明冷熱萃取對咖啡揮發(fā)性物質(zhì)含量的影響顯著。從圖1 中還可以看出，絕大部分的揮發(fā)性化合物的含量變化趨勢：冷萃＞熱萃，這主要是由于一般情況下高溫使飽和蒸汽壓升高，化合物的揮發(fā)損失量增加[28]，這與Córdoba 等[8]的研究是一致的。而咖啡冷萃和熱萃中酚類化合物的變化趨勢不同，可能還與萃取時間有關(guān)，造成了熱萃中4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量高于冷萃中。

圖1 不同咖啡萃取液重要揮發(fā)性物質(zhì)熱圖Fig.1 Heat maps of important volatile substances in different coffee extracts

2.2 特征香氣感官評定

感官品評人員比較了冷萃與熱萃后咖啡萃取液的香氣特征差異，表2 歸納了香氣感官評定結(jié)果的平均得分，按照其得分可繪制圖2。

圖2 不同咖啡萃取液的香氣雷達(dá)圖Fig.2 Aroma radar map of different coffee extracts

表2 咖啡特征香氣評定結(jié)果Table 2 Evaluation results of coffee characteristic aroma

結(jié)合表2 和圖2，可以直觀的看出，無論是西達(dá)摩咖啡豆還是云南咖啡豆，冷萃的青香、果香、堅果香得分都明顯高于熱萃，其中，最顯著的是青香：XCold（4.70）＞X-Hot（4.00），Y-Cold（4.50）＞Y-Hot（3.70）。而熱萃的熏烤香得分高于冷萃：X-Cold（7.20）＜XHot（7.60），Y-Cold（7.00）＜Y-Hot（7.30），這一結(jié)果與陳仲娜等[19]對云南阿拉比卡冷萃與熱萃的感官研究結(jié)果一致。在爆谷物香及焦甜香方面，冷萃的得分也略高于熱萃。綜上所述，咖啡豆冷萃在香氣上呈現(xiàn)的是青香明顯，堅果香濃郁，果香環(huán)繞，略帶焦甜香，可能是由于其具有果香的乙酸糠酯及芳樟醇含量更高，具有烘烤堅果甜香的吡嗪類物質(zhì)種類和含量更豐富；咖啡豆熱萃在香氣上呈現(xiàn)的是熏烤香濃郁，可能是因為其揮發(fā)性酚類物質(zhì)的種類和含量更多。

2.3 香氣感官評價與揮發(fā)性物質(zhì)的相關(guān)性分析

冷萃和熱萃的香氣感官得分與OAV 值＞1 的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過利用SIMCA14.0 分析軟件進(jìn)行偏最小二乘法分析（PLS），其分析圖如圖3。由圖3可知，圖中包括2 個變量，分別為揮發(fā)性物質(zhì)和香氣的感官特征，二者的距離越相近，表明其相關(guān)性越好，解釋性越強[29-30]。

圖3 冷萃與熱萃咖啡氣味特征與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PLS 分析圖Fig.3 PLS analysis diagram of odor characteristics and volatile flavor compounds of cold brew and hot brew coffee

揮發(fā)性物質(zhì)與感官指標(biāo)之間存在不同程度的正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，說明多種揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成香氣的感知[31]。其中，與熏烤香相關(guān)性較高的物質(zhì)為對乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚，張豐等[26]對這兩個物質(zhì)的香氣描述為香草、香料、木香及煙熏等，實驗結(jié)果與其較為一致。果香和青香的位置較近，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯、己醛和丁酸乙酯與其相關(guān)性較高，其中，異戊酸甲酯和丁酸乙酯偏向蘋果和菠蘿樣果香，壬酸乙酯則偏向葡萄樣果香[23]，2-正丁基呋喃的香氣屬性常被描述為溫和的甜香、酒香及果香[17]，己醛常被描述成青香、果香等風(fēng)味屬性[20]，所以，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯和丁酸乙酯對實際果香貢獻(xiàn)率較高，己醛則對青香貢獻(xiàn)率較大。與堅果香相關(guān)性最高的物質(zhì)為2,3-二乙基-5-甲基吡嗪，常被描述為堅果香、榛子味及烤土豆味[19]，它也是前述冷萃熱萃中差異最顯著的物質(zhì)。焦甜香、爆谷物香和堅果香位置接近，圍繞在周圍的大多為吡嗪、吡啶類物質(zhì)，這可能與風(fēng)味物質(zhì)之間的相互影響有關(guān)。

3 結(jié)論

利用SPME-GC-MS 結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法從感官和香氣物質(zhì)方面分析了云南和西達(dá)摩咖啡豆經(jīng)冷萃和熱萃后萃取液的特征風(fēng)味。共有69 種揮發(fā)性成分在不同萃取液中被鑒定出，其中有39 種物質(zhì)的OAV 值＞1，冷萃中的呋喃類、吡嗪類、醛酮類及酯類等大部分物質(zhì)含量高于熱萃中，熱萃中含量高于冷萃的物質(zhì)為4-乙基愈創(chuàng)木酚、2,4-二叔丁基苯酚和對乙烯基愈創(chuàng)木酚。感官分析表明，冷萃的青香、果香、堅果香得分高于熱萃，而熱萃中的熏烤香得分更高。進(jìn)一步利用PLS 將感官結(jié)合香氣物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，對乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚對熏烤香貢獻(xiàn)較大，己醛則對青香貢獻(xiàn)率較大，異戊酸甲酯、2-正丁基呋喃、壬酸乙酯和丁酸乙酯對果香貢獻(xiàn)率較大，2,3-二乙基-5-甲基吡嗪對堅果香貢獻(xiàn)率較大。本研究利用SPME-GC-MS 結(jié)合多元統(tǒng)計方法初步探討了不同香氣成分與感官屬性之間的潛在相關(guān)性，為冷萃與熱萃咖啡萃取液的研究開發(fā)、改進(jìn)與應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，而在相關(guān)感官風(fēng)味與風(fēng)味物質(zhì)聯(lián)系機(jī)制方面有待進(jìn)一步研究，也需增加GC-O 進(jìn)行深入檢測分析。