食物源吡咯里西啶類生物堿污染水平、檢測(cè)技術(shù)及加工影響的研究現(xiàn)狀

劉 慧，穆同娜，林 立，耿健強(qiáng)，姜 潔

（北京市食品檢驗(yàn)研究院（北京市食品安全監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心），國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品安全重大綜合保障關(guān)鍵技術(shù)），北京 100094）

吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）是植物為防御昆蟲和病原體及動(dòng)物等而產(chǎn)生的一類次級(jí)代謝產(chǎn)物，在自然界分布極為廣泛。據(jù)報(bào)道，目前已從多種植物中分離鑒定出600 以上不同結(jié)構(gòu)的PAs 及其氮氧化物[1-3]。PAs 的分布與植物種屬有關(guān)，主要分布于遠(yuǎn)緣相關(guān)的被子植物科，涉及紫草科（Boraginaceae）、豆科（Leguminosae）及菊科（Asteracea）等13 科植物。此外，在蘭科（Orchidaceae）、禾本科（Poaceae）、毛茛科（Ranunculaceae）等植物中也有存在[4-5]。PAs 的含量水平與植物種屬有很大關(guān)系，從痕量至最高約百分之十九（以干重計(jì)）[6]。目前，已分離得到的PAs 及PANOs 中約50%具有較強(qiáng)的肝毒性，肺動(dòng)脈高壓、心臟肥大、腎臟退行性損傷等器官毒性，神經(jīng)和胚胎毒性，甚至致畸、致癌和致突變等[7]。PAs 在食品中也有不同程度地檢出，常見的PAs 暴露來(lái)源包括含PAs 的植物以中草藥、膳食補(bǔ)充劑、功能性食品等的原材料而被人體直接攝入，也可間接通過(guò)污染糧谷類作物或經(jīng)動(dòng)物采食等隨食物鏈進(jìn)入最終食品，而對(duì)人體健康造成潛在危害[8-10]。另外，最近還有研究提出了其他污染途徑，如PAs/PANOs 可被土壤吸收并進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移或生產(chǎn)者為了經(jīng)濟(jì)利益而有意摻假[11-13]。近年來(lái)，經(jīng)攝取含PAs 的食物而中毒的案例已有較多報(bào)道，歐洲食品和飼料安全警報(bào)（Food and Feed Safe Alerts，RASFF）門戶網(wǎng)站上報(bào)告的關(guān)于食品中PAs/PANOs 的高發(fā)生率的食品警報(bào)數(shù)量顯著增加[14]。鑒于PAs/PANOs廣泛存在于不同類型的食品中及其對(duì)人類健康的潛在風(fēng)險(xiǎn)，其污染問(wèn)題已成為重要的食品安全問(wèn)題，了解食品中PAs 的污染狀況，并針對(duì)性開展有效防控對(duì)確保食品安全具有重要意義。因此，本文對(duì)PAs/PANOs 的理化性質(zhì)、毒性、污染狀況、食品加工過(guò)程中的變化及相關(guān)分析檢測(cè)技術(shù)等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了全面論述，以期為食品中PAs/PANOs 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及防控策略的制定提供有利參考。

1 化學(xué)結(jié)構(gòu)及毒性

PAs 是一種復(fù)合分子，其化學(xué)結(jié)構(gòu)通常由千里光次堿（necine）與千里光次酸（necic acid）兩部分組成，其中千里光次堿的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)是PAs 母核，主要是由一個(gè)四氫吡咯環(huán)和一個(gè)羥甲基取代的四氫吡咯環(huán)經(jīng)由氮原子和其鄰位碳原子稠合構(gòu)成的雙環(huán)結(jié)構(gòu)[15]（見圖1a）。母核中的N 可被氧化形成相應(yīng)的氮氧化物（PANOs），與PAs 原型共同存在于植物中。根據(jù)母核1,2 位碳原子之間形成的鍵是否飽和，可將其分為飽和與不飽和PAs。當(dāng)1,2 位處于飽和狀態(tài)時(shí)，PAs 表現(xiàn)為無(wú)毒或毒性較弱；而當(dāng)1,2 位為雙鍵呈不飽和狀態(tài)時(shí)，其毒性和致病性成為關(guān)注的熱點(diǎn)[16]（見圖1b）。同樣，根據(jù)千里光次堿基結(jié)構(gòu)不同，可將不飽和PAs 分為倒千里光堿型（retronecine-type），天芥菜堿型（heliotridine-type），奧索千里光裂堿（otonecine-types）等5 種類型[17]（見圖1c）。千里光次酸一般為5～10 個(gè)碳原子的一元酸或二元酸，可同千里光次堿7 或9 位的羥基形成單酯、開鏈雙酯或大環(huán)內(nèi)酯[18]（見圖1d）。

圖1 PAs （a）、1,2 位飽和PAs、1,2 位不飽和PAs （b）的基本結(jié)構(gòu)及代表性飽和、不飽和 （c）、酯型、開鏈雙酯型與環(huán)酯型千里光次堿（d）的化學(xué)結(jié)構(gòu)[15-18]Fig.1 Basic structures of PAs (a), 1,2-saturated PAs and 1,2-unsaturated PAs (b) and chemical structures of representative pyrrolizidine alkaloids according to the necine base (c) and different types of esterification (d)[15-18]

目前關(guān)于PAs 的毒性機(jī)制還沒有明確的結(jié)論，但普遍觀點(diǎn)認(rèn)為不飽和PAs 的原型化合物毒性很小，但易被細(xì)胞色素P450（cytochrome P450，CYP）3A 單加氧酶氧化，經(jīng)肝臟代謝后形成高反應(yīng)性脫氫吡咯生物堿（dehydropyrrolizidine alkaloids，DHPAs），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2[16]。DHPAs 具有較強(qiáng)的親電子性，可迅速與細(xì)胞內(nèi)的各種親核性大分子發(fā)生結(jié)合，從而引起肝細(xì)胞代謝紊亂、脂肪變性和壞死性損傷等[19]。因CYP3A 在肝臟中含量豐富，主要存在于胞漿的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，因此PAs 作用的直接靶器官主要為肝臟，故PAs 又稱為肝毒吡咯里西啶生物堿（hepastotoxic pyrrolizidine alkaloids，HPAs）。有機(jī)陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性介導(dǎo)了肝臟對(duì)PAs 的攝取，并與CYP3A一起在PAs 誘導(dǎo)的肝毒性中發(fā)揮作用。此外，PAs還會(huì)引起腎、肺、神經(jīng)和胚胎毒性，甚至致畸、致突變和致癌[20]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）也已將PAs歸類2B 類致癌物。此外，最新研究表明PANOs 也可產(chǎn)生毒性，PANOs 可以逆轉(zhuǎn)化為PAs 并被氧化成親電性DHPAs 而發(fā)揮毒性作用[21]。

圖2 脫氫吡咯的化學(xué)結(jié)構(gòu)[16]Fig.2 Chemical structure of DHPAs[16]

盡管所有的1,2-不飽和PAs 都具有共同的代謝途徑，但不同研究結(jié)果顯示PAs 的毒性大小與其結(jié)構(gòu)有關(guān)。雙稠吡咯環(huán)1,2 位具有雙鍵同時(shí)7 位或9 位的羥基至少有一個(gè)被酯化是PAs 產(chǎn)生毒性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[15]。PAs 毒性因酯鍵的個(gè)數(shù)及是否成環(huán)、千里光次酸的結(jié)構(gòu)而呈現(xiàn)差異，通常環(huán)狀二酯的毒性最大，其次是開鏈二酯，最后是單酯[16]。

PAs 主要經(jīng)氧化和水解等途徑排出體外。當(dāng)PAs 暴露量較少時(shí)，其主要解毒途徑是PAs 的脫氫代謝物（DHPAs）與還原型谷胱甘肽相結(jié)合從而避免前者與DNA 或蛋白質(zhì)結(jié)合。另外，N-氧化對(duì)PAs的毒性也要貢獻(xiàn)，因此，抗氧化物質(zhì)可一定程度減弱PAs 的毒性[20]。

2 食品中PAs 的污染水平及來(lái)源

近年來(lái)關(guān)于因PAs 引發(fā)的人類肝中毒案例的報(bào)道逐漸增多，PAs 的污染問(wèn)題已引起全世界各國(guó)監(jiān)管部門及研究機(jī)構(gòu)的高度關(guān)注。表1 列舉了近年來(lái)不同國(guó)家不同食品中PAs/PANOs 的污染水平。由表可知，PAs/PANOs 廣泛存在于來(lái)自植物的相關(guān)衍生制品中，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）已將茶葉、花草茶、蜂蜜和膳食補(bǔ)充劑等確定為易受PAs/PANOs 污染的高風(fēng)險(xiǎn)食品。

表1 不同食品中PAs/PANOs 的污染水平Table 1 Levels of PAs/PANOs in different items

2.1 茶葉及其他植物源衍生產(chǎn)品中的PAs

茶葉中PAs 的污染問(wèn)題因其污染程度與范圍而不容小覷，歐美國(guó)家已開展針對(duì)市售花草茶中PAs污染水平的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)。如Bodi 等[26]分析了德國(guó)市售的274 種茶葉樣品（包括紅茶、綠茶、薄荷茶、洋甘菊茶和博士茶等）中的PAs/PANOs 含量，檢出10 種PAs 及7 種PANOs 化合物，其中博士茶的污染最為嚴(yán)重，含量可高達(dá)5647.2 μg/kg。Schulz 等[22]分析了德國(guó)市售的169 種藥用茶葉，檢出14 種PAs和9 種PANOs。Kaltner 等[23]分析了德國(guó)市售的18 種花草茶中PAs/PANOs 的含量，發(fā)現(xiàn)18 個(gè)茶葉樣品中PAs 的含量為0.1～47.9 μg/kg。近年來(lái)，為了進(jìn)一步細(xì)化針對(duì)食品中PAs 污染的防控措施，德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）模擬常見的幾種消費(fèi)情景，對(duì)茶葉中的PAs 進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間飲用某一特定類型的茶浸提液會(huì)增加PAs 暴露風(fēng)險(xiǎn)[40]。此外，Griffin 等[24]分析愛爾蘭市售的18 種花草茶時(shí)，發(fā)現(xiàn)某些陽(yáng)性檢出樣品中PAs 的含量可高達(dá)1733 μg/kg。而在最新一項(xiàng)針對(duì)歐洲六國(guó)食品中PAs 污染水平的調(diào)查中，Mulder 等[25]發(fā)現(xiàn)92%的茶中均有較高水平PAs 檢出，平均含量為460 μg/kg；花草茶、紅茶、綠茶等幾乎所有類型的茶葉均存在不同程度的PAs污染風(fēng)險(xiǎn)，盡管不同類型茶中PAs 組成和濃度不同。有研究表明，千里光寧堿型、天芥菜堿型、石松胺型、奧索千里光裂堿型及野百合堿型是污染茶葉的5 種主要PAs/PANOs 類型，其中千里光寧堿型是占比最高的PAs，約占PAs 總量的77%以上[7,13]。污染茶葉中約1/3 的PAs 由游離堿組成，2/3 由PANOs組成。如Mulder 等[25]的研究表明污染茶葉中千里光寧堿的氮氧化物的含量在60～200 μg/kg 之間，約占茶葉中總PAs 含量的一半。

事實(shí)上，茶葉本身并不含PAs，因茶園存在如一點(diǎn)紅、千里光等含PAs 的雜草，在采收階段會(huì)意外地被共同采收而造成茶葉PAs 污染。最近有研究還指出在茶葉種植階段PAs 可能通過(guò)土壤、水等發(fā)生自然轉(zhuǎn)移從而間接污染茶葉[17-18]。Selmar 等[11]用干燥的千里光葉（一種產(chǎn)生PAs 的植物）覆蓋薄荷和甘菊（不含PAs 的植物）初步證實(shí)了后者可通過(guò)土壤吸收PAs。為了進(jìn)一步證實(shí)這種通過(guò)土壤的水平自然轉(zhuǎn)移也可能發(fā)生在附近生長(zhǎng)的活植物中，Selmar 等[12]在將千里光與歐芹（一種不含PAs 的植物）共同種植于同一盆中，據(jù)觀察由千里光供體植物產(chǎn)生的PAs轉(zhuǎn)移到歐芹植物中。Izcara 等[41]在最近一項(xiàng)針對(duì)野生牛至的研究中也提出了PAs/PANOs 是通過(guò)土壤進(jìn)行水平自然轉(zhuǎn)移。以上這些研究結(jié)果強(qiáng)化了通過(guò)土壤作為污染途徑的水平自然轉(zhuǎn)移理論，因此諸如茶葉、香料等植物源食品中PAs 污染物的出現(xiàn)不應(yīng)僅被視為收獲期間意外共同采收含PAs 的外來(lái)植物而造成的交叉污染或人為摻假，還有可能是通過(guò)土壤的水平自然轉(zhuǎn)移造成的間接污染。

除了茶葉，近年來(lái)也有研究對(duì)其他植物源衍生產(chǎn)品如谷物和沙拉中PAs 的污染進(jìn)行了評(píng)估，其污染程度相對(duì)較輕。實(shí)際上，自從谷物類糧食作物生產(chǎn)過(guò)程中引入了較為嚴(yán)格和規(guī)范的農(nóng)業(yè)控制措施后，已有效避免了谷物中出現(xiàn)雜草和外來(lái)種子，并大大降低了谷物類食品中PAs 的污染風(fēng)險(xiǎn)[19]。然而，有研究表明，從嚴(yán)重污染的谷物中完全去除含有PAs 的外來(lái)種子后，剩余“清潔”的谷物中仍可檢測(cè)到PAs[42]。同時(shí)也有許多研究報(bào)道了在小麥、面粉和其他谷物制品中檢測(cè)到低水平PAs[43-44]。關(guān)于沙拉，目前已知的用于制作沙拉的可食用植物均不會(huì)產(chǎn)生PAs。但是，一些產(chǎn)生PAs 的雜草因其葉子與可食蔬菜葉子的外觀極為相似而在某些不知情的情況下被誤作為沙拉進(jìn)行市售，歐洲市面上銷售的芝麻菜中檢出有PAs 就屬于這種情況[7]。如Picron 等[13]分析的17個(gè)預(yù)包裝沙拉樣品中有70%樣品受到低于0.1 ng/g的PAs/PANOs 污染，其中有三個(gè)樣品的污染濃度高達(dá)2.59、5.20 和10.47 ng/g。2007 年德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng) 估 研 究 所（Bundesinstitut für Risikobewertung，BfR）也報(bào)道了德國(guó)某超市出售的沙拉中意外發(fā)現(xiàn)普通雜草千里光葉子的典型案例。沙拉中PAs 的污染很可能是由于產(chǎn)PAs 的雜草與可食蔬菜共同收獲或交叉污染造成的[7]。近年來(lái)隨著人們消費(fèi)習(xí)慣的改變，尤其是對(duì)純天然有機(jī)食品的推崇，使得含PAs 雜草在人類膳食中的暴露風(fēng)險(xiǎn)增加，從而誘發(fā)了嚴(yán)重的食品安全隱患。另外，由于飲食習(xí)慣等因素，一些含PAs 的植物仍會(huì)被用于制作醬汁等調(diào)味料，也常出現(xiàn)在烹飪香料中。早在2003 年Rasenack 等[45]就報(bào)道了香料中出現(xiàn)的PAs 可能造成了胎兒死于肝功能衰竭。最近這兩年，食品和飼料安全警報(bào)（Food and Feed Safety Alerts，RASFF）的門戶網(wǎng)站上針對(duì)香料和香草等的警報(bào)明顯增加，特別是在牛至樣品發(fā)現(xiàn)了大量PAs，其含量范圍在6660～133870 μg/kg[46]。

納他霉素也可在發(fā)酵過(guò)程中添加，抑制雜菌生長(zhǎng)，促進(jìn)優(yōu)勢(shì)菌群生長(zhǎng)繁殖。韓德權(quán)[33]將納他霉素應(yīng)用于酸菜發(fā)酵過(guò)程中，酵母菌、霉菌等雜菌的生長(zhǎng)被抑制，而乳酸菌生長(zhǎng)不受影響，使產(chǎn)品香氣明顯改善，酸菜的感官品質(zhì)明顯提高。

2.2 蜂蜜及其衍生產(chǎn)品中的PAs

蜂蜜及其衍生產(chǎn)品是研究最為廣泛且相對(duì)較早的食品基質(zhì)，其PAs/PANOs 的污染水平較高，究其原因是花粉中PAs 被意外或人為引入花蜜從而污染蜂蜜及其相關(guān)產(chǎn)品[7,42,47]。自然界中含PAs 的藍(lán)薊屬（Echiumspp.）、千里光屬（Seneciospp.）等植物常意外或人為的成為蜜蜂采食對(duì)象[21,48]。Kempf 等[49]對(duì)德國(guó)市場(chǎng)上的200 余種蜂蜜進(jìn)行了PAs 污染調(diào)查分析，研究發(fā)現(xiàn)有19 個(gè)樣品檢出PAs，含量范圍在19～120 μg/kg。Martinello 等[28]對(duì)意大利當(dāng)?shù)爻辛闶鄣姆涿圻M(jìn)行了PAs 含量分析，結(jié)果表明陽(yáng)性樣品中PAs 的含量范圍在1～169 mg/kg。2016 年，歐洲藥品監(jiān)管局（European Medicine Agency, EMA）規(guī)定了PAs 的監(jiān)測(cè)清單，并對(duì)其進(jìn)行相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，建議成人每日攝入量不超過(guò)0.35 μg[50]。我國(guó)目前對(duì)蜂蜜中殘留的PAs 也開展了一些調(diào)查研究，但尚缺乏系統(tǒng)性風(fēng)險(xiǎn)排查以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究，最大殘留限量等安全評(píng)價(jià)指標(biāo)也處于缺失狀態(tài)。昝珂等[51]對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)采購(gòu)的30 批蜂蜜樣品進(jìn)行28 種PAs/PANOs 化合物的分析測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有10 批樣品檢出PAs，陽(yáng)性樣品中總含量為4.85～78.34 μg/kg。He 等[52]對(duì)國(guó)內(nèi)市售蜂蜜中的PAs 污染進(jìn)行了全面調(diào)查，從我國(guó)17 個(gè)地區(qū)采購(gòu)的255 份蜂蜜樣品中檢出的陽(yáng)性樣品占比為58%，總PAs 含量范圍在0.2～281.1 mg/kg之間；此外，還發(fā)現(xiàn)蜂蜜中的PAs 種類及污染水平存在地理環(huán)境差異，我國(guó)國(guó)內(nèi)市售蜂蜜樣品中檢出了野百合堿型PAs（來(lái)自豬屎豆屬），該類型PAs 化合物與藍(lán)薊定（來(lái)自車前草）和石松胺型（來(lái)自千里光屬）是我國(guó)蜂蜜中污染最主要的三類PAs 化合物。其他國(guó)家蜂蜜中PAs 污染水平及種類同樣受地理來(lái)源的影響，如Picron 等[35]2020 年在比利時(shí)進(jìn)行的一項(xiàng)市場(chǎng)調(diào)查中，評(píng)估了來(lái)自于比利時(shí)本土，其他歐洲國(guó)家及拉丁美洲等不同國(guó)家地區(qū)的蜂蜜樣品中PAs 的污染情況，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)比利時(shí)本土的蜂蜜受PAs 污染的程度相對(duì)較低，陽(yáng)性樣品占比為67%，而其他國(guó)家的蜂蜜中PAs 陽(yáng)性樣品占比高達(dá)90%，且污染樣品主要來(lái)自于西班牙等地中海國(guó)家；另外，比利時(shí)原產(chǎn)蜂蜜主要受天芥菜型PAs 的污染，地中海蜂蜜的PAs 污染物主要包括印美定、藍(lán)薊定、石松胺型與天芥菜堿型4 種類型，其中石松胺與天芥菜堿是最主要的類型，而在產(chǎn)自希臘的蜂蜜中首次檢出有歐天芥菜堿型PAs 化合物，這種污染差異可能與比利時(shí)及地中海當(dāng)?shù)夭煌闹参锓N群分布密切相關(guān)。

除蜂蜜外，花粉、蜂膠和蜂王漿等膳食補(bǔ)充劑以及零食、糖果等蜂蜜類制品也均被發(fā)現(xiàn)會(huì)受到PAs的污染。如Mulder 等[25]在對(duì)歐洲蜂產(chǎn)品PAs 污染的調(diào)查研究中發(fā)現(xiàn)，花粉相關(guān)產(chǎn)品中PAs 陽(yáng)性檢出率約為91.6%，平均濃度為576.0 μg/kg，而蜂膠和蜂王漿產(chǎn)品中PAs 的平均濃度分別為0.6 和15.5 μg/kg，由此可見，花粉類膳食補(bǔ)充劑更易受PAs 污染。Picron 等[35]發(fā)現(xiàn)PAs 呈陽(yáng)性的花粉樣品中，其檢出濃度可高達(dá)1672 μg/kg?；ǚ蹣悠分邪l(fā)現(xiàn)的主要生物堿有石松胺、藍(lán)薊定、印美定等化合物及其相應(yīng)的氮氧化物，其次有少量的千里光寧堿型PAs。另外，相較于蜂蜜類膳食補(bǔ)充劑，零食、糖果等含蜂蜜類的衍生產(chǎn)品受PAs 污染的水平較低。如Kempf 等[53]2010年對(duì)含一定蜂蜜成分的60 余種產(chǎn)品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)8 種產(chǎn)品有PAs 檢出，濃度范圍在10～484 μg/kg。2011 年Kempf 等[47]又對(duì)10 種糖果、7 種能量棒和麥片、5 種軟飲料、3 種嬰兒食品和3 種嬰兒果凍及其他含蜂蜜食品進(jìn)行了分析，僅在2 種糖果中檢出有PAs，濃度分別為10 和40 ng/g。2020 年P(guān)icron等[35]對(duì)早餐麥片等39 種含蜂蜜類零食進(jìn)行PAs 污染評(píng)估，發(fā)現(xiàn)1/3 的零食和54%的糖果受到PAs 污染，最大污染水平分別為0.36 和7.61 ng/g。以上這些研究均證實(shí)了含PAs 的蜂蜜在食物鏈下游的污染。

2.3 動(dòng)物源相關(guān)衍生制品中PAs

目前，在動(dòng)物源性產(chǎn)品中發(fā)現(xiàn)PAs 污染的情況并不常見。但是，鑒于動(dòng)物采食的牧場(chǎng)或田地中可能存在產(chǎn)PAs 的植物或飼料，因此在肉、蛋、奶等動(dòng)物性產(chǎn)品中可檢測(cè)到少量PAs[7,25,54]。如Diaz 等[55]報(bào)道雞蛋中發(fā)現(xiàn)的PAs 污染物主要是其游離堿類型，其氮氧化物PANOs 對(duì)污染的貢獻(xiàn)較小。Edgar等[56]報(bào)道產(chǎn)蛋雞因谷物飼料成分中含有天芥菜和車前草從而造成雞蛋中PAs 污染，濃度范圍在5～168 mg/kg 之間。Mulder 等[25]對(duì)歐洲市場(chǎng)進(jìn)行的一項(xiàng)最新調(diào)查分析中顯示，6%的牛奶樣本和1%的雞蛋樣本檢出PAs 陽(yáng)性，其中有一或兩種牛奶樣品其PAs 含量高于檢出限，雞蛋中PAs 的污染濃度為0.1～0.12 μg/kg。

3 PAs 的限量標(biāo)準(zhǔn)與安全風(fēng)險(xiǎn)管理

由于PAs 在自然界中的廣泛存在，含PAs 食品的安全性已成為國(guó)內(nèi)外相關(guān)監(jiān)管機(jī)構(gòu)和部門共同關(guān)注的熱點(diǎn)。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)13 種可誘發(fā)大鼠肝臟腫瘤的PAs/PANOs，其中倒千里光堿、毛果天芥菜堿、野百合堿等被列為2B 類致癌物[16]。由于PAs對(duì)人體健康造成的潛在危害，許多國(guó)家和機(jī)構(gòu)對(duì)PAs 的安全攝入量作出明確規(guī)定，如1989 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）頒布了《IPCS 健康與安全指南第26 號(hào)》，建議PAs 的日攝入限量為15 μg/kg[3]；2005 年荷蘭國(guó)家公共衛(wèi)生和環(huán)境研究所建議的每日安全攝入量為0.00043 μg/kg[17]；2008 年英國(guó)毒性委員會(huì)規(guī)定PAs 每日攝入量不高于0.007 μg/kg；2013 年德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所（Bundesinstitut für Risikobewertung， BfR）的建議值同樣是不超過(guò)0.007 μg/kg[57]；歐洲藥物管理局則規(guī)定成人的每日攝入量不超過(guò)0.35 μg/kg，兒童為0.007 μg/kg[58]；美國(guó)食品藥品管理局禁止含PAs 的紫草科植物用于食品加工業(yè)[18]；同樣，比利時(shí)禁止將產(chǎn)PAs 的植物琉璃苣作為食品食用，而其種子壓榨的油也只能在用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法分析不含PAs 后才能用于膳食補(bǔ)充劑。最近，歐盟委員會(huì)（EU）于2020年新修訂的1881/2006 號(hào)法規(guī)對(duì)一些食品中PAs 的最大允許限量進(jìn)行了規(guī)定[59]。如表2 所示，不同食品中PAs/PANOs 的最大允許濃度水平范圍在1.0～1000 μg/kg 之間。此外，歐盟食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）還推薦了在食品中必須監(jiān)測(cè)的21 種PAs/PANOs 清單[13]。然而，我國(guó)目前尚未對(duì)PAs 的攝入量及食品中PAs 的最大允許限量作出明確規(guī)定與建議。

表2 不同食品中PAs（含其氮氧化物）的最大允許濃度Table 2 Maximum concentration levels for pyrrolizidine alkaloids (including N-oxides) in different food products

4 食品中PAs/PANOs 的分析檢測(cè)方法

4.1 提取

根據(jù)PAs 的結(jié)構(gòu)特征可知，PAs 是含有特征性堿性氮的還原性生物堿，極易被氧化為相應(yīng)的氮氧化物PANOs。PAs 與PANOs 均屬于極性較強(qiáng)的有機(jī)化合物，提取溶劑常用甲醇、乙醇等極性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑或與水的混合溶液[60]。PAs 在pH 較低時(shí)以離子形式存在，因此往提取溶劑中加入一定量的酸（0.05～1.00 mol/L）可提高萃取效率[16]。目前，應(yīng)用于植物中PAs/PANOs 的提取方式主要有沸水提取、超聲波輔助提取、微波萃取及超臨界流體萃取等[23,61-63]。

4.2 凈化

食品基質(zhì)成分復(fù)雜，需對(duì)其進(jìn)行凈化以減少雜質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾。近年來(lái)關(guān)于PAs 從食品基質(zhì)中凈化的方式有傳統(tǒng)液液萃?。↙iquid-liquid extraction， LLE）、固相萃取（Solid phase extraction，SPE）、QuEChERS（Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe）法以及分散液-液微萃取（Dispersive liquidliquid microextraction，DLLME）等新型前處理方法[34,41,64-69]。

固相萃?。⊿PE）是基于液相色譜的選擇性吸附與洗脫原理，去除雜質(zhì)的同時(shí)對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行富集，具有易于操作、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，是迄今為止應(yīng)用最為廣泛的純化PAs 的方法。前期常應(yīng)用的SPE 小柱有C8柱、C18柱及強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（SCX）等，近年來(lái)SCX-SPE 柱常用于PAs 凈化，其優(yōu)點(diǎn)是在有效去除極性雜質(zhì)的同時(shí)可將PAs 及PANOs 以高產(chǎn)率準(zhǔn)確洗脫[71]。如許秀麗等[72]以甲醇甲酸水溶液提取茶葉樣品中的PAs，經(jīng)超聲提取后，采用SCX-SPE 柱凈化，15 種PAs 的回收率均達(dá)到70%以上。Wang等[33]采用SCX-SPE 柱對(duì)蜂蜜樣品中12 種PAs 進(jìn)行凈化，回收率為79%～104%。此外，有研究表明混合型陽(yáng)離子交換固相萃取柱（PCX-SPE）可同時(shí)提供離子交互與反相保留的兩種保留模式，顯著提高了凈化能力[23,73]。值得強(qiáng)調(diào)的是，固相萃取凈化前通常需要將待測(cè)樣品提取液的pH 范圍調(diào)節(jié)至6.0～7.0 的中和狀態(tài)或9.0～11.0 的堿性范圍之間，尤其是在使用諸如C8及C18等反相吸附材料時(shí)，上樣液處于中性或堿性范圍時(shí)可促進(jìn)目標(biāo)分析物與吸附劑之間的相互作用。

QuEChERS 法常用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中多種目標(biāo)物的提取凈化，近年來(lái)也漸漸被應(yīng)用于測(cè)定多種食品基質(zhì)中的PAs，但該方法必須用鋅粉還原PANOs[16]。Izcara 等[41]采用QuEChERS 法，在僅使用少量樣品（0.2 g）、有機(jī)溶劑（1 mL）、凈化吸附劑（175 mg）及分配鹽（0.65 g）的情況下，即實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛至樣品中21 種PAs/PANOs 的凈化處理，符合綠色分析化學(xué)原則并表現(xiàn)出良好的方法性能，回收率在77%～96%范圍內(nèi)。

近年來(lái)也有諸如分散液液萃?。―LLME）等新型技術(shù)嘗試應(yīng)用于植物等復(fù)雜基質(zhì)中PAs 的前處理過(guò)程。鑒于其省時(shí)、消耗溶劑少、萃取效率高等優(yōu)勢(shì)而具有應(yīng)用潛力。Celano 等[34]在最近的另一項(xiàng)研究工作中使用最小體積的有機(jī)溶劑（500 μL 的氯仿）和分散劑（500 μL 的異丙醇），建立了基于DLLME 的超高效液相色譜-質(zhì)譜方法，從蜂蜜樣品中微萃取出9 種PAs/PANOs 化合物并對(duì)其進(jìn)行測(cè)定，回收率在63%～103%之間，自述實(shí)際樣品的分析結(jié)果與SPE相當(dāng)。QuEChERS 法與DLLME 法均秉持簡(jiǎn)化前處理操作的原則，且具有綠色環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，被逐漸應(yīng)用到茶葉等復(fù)雜食品基質(zhì)中多種PAs 的痕量分析中。隨著前處理技術(shù)的不斷發(fā)展，目前一些新型前處理技術(shù)如固相微萃取、分子印跡法等不斷應(yīng)用于PAs 等生物堿的檢測(cè)分析中[57,74]。新型前處理技術(shù)具有萃取效率高、綠色、環(huán)保等優(yōu)勢(shì)，有望成為未來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種PAs 痕量分析的主要趨勢(shì)。

4.3 分析技術(shù)

食品基質(zhì)中PAs 的分析檢測(cè)方法有分光光度法、毛細(xì)管電泳法、免疫學(xué)方法、核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）法、色譜學(xué)方法以及近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的基于LC-MS、GC-MS 等色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的高精度分析方法[7]。

分光光度法和薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）的檢測(cè)原理均是基于顯色反應(yīng)，如PAs 的吡咯衍生物可與Ehrilich 試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生具有特征吸收波長(zhǎng)的絡(luò)合物，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)便，但存在靈敏度低、檢出限高等問(wèn)題[75-77]。酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）針對(duì)性的對(duì)某個(gè)特定PAs 進(jìn)行分析和快速篩查，不能準(zhǔn)確獲得含量信息，主要用于PAs 的毒理學(xué)研究[78]。NMR 法具有強(qiáng)大的定性分析能力，可實(shí)現(xiàn)無(wú)損檢測(cè)，主要應(yīng)用于PAs 的結(jié)構(gòu)鑒定，較低的靈敏度是制約其應(yīng)用的主要瓶頸[79]。

GC 和GC-MS 法可用于大多數(shù)PAs（除奧索千里光裂堿）的分析；由于PAs 難揮發(fā)的特點(diǎn)，需對(duì)其進(jìn)行衍生化處理后再用GC 或GC-MS 分析[7,80-82]。GC 和GC-MS 的局限性還在于其不能對(duì)PANOs 進(jìn)行分析，需將其轉(zhuǎn)化后為相應(yīng)的游離PAs 后再進(jìn)行分析，該策略又稱為“求和參數(shù)法”。該策略最早由Kempf 等[47,81]提出，其建立了分析蜂蜜中1,2-不飽和PAs 的GC-MS 方法，具體操作是經(jīng)溶劑提取后，先采用Zn2+粉將PANOs 還原為相應(yīng)的游離PAs，然后經(jīng)凈化處理后用LiAlH4 將所有不飽和PAs 轉(zhuǎn)化為同一種類型的化合物（具有共同的千里光次堿骨架結(jié)構(gòu)），再用衍生試劑（N-甲基-N-三甲硅基三氟乙酰胺）進(jìn)行對(duì)所有PAs 進(jìn)行衍生化處理，最后上機(jī)分析衍生物。該方法的定量限為0.01 mg/L，后來(lái)也應(yīng)用于其他基質(zhì)的報(bào)道[83-85]。GC-MS 法雖在一定程度上提高了方法靈敏度，但是衍生化操作耗時(shí)繁瑣，PAs穩(wěn)定性差易分解，目前PAs/PANOs 法分析中已較少使用。

HPLC 法無(wú)需衍生處理，但由于PAs 的最大紫外吸收較弱，檢測(cè)靈敏度低，難以滿足痕量分析的要求。因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）是目前分析食品樣品中PAs/PANOs 的最主要的檢測(cè)手段[1,9,52,86]。PAs/PANOs 屬極性化合物，色譜柱固定相選擇反相色譜柱；流動(dòng)相選用甲醇/水或乙腈/水，并在水相中添加適量酸或堿以提高分離度[7]。電噴霧（Electron Spray Ionization，ESI）與大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ion source，APCI）是LC-MS/MS 常采用的離子源，其中ESI 的應(yīng)用更廣。已有文獻(xiàn)報(bào)道了部分PAs 的[M+H]+離子的MS/MS 的碎裂途徑[9]（見圖3）。Yoon 等[39]利用LC-MS/MS 結(jié)合冷凍脂質(zhì)沉淀和固相萃取凈化分析測(cè)定了高脂食品中的9 種PAs 化合物，檢出限為0.06～0.60 ng/mL。Dzuman 等[87]基于UPLC-MS/MS建立了一種更靈敏的方法用于分析牛至等食品中的PAs/PANOs，定量限為0.5～10 μg/kg。LC-MS/MS具有高選擇性、高靈敏度等諸多優(yōu)點(diǎn)，但有些PAs/PANOs 尚缺乏商業(yè)化的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這在一定程度上限制了LC-MS/MS 在高通量分析。

圖3 部分PAs 的特征質(zhì)量碎裂途徑[9]Fig.3 Mass fragmentation pathways of partial PAs[9]

基于高分辨質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)測(cè)定優(yōu)勢(shì)，結(jié)合液相色譜開發(fā)的聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS），無(wú)需對(duì)每個(gè)化合物的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品中未知PAs/PANOs 的結(jié)構(gòu)及其同分異構(gòu)體的篩選鑒定和痕量分析。超高效液相色譜-四級(jí)桿/軌道阱質(zhì)譜（ultra high-performance liquid chromatography-qua drupole/Exactive Orbitrap mass spectrometry，UPLCQ Exactive-MS）與超高效液相色譜-四級(jí)桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra high-performance liquid chromatography-quadrupole/time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）是目前用于復(fù)雜樣品中的生物堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析和確證分析的主要技術(shù)[88-91]。Jeong等[90]建立了可快速準(zhǔn)確分析植物樣本中PAs 的UPLC-ESI-Q-TOF-MS 方法，檢出限為0.4～2.0 ng/mL，定量限為0.6～6.0 ng/mL。Martinello 等[88]發(fā)現(xiàn)，與Q-TOF-MS 相比UPLC-Q Exactive-MS 可實(shí)現(xiàn)更高的的分辨率。

5 食品加工和烹飪制作對(duì)PAs/PANOs 的影響

5.1 熱處理對(duì)PAs/PANOs 的影響

近年來(lái)，PAs/PANOs 在蜂蜜[52]、茶葉[83]、谷物[44]、肉類[92]、雞蛋[55]及牛奶[93]等多種農(nóng)產(chǎn)品中均能檢出。為了更加真實(shí)評(píng)估人類對(duì)PAs 的膳食暴露，針對(duì)這種生物堿污染的原材料開展加工工藝或烹飪制作對(duì)其PAs/PANOs 含量水平影響的研究則很有必要。食品加工或烹飪制作中最普遍的工藝是熱處理，因此有關(guān)PAs/PANOs 在加熱過(guò)程中的穩(wěn)定性、含量種類變化及相關(guān)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測(cè)等方面的研究也很重要。實(shí)際上，早在20 世紀(jì)初就報(bào)道了多起因食用被PAs/PANOs 污染的谷物制作的面包而引發(fā)的嚴(yán)重生物堿中毒案例，這也反映了PAs/PANOs在烘烤的加熱工藝下，具有一定的熱穩(wěn)定性[94]。70 年代進(jìn)行的另一項(xiàng)研究同樣表明加熱并不會(huì)破壞污染肉中的PAs[95]。Rosemann 等[96]還專門開展了針對(duì)倒千里光堿（1,2-不飽和PAs）在食品加工過(guò)程中的熱穩(wěn)定性研究，該實(shí)驗(yàn)用被已知濃度倒千里光堿污染的玉米粉來(lái)制備玉米粥，沸水浴加熱處理3 h 后分別對(duì)原材料玉米粉和最終產(chǎn)品玉米粥中的倒千里光堿進(jìn)行分析以便進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明玉米粥中的倒千里光堿的含量?jī)H有少量減少，但差異不顯著，分析含量減少的真正原因很可能是加熱過(guò)程中乳劑的形成導(dǎo)致了提取效率降低，不是蒸煮過(guò)程中倒千里光堿自身的熱不穩(wěn)定性引起的降解。為了進(jìn)一步驗(yàn)證，該實(shí)驗(yàn)又對(duì)涼茶樣品進(jìn)行了類似的加熱處理，結(jié)果同樣顯示未煮過(guò)的涼茶原材料與煮過(guò)的涼茶樣品中倒千里光堿的含量沒有顯著差異。因此，該研究得出的結(jié)論是在正常的加熱烹飪過(guò)程中倒千里光堿具有熱穩(wěn)定性，其濃度含量不受高溫影響。但是，也有研究得出相反結(jié)論，即加熱工藝可以影響樣品中PAs 與其氮氧化物PANOs 的比例關(guān)系以及PAs 的總含量。如Boppré等[97]采用加熱的方式干燥被PAs污染的花粉，結(jié)果表明PANOs 降解轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的游離PAs，導(dǎo)致其數(shù)量大大減少，但是PAs 的總量保持不變。而Kaltner 等[98]的研究則發(fā)現(xiàn)被PAs 污染的蜂蜜在20 ℃下長(zhǎng)期儲(chǔ)藏時(shí)，PANOs 的含量水平隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷下降，但并沒有降解轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的PAs，意味著PAs 的總量減少了。以上兩項(xiàng)研究工作得出的結(jié)論有不一致的地方，但基本可以得出加熱條件會(huì)造成PANOs 含量的降低。此外，針對(duì)茶葉、草藥等樣品的特殊加熱處理方式主要是浸提工序，這會(huì)在很大程度上影響最終產(chǎn)品中PAs 含量。然而，目前僅有少數(shù)研究對(duì)此影響進(jìn)行了評(píng)估。Picron 等[13]采用沸水沖泡的方式對(duì)不同品種的干茶進(jìn)行浸提以研究此過(guò)程中PAs 的轉(zhuǎn)移效率，結(jié)果表明經(jīng)沸水沖泡后干茶葉中僅有16%～28%的PAs/PANOs 轉(zhuǎn)移至浸提液中（野百合堿除外，為45%）。值得注意的是，茶葉、草藥等的浸提工藝會(huì)涉及許多參數(shù)，如浸提時(shí)間、溫度、葉子的顆粒大小等，這些都可能對(duì)PAs/PANOs 的轉(zhuǎn)移效率產(chǎn)生影響。如Chen等[99]評(píng)估了茶葉顆粒大小對(duì)PAs/PANOs 的浸提效果的影響，結(jié)果表明用粉碎茶葉末沖泡得到浸提液中的PAs 含量比用完整茶葉葉片沖泡得到的浸提液中PAs 的含量高1.1～4.1 倍。

5.2 發(fā)酵工藝對(duì)PAs/PANOs 的影響

除熱處理外，發(fā)酵工藝也是食品加工中常用到的工藝之一。Kempf 等[53]通過(guò)分析含蜂蜜成分的糖果和蜂蜜酒中的PAs/PANOs 的污染狀況得出蜂蜜原材料在經(jīng)過(guò)加熱和/或發(fā)酵處理后仍可將PAs/PANOs 污染延續(xù)到最終產(chǎn)品中。Picron 等[35]同樣證實(shí)了被PAs/PANOs 污染蜂蜜的下游食品中，如糖果和零食中仍可檢測(cè)到PAs/PANOs，只是陽(yáng)性產(chǎn)品檢出率為1/3 且污染水平相對(duì)較低。Cao 等[64]以已知PAs/PANOs 濃度污染的蜂蜜為原料制備蜂蜜酒，評(píng)估發(fā)酵過(guò)程如何影響PAs/PANOs 的含量，研究結(jié)果表明在制備的蜂蜜酒樣品中檢出的PAs 含量約為原蜂蜜中含量的30%和70%，但是仍不確定這種顯著減少是由于發(fā)酵過(guò)程本身還是制備過(guò)程中的稀釋作用。

綜上所述，目前所開展的這些研究工作僅僅評(píng)估了常見的熱處理、發(fā)酵等加工工藝對(duì)PAs/PANOs的含量的影響，研究結(jié)論存在不一致的地方且影響機(jī)制尚不明確，而關(guān)于其他加工技術(shù)如烘烤、油炸、煮沸、微波處理等對(duì)PAs/PANOs 含量是如何影響的仍處于空白。鑒于此，有必要在這一領(lǐng)域進(jìn)行更加細(xì)致和深入的研究，這將有助于可靠地評(píng)估PAs/PANOs 的真實(shí)攝入量和膳食暴露水平以便對(duì)其制定更有效和安全的監(jiān)管措施。

6 結(jié)論與展望

PAs 是一種天然代謝產(chǎn)物，其不飽和型PAs 及大部分PANOs 具有毒性。近年來(lái)，PAs 污染問(wèn)題在蜂蜜、茶葉等食品中均有不同程度發(fā)現(xiàn)。長(zhǎng)時(shí)間接觸含PAs/PANOs 的食品，即使是含量較少也很容易導(dǎo)致其在體內(nèi)的累積，最終引起毒性事件的發(fā)生。鑒于食品中PAs 對(duì)人體健康造成的潛在危害，目前已有多個(gè)國(guó)家和機(jī)構(gòu)針對(duì)個(gè)別食品制定了PAs 最大允許含量的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或措施。但是，由于PAs 種類繁多，食品基質(zhì)復(fù)雜，有關(guān)PAs/PANOs 的加工穩(wěn)定性方面的研究數(shù)據(jù)有限且不確定等原因，對(duì)PAs/PANOs 的實(shí)際攝入量做出可靠和準(zhǔn)確評(píng)估并對(duì)其制定合理的限量標(biāo)準(zhǔn)及風(fēng)險(xiǎn)管理措施仍是未來(lái)面臨的一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性工作。為此，這一領(lǐng)域仍有大量工作亟需開展：覆蓋更為全面的食品基質(zhì)并對(duì)其進(jìn)行廣泛的PAs 污染狀況調(diào)查與研究，盡可能多地了解并掌握所有可能被PAs 污染的食品種類及其污染程度；對(duì)更多PAs 同系物及其可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行毒理學(xué)研究以評(píng)估可能存在化學(xué)結(jié)構(gòu)-毒性關(guān)系，進(jìn)一步補(bǔ)充PAs 污染物監(jiān)測(cè)清單；對(duì)潛在被污染的原材料，進(jìn)行不同食品加工技術(shù)或烹飪制備對(duì)PAs/PANOs 穩(wěn)定性影響的研究以評(píng)估更為真實(shí)的膳食暴露；根據(jù)PAs/PANOs 在不同食品基質(zhì)中的污染狀況，開發(fā)更為靈敏、高效、且綠色環(huán)保的分析檢測(cè)技術(shù)，以形成系統(tǒng)化的控制方法與標(biāo)準(zhǔn)，有效確保食品質(zhì)量安全。