體外模擬消化過程中余甘子果實(shí)及醇提物的活性成分和抗氧化能力的變化

吳 娜，朱孛琛，章 旭，董方鈺，劉 姣，陳 芳，鄧澤元，潘 瑤,*

（1.南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江西南昌 330000；2.南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌 330000）

余甘子（Phyllanthus emblicaLinn），也稱滇橄欖、庵摩勒（古代名）或印度醋栗等[1-2]，在我國南部地區(qū)分布廣泛[3]，其根、葉、果實(shí)均可入藥，是世界多個(gè)國家及民族傳統(tǒng)藥學(xué)體系中的重要藥物[4]。在我國，《本草綱目》稱其“久服輕身，延年益壽”，現(xiàn)已被載入《中國藥典》[5]。我國《“十四五”國民健康規(guī)劃》提出“食藥同源”等健康產(chǎn)業(yè)進(jìn)入快速發(fā)展期，相關(guān)健康產(chǎn)業(yè)將成為中國經(jīng)濟(jì)發(fā)展的新引擎和新動(dòng)力。然而，作為一種“食藥同源”的作物，少有研究將余甘子作為日常膳食中的水果來源，從食品角度探究其健康效應(yīng)及其影響因素，也少有研究探索其經(jīng)消化道消化后，其健康效應(yīng)的差異。現(xiàn)代研究表明，余甘子富含多酚、黃酮類、氨基酸、維生素[6]等成分，具有抗氧化[7]、抗衰老[8]、抗炎[9]、抗腫瘤[10]等多種健康效應(yīng)。國內(nèi)外大量研究證實(shí)，余甘子所富含的多酚和黃酮類植物化學(xué)物具備較強(qiáng)的抗氧化能力，這是其表現(xiàn)健康效應(yīng)的關(guān)鍵因素[11-12]。

多酚和黃酮類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物的主要成分，也是膳食抗氧化劑重要成分[13]。水果、蔬菜中的植物化學(xué)物具有安全、無毒、高效、易得等特點(diǎn)，可以清除體內(nèi)過多的自由基，使之保持在正常的生理范圍內(nèi)[14]。膳食多酚類化合物容易與其他組分（如蛋白質(zhì)、糖類等）結(jié)合形成衍生物，可以按其結(jié)合程度[15]將膳食多酚分為游離型多酚和結(jié)合型多酚。研究認(rèn)為，容易被溶劑（如水、甲醇、乙醇等）提取出來的多酚為游離型多酚，而溶劑提取之后的殘?jiān)写嬖诘闹饕墙Y(jié)合型多酚。結(jié)合型多酚容易與細(xì)胞壁中的脂蛋白以及纖維素等緊密結(jié)合，很難被提取出來。研究發(fā)現(xiàn)富含食物基質(zhì)的植物化學(xué)物相較于提取物對(duì)細(xì)胞及動(dòng)物體內(nèi)抗氧化指標(biāo)表現(xiàn)出顯著差異[16]。此外，研究表明，多酚類物質(zhì)在被吸收前，會(huì)在胃腸道發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變或降解[17]，且其抗氧化能力在消化前后也有顯著差異[18]。目前關(guān)于余甘子多酚、黃酮抗氧化能力的研究，多停留在其果汁或提取物的游離型多酚的體外抗氧化能力上,如楊冰鑫等[19]利用乙醇對(duì)余甘子多酚進(jìn)行提取，并通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)提取物具有很強(qiáng)的抗氧化能力；趙謀明等[20]和李張偉等[21]也得出了相似的結(jié)論。然而，我國現(xiàn)有研究一方面未系統(tǒng)地分析鑒定余甘子中的多酚和黃酮類物質(zhì)，不能為闡述余甘子健康效益提供理論基礎(chǔ)；另一方面國內(nèi)外的研究缺乏考慮消化過程對(duì)余甘子多酚和黃酮類物質(zhì)的影響，不具有膳食指導(dǎo)價(jià)值；此外，尚未有基于“全食品”概念[22]，全面研究比較全食物基質(zhì)為代表的余甘子果實(shí)凍干粉和以提取物為代表的余甘子醇提物在消化過程中的差異。因此，未能進(jìn)一步挖掘余甘子作為“食藥同源”果實(shí)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益，將很大程度上制約余甘子營養(yǎng)價(jià)值提升與功能食品的研發(fā)。

通過人體實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來探究余甘子中多酚類物質(zhì)在人體消化過程中的含量變化存在諸多困難，而體外模擬消化具有操作簡單、易行、實(shí)驗(yàn)條件易于控制、實(shí)驗(yàn)周期較短的優(yōu)點(diǎn)，成為研究食物在人體胃腸道消化中變化的重要途徑[23]。因此，本文以余甘子凍干粉和醇提物作為研究對(duì)象，利用高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（High Performance Liquid Chromatography Quadrupole Time of Flight Mass Spectrometry，HPLC-QTOF-MS/MS）對(duì)余甘子醇提物和凍干粉主要進(jìn)行分析鑒定，通過體外模擬消化模型探討在各階段（口腔、胃、小腸和大腸）的消化液中多酚與黃酮含量以及抗氧化活性的變化情況，比較余甘子醇提物和凍干粉在上述階段多酚與黃酮含量和抗氧化活性的差異。該研究有望為余甘子的加工利用、營養(yǎng)價(jià)值提升和相關(guān)功能食品的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子果實(shí) 產(chǎn)自江西贛州，為新鮮無損果實(shí)；α-淀粉酶（酶活力≥1500 U/mL）、胃蛋白酶（酶活力≥25000 U/mL）、胰蛋白酶（酶活力≥800 U/mL）、纖維素酶（酶活力≥1000 U/mL）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、水溶性維生素E （ Trolox）、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、氯化鎂、碳酸銨、氫氧化鈉 均為分析純，上海Aladdin 公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2’-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonate，ABTS）試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；無水乙醇、鹽酸均為分析純，中國上海Apel 公司。

JY-86-2-50 型-80 ℃冰箱 青島海爾電冰柜有限公司；FA1604 電子分析天平 美國奧豪斯貿(mào)易公司；EXL800 全波段酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；KL-UP-III-10 超純水制備機(jī) 臺(tái)灣艾柯（成都）實(shí)驗(yàn)專業(yè)純水設(shè)備廠；RE-3000A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海越眾儀器有限公公司；LGJ-12A 真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器有限公司；Agilent6540 超高解析度四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Q-TOF） 安捷倫科技（中國）有限公司；TDL-5-A 離心機(jī) 上海安亭科技儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 余甘子凍干粉的制備 挑選新鮮無損余干果，用超純水洗凈，去核，切成1 cm×1 cm×1 cm 的方塊；置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥。凍干后的樣品經(jīng)粉碎后過80 目篩3 次，得到余甘子果實(shí)凍干粉，凍干粉于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 余甘子醇提物的制備 參照本團(tuán)隊(duì)前期方法[24]優(yōu)化改良，按照料液比1:30（mg/mL）向上述得到的余甘子凍干粉中加入70%的乙醇，再使用超聲細(xì)胞破碎儀對(duì)其進(jìn)行超聲提取，其中超聲功率（200 W），超聲溫度（60 ℃），超聲時(shí)間（30 min）。超聲后離心（8000 r/min，10 min），棄殘?jiān)∩锨逡?，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇并濃縮，濃縮后的樣品置于真空冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，得到余甘子醇提物，醇提物于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 余甘子果實(shí)成分分析鑒定 參照Yang 等[25]的方法，稍作修改，使用HPLC-QTOF-MS/MS 對(duì)余甘子果實(shí)的基本成分進(jìn)行分析鑒定。修改的實(shí)驗(yàn)條件如下：

液相色譜條件：采用C18色譜柱（1.8 μm，3 mm×100 mm）。流動(dòng)相由純乙腈A，含0.1%甲酸的水溶液B 組成。凍干粉的洗脫梯度為：0～1 min，2% A；1～8 min，2%～4% A；8～15 min，4%～5% A；15～23 min，5%～15% A；23～28 min，15%～30% A；28～32 min，30%～35%A；32～37 min，35%～50% A；37～38 min，50%～2% A；38～39 min，2% A。醇提物的洗脫梯度為0～8 min，5% A；8～16 min，5%～15% A；16～18 min，15%～35% A；18～28 min，50%～100% A；28～35 min，100% A； 35～45 min， 100%～0% A； 45～54 min，0% A。后運(yùn)行1 min 以重新平衡色譜柱。進(jìn)樣量2 μL，流速為0.3 mL/min，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），負(fù)離子模式。數(shù)據(jù)獲取和分析軟件為Qualitative Analysis 10.0。

1.2.3 體外模擬消化液的制備 參考胡琪睿[26]的方法進(jìn)行體外消化，首先按表1 配制各階段工作液。模擬體外消化工作液均用蒸餾水定容至500 mL。配制1 mol/L 的氫氧化鈉溶液或6 mol/L 鹽酸溶液，將pH 分別調(diào)節(jié)至3 和7，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 模擬工作液的配制Table 1 Configuration of simulated working fluid

模擬口腔消化：1 g 余甘子原料凍干粉和等余甘子量（本實(shí)驗(yàn)的提取率為50%，即1 g 凍干粉可以提取出0.5 g 提取物，則稱0.5 g 提取物為等余甘子量）的提取物于10 mL 的離心管中，分別加入4 mL 80%乙醇復(fù)溶，搖勻，使其充分混合，得到余甘子凍干粉及醇提物溶液。隨后，向離心管中依次加入3.5 mL 的口腔模擬工作液、0.5 mL 的α-淀粉酶（1500 U/mL）和25 μL 氯化鈣溶液（0.3 mol/L），蒸餾水定容至10 mL，混勻后置于恒溫水浴搖床中，在31 ℃避光振蕩5 min；結(jié)束后取上清液S1 置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存，進(jìn)行相關(guān)測定，保留殘?jiān)M(jìn)行下一步。

模擬胃消化：上一消化階段結(jié)束后，向其消化殘?jiān)屑尤?.6 mL 胃蛋白酶（25000 U/mL）、7.5 mL的胃模擬工作液以及5 μL 氯化鈣溶液（0.3 mol/L）。調(diào)節(jié)pH 至3 后，蒸餾水定容至20 mL?；靹蚝笾糜诤銣厮u床內(nèi)，37 ℃避光振蕩2 h，取上清液S2進(jìn)行相關(guān)測定，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存，保留殘?jiān)M(jìn)行下一步。

模擬小腸消化：上一消化階段結(jié)束后，向胃消化殘?jiān)屑尤? mL 胰蛋白酶（800 U/mL）、11 mL 小腸消化工作液、40 μL 氯化鈣溶液（0.3 mol/L）和2.5 mL 豬膽鹽溶液（160 mmol/L），調(diào)整pH 至7.0后，蒸餾水定容至40 mL?；靹蚝?，置于恒溫水浴搖床，37 ℃避光振蕩2 h，取上清液S3 進(jìn)行相關(guān)測定，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存，保留殘?jiān)M(jìn)行下一步。

模擬大腸消化：上一消化階段結(jié)束后，向其消化殘?jiān)欣^續(xù)加入20 mL 蒸餾水，用HCl（6 mol/ L）調(diào)節(jié)pH 至4.0 后，加入80 μL 纖維素酶，置于恒溫水浴搖床，37 ℃避光振蕩 16 h（過夜）后，使用離心機(jī)離心（8000 r/min，10 min），取上清液S 進(jìn)行相關(guān)測定，置于4 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.4 總酚含量的測定 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：參考王若蘭等[27]的實(shí)驗(yàn)方法，使用福林酚法對(duì)樣品中的總酚含量進(jìn)行測定。通過測定不同濃度梯度下沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（0.001、0.003、0.0075、0.0125、0.0175 和0.02 mg/mL）的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=15.49x+0.0565，R2=0.9987。

提取液中總酚含量的測定：按照上述總酚的檢測方法，檢測待測樣品中的總酚含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中總多酚的沒食子酸當(dāng)量，總酚含量用mg GAE（沒食子酸當(dāng)量）/g 表示，計(jì)算公式如下：

式中：A 為沒食子酸濃度（mg/mL）；V 為測定后體積（mL）；m 為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.5 總黃酮含量的測定 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：采用氯化鋁-亞硝酸鈉比色法測定。向300 μL 不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.005、0.01、0.02、0.04和0.06 mg/mL）中加入40 μL 的 25% NaNO2，反應(yīng)6 min 后加入40 μL 10%的AlCl3·6H2O，反應(yīng)6 min后加入500 μL（1 mol/L） NaOH 和1.12 mL 的80%乙醇，于波長510 nm 處測定吸光值。根據(jù)不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.1265x+0.0555，R2=0.9958。

提取液中總黃酮含量的測定：按上述總黃酮的檢測方法，測定待測樣品中總黃酮的含量?？傸S酮量以蘆丁當(dāng)量計(jì)算，單位為mg RT/g。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力測定 參考李文婷等[28]的實(shí)驗(yàn)方法，稍作修改。配制不同濃度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液（10、50、100、200、300、400 和500 μmol /L），向96 孔板中加入100 μL 的DPPH 乙醇溶液（0.065 mmol/L）與20 μL 的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，室溫避光反應(yīng)30 min 后，使用全波段酶標(biāo)儀于517 nm測定其吸光度。以Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度及對(duì)應(yīng)的DPPH 自由基清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=213.8x-0.1029，R2=0.9932。

按照上述方法檢測待測樣品的DPPH 自由基清除率，以Trolox 為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol 維生素E 當(dāng)量（TE）/g。清除DPPH 自由基能力用以下公式計(jì)算：

式中：Ai為樣品溶液加DPPH 試劑混合液的吸光度，Aj為樣品溶液加乙醇的光度，A0為DPPH 溶液加樣品溶劑的吸光度。

1.2.7 ABTS＋自由基清除能力測定 參考李文婷等[28]的實(shí)驗(yàn)方法。以不同濃度Trolox 溶液（25、50、100、200、300、400 和500 μmol /L）及其相應(yīng)的清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=144.89x+0.0207，R2=0.9993。樣品溶液的ABTS＋自由基清除能力以維生素E 為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol TE/g。ABTS＋自由基清除率計(jì)算用以下公式計(jì)算：

式中：An為樣品溶液加ABTS 溶液的吸光度；Am為樣品溶液加80%乙醇的吸光度；Al為ABTS溶液加樣品溶劑的吸光度。

1.2.8 鐵離子還原能力測定 參考李文婷等[28]的實(shí)驗(yàn)方法，稍作修改。向1.6 mL 冰乙酸中加入0.31 g醋酸鈉，加入少量超純水定容至100 mL，配制成試劑A；向0.0312 g 的TPTZ 中加入400 mmol/L 的鹽酸定容至10 mL，配制成試劑B；向0.0541 g 六水合氯化鐵中加入超純水定容至10 mL，得到試劑C；按照A:B:C=10:1:1 的比例配制工作液。取1.8 mL上述工作液置于2 mL 的EP 管中，加入不同體積的樣品（見表2）使工作液變色，再加入少量超純水定容至2 mL，暗反應(yīng)30 min 于波長593 nm 測定吸光度。根據(jù)不同濃度的Trolox 標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=85.547x+0.2094，R2=0.9921。樣品溶液的鐵離子還原能力以維生素E 為參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果表示為μmol TE/g。

表2 FRAP 模型中加入樣品的體積Table 2 Sample volume added on the FRAP model

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)采用6 組平行，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以±s 表示。通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 為差異顯著，并使用Pearson 法對(duì)多酚和黃酮含量與抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。使用GraphPad Prism 8 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子果實(shí)成分分析

使用HPLC-QTOF-MS/MS 對(duì)余甘子凍干粉和醇提物樣品的成分進(jìn)行分析鑒定。得到的負(fù)離子模式下的一級(jí)總離子流圖譜分別為圖1 和圖2。通過將母離子質(zhì)荷比和特征碎片的離子信息與文獻(xiàn)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果見表3 和表4。余甘子凍干粉共鑒定出40 種成分，醇提物共鑒定出29 種成分，由鑒定出的結(jié)果可知，余甘子富含鞣質(zhì)、酚酸類、黃酮類及黃烷醇類等多酚和黃酮類物質(zhì)。

圖1 負(fù)離子模式下余甘子凍干粉樣品的總離子流圖Fig.1 Primary total ion current spectrum of PE lyophilized powder sample in negative ion mode

圖2 負(fù)離子模式下余甘子醇提物樣品的總離子流圖Fig.2 Primary total ion current spectrum of PE ethanol extracts sample in negative ion mode

表4 HPLC-QTOF-MS/MS 鑒定出的余甘子醇提物樣品中的化學(xué)成分Table 4 Compounds determined by HPLC-QTOF-MS/MS of PE ethanol extracts sample.

由圖1 和表3 可知，余甘子凍干粉中既包括游離態(tài)的多酚，如沒食子酸（峰10）、山奈酚（峰18）、鞣花酸（峰31）等；也包括結(jié)合態(tài)多酚，如粘酸衍生物（峰3、5、8）、槲皮素衍生物（峰37）等。根據(jù)相應(yīng)的峰面積可知，凍干粉中的結(jié)合型酚酸的含量略高于游離型。由圖2 和表4 可以看出，余甘子醇提物中的多酚主要為游離態(tài)多酚（峰3、6、22、26），結(jié)合型多酚較少，可能是由于結(jié)合型多酚很難被溶劑提取出來。總之，余甘子凍干粉中的結(jié)合型多酚要高于醇提物。

研究表明，結(jié)合態(tài)多酚可以被體內(nèi)的消化酶和腸道微生物進(jìn)一步分解利用，將其釋放出來，從而提高健康效益[29]，但是目前關(guān)于余甘子多酚的研究多停留在提取物的游離多酚的相關(guān)研究上，余甘子全水果的多酚含量和抗氧化能力或許被低估。因此，對(duì)比余甘子凍干粉和醇提物及兩者消化前后的總酚總黃酮含量及其抗氧化能力的變化對(duì)更充分地利用余甘子的健康效益具有重要意義。

2.2 總酚和總黃酮含量

余甘子凍干粉和醇提物在體外模擬胃腸消化過程中的多酚和黃酮含量變化如表5 所示。由表5 中可知，消化前樣品中的多酚含量最高，且凍干粉顯著高于醇提物（P＜0.05），這可能是由于醇提物僅提取出了游離型多酚，在提取過程中損失了結(jié)合型多酚。體外模擬消化過程中，兩者的總酚含量均在口腔最高，大腸最低，這和王貴一等[30]的研究結(jié)論是一致的?？谇幌螅喾雍匡@著降低，可能是因?yàn)榉宇惢衔镏苯雍挺?淀粉酶結(jié)合產(chǎn)生大分子聚合物，從而降低酚類化合物的含量[31]。但是在胃和小腸中，凍干粉胃的多酚含量要高于小腸，這可能是因?yàn)槿苡谌軇┑亩喾佣酁橛坞x酚，胃消化液的強(qiáng)酸環(huán)境和胃蛋白酶的存在可使殘?jiān)械牟糠纸Y(jié)合酚釋放，但是腸液的堿性環(huán)境可能導(dǎo)致胃部釋放的結(jié)合酚向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)變，從而使小腸消化后的總酚含量低于胃消化液中的含量[17]。而醇提物小腸的多酚含量高于胃，這可能是由于和凍干粉醇溶液相比，醇提物的殘?jiān)谔崛∵^程中被舍棄，缺少結(jié)合酚的釋放，而小腸內(nèi)的膽汁和胰酶可以增加多酚的釋放[32]，故胃消化液中的總酚含量低于小腸消化液中的含量。雖然在體外模擬消化過程中，余甘子凍干粉和醇提物多酚含量的變化趨勢(shì)不一致，但在同一消化階段，兩者之間多酚的含量并無顯著性差異。

表5 余甘子各樣品中總酚和總黃酮含量Table 5 Total phenols and total flavonoids in each sample of PE.

對(duì)于消化前的樣品來說，凍干粉中的黃酮含量要顯著低于醇提物的含量（P＜0.05），可能是醇提物采用的是超聲輔助提取，提取時(shí)間較長，溫度較高[33]，且黃酮多為非極性類物質(zhì)，經(jīng)過超聲空化效應(yīng)可以促進(jìn)總黃酮類物質(zhì)的釋放[34]。在整個(gè)體外模擬消化過程中，凍干粉的黃酮含量變化趨勢(shì)為口腔＞小腸＞胃＞大腸，醇提物的黃酮含量變化趨勢(shì)為口腔＞胃＞小腸＞大腸，這和兩個(gè)樣品消化過程中多酚含量的變化趨勢(shì)不一致。胃消化液中，凍干粉中的黃酮含量要高于醇提物中的含量，可能是由于凍干粉的殘?jiān)械慕Y(jié)合型黃酮在胃酸和胃蛋白酶的作用下被分解釋放[35]。而小腸中的膽汁和胰酶進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)合型黃酮的釋放，因此，凍干粉小腸中的黃酮含量要高于胃中的含量[36]。但是對(duì)于醇提物而言，其結(jié)合型黃酮較少，而黃酮類物質(zhì)在弱堿性環(huán)境下不穩(wěn)定，容易被降解，故其在小腸消化液中的黃酮含量要低于胃，這和Chen 等[37]的研究結(jié)果是一致的。

總之，由于余甘子凍干粉和醇提物中結(jié)合型、游離型多酚和黃酮含量的差異，以及體外模擬消化環(huán)境中的pH 和酶的種類的不同，導(dǎo)致兩者在消化各階段酚類物質(zhì)的結(jié)合、釋放、降解也有所不同，即兩者在消化各階段的總酚含量和總黃酮含量存在差異。因此，研究繼續(xù)探索余甘子凍干粉和醇提物在消化前后抗氧化能力的變化是有必要的。

2.3 模擬體外消化過程中抗氧化能力分析

2.3.1 DPPH 自由基清除能力 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的不同樣品的DPPH 自由基清除率如圖3 所示。由圖3 可以看出，消化前，余甘子凍干粉的DPPH自由基清除能力顯著高于醇提物（P＜0.05），可能是由于凍干粉的多酚含量更高。但體外模擬消化后，余甘子醇提物的DPPH 自由基清除能力更強(qiáng)，可能是由于在酚酸類物質(zhì)中，含有三個(gè)鄰位酚羥基的化合物DPPH 自由基清除能力明顯強(qiáng)于其他化合物[38]，本實(shí)驗(yàn)中醇提物的成分主要為游離型多酚如沒食子酸（3,4,5-三羥基苯甲酸），其抗氧化能力遠(yuǎn)強(qiáng)于結(jié)合酚。在整個(gè)體外消化過程中，兩者的DPPH 自由基清除能力的變化趨勢(shì)是一致的，均為消化前＞小腸＞胃＞口腔＞大腸。但是兩者的DPPH 自由基清除能力與總酚含量的變化趨勢(shì)存在差異，尤其是在口腔和胃。胃的總酚含量高，但DPPH 自由基清除能力不一定強(qiáng)，這可能是因?yàn)閺?qiáng)酸對(duì)該分析體系影響較大，可降低多酚對(duì)DPPH 自由基的清除能力[39]。

圖3 DPPH 法測定體外消化過程中余甘子的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant activity determined by DPPH assays of PE in vitro digestion

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的不同樣品的ABTS＋自由基清除率如圖4 所示。從圖4 可以看出，消化前，余甘子凍干粉的ABTS＋自由基清除能力顯著高于醇提物（P＜0.05）。消化后，兩者的ABTS+自由基清除能力均顯著降低（P＜0.05），但其變化趨勢(shì)存在差異，除了口腔，其余消化階段的ABTS+自由基清除能力和總酚含量的變化趨勢(shì)基本一致。其中，凍干粉在胃和小腸的ABTS+自由基清除能力較高，可能由于酸解和堿解均可顯著提高結(jié)合酚的ABTS+自由基清除能力，且堿解（小腸）＞酸解（胃）[28]。醇提物的ABTS+自由基清除能力在不同消化階段沒有顯著性差異，但其變化趨勢(shì)和總酚含量基本一致。消化后，凍干粉各階段的ABTS＋自由基清除能力均低于醇提物，可能是由于凍干粉各階段的總酚含量均低于醇提物。

圖4 ABTS 法測定余甘子體外消化過程中的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant activity determined by ABTS assays of PE in vitro digestion

2.3.3 Fe3+還原能力 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出的不同樣品的Fe3+還原能力如圖5 所示。從圖5 中可以看出，不管是消化前還是消化后，凍干粉的Fe3+的還原能力基本顯著高于醇提物（P＜0.05）。和消化前相比，經(jīng)體外消化后，兩者的Fe3+的還原能力均顯著降低（P＜0.05），且除了凍干粉的口腔消化液，其余的Fe3+的還原能力均與總酚含量的變化趨勢(shì)基本一致。即總酚含量越高，F(xiàn)e3+的還原能力越強(qiáng)。

圖5 FRAP 法測定體外消化過程中余甘子的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant activity determined by FRAP assays of PE in vitro digestion

在以上三個(gè)抗氧化體系中，和消化前相比，消化后的抗氧化能力均顯著降低。但消化后，在DPPH和ABTS 體系中，余甘子醇提物的抗氧化能力要高于凍干粉，但在FRAP 體系中，凍干粉的抗氧化能力較高，這可能是不同的抗氧化體系的原理不同導(dǎo)致的[31]?？傮w上，抗氧化能力和總酚含量的變化趨勢(shì)基本一致，但在凍干粉的口腔消化液中，雖有較高的多酚含量，其在三個(gè)體系的抗氧化能力均較低，這和李濱旭[40]的研究結(jié)果相似，可能是因?yàn)閮龈煞鄣慕Y(jié)合型多酚未經(jīng)提取，口腔消化后，細(xì)胞壁尚未被破壞，導(dǎo)致多酚和黃酮難以被釋放出來，因此，抗氧化能力較弱。

2.4 總酚總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性

相關(guān)性分析是指對(duì)兩個(gè)或多個(gè)具備相關(guān)性的變量元素進(jìn)行分析，從而衡量兩個(gè)變量因素的相關(guān)密切程度，相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值越大，表明因子之間的相關(guān)性越大。圖6 為余甘子凍干粉和醇提物樣品總酚總黃酮的含量與抗氧化能力之間的關(guān)系，顏色越深，表明相關(guān)系數(shù)越大。從圖6 中可以看出，總酚含量和DPPH 自由基清除能力、ABTS＋自由基清除能力以及Fe3+還原能力之間均呈現(xiàn)正相關(guān)，且相關(guān)性極顯著（P＜0.01），這和張燦等[41]的研究結(jié)果是一致的?？傸S酮含量與抗氧化能力之間為負(fù)相關(guān)，但在α=0.05水平上相關(guān)性不顯著?？赡苁且?yàn)辄S酮類化合物是多酚的一種，消化過程中，黃酮含量在某些消化階段增加，但相應(yīng)階段的多酚含量減少，抗氧化能力變?nèi)?，因此呈現(xiàn)出黃酮含量與抗氧化能力之間的負(fù)相關(guān)。

圖6 總酚和總黃酮的含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of the content of total phenols and total flavonoids with antioxidant capacity

總之，經(jīng)過相關(guān)性分析可知，余甘子果實(shí)的抗氧化能力與其多酚類物質(zhì)的含量呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)。結(jié)合上述體外消化模型，模擬余甘子功能性成分和抗氧化能力在消化過程中的變化過程，可發(fā)現(xiàn)，通過適當(dāng)?shù)奶崛〖庸つ軌蛱岣哂喔首赢a(chǎn)品中游離型多酚的含量，有助于提升其抗氧化健康效益，從而為余甘子產(chǎn)品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，更好地發(fā)揮余甘子相關(guān)產(chǎn)品的健康價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究通過體外模擬消化法對(duì)余甘子凍干粉和醇提物的活性成分及抗氧化能力進(jìn)行了探究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，余甘子果實(shí)富含多酚和黃酮類物質(zhì)，其中，凍干粉不僅富含游離型多酚，還富含結(jié)合型多酚，而醇提物的成分主要為游離型多酚。體外模擬消化前，凍干粉和醇提物的總酚含量分別為5.40±0.07 mg GAE/mL和3.65±0.05 mg GAE/mL。總黃酮含量分別為1.48±0.15 mg RT/mL 和14.80±0.74 mg RT/mL。和消化前相比，在消化過程中，兩者的總酚含量均顯著降低（P＜0.05），但兩者總黃酮的含量在口腔消化液中最高。消化酶和pH 可能是消化過程中影響總酚總黃酮含量的主要因素，強(qiáng)酸和消化酶可以促進(jìn)結(jié)合型多酚的分解釋放，而堿性環(huán)境又會(huì)導(dǎo)致結(jié)合酚向其他物質(zhì)轉(zhuǎn)變。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，消化前，余甘子醇提物對(duì)ABTS＋、DPPH 自由基的清除能力和Fe3＋還原能力都顯著低于凍干粉（P＜0.05），但消化后余甘子醇提物的抗氧化能力強(qiáng)于凍干粉?？赡苁怯捎诖继嵛镏杏坞x型多酚的抗氧化能力更強(qiáng)。最后，研究對(duì)總酚總黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性分析表明，總酚含量與抗氧化能力之間存在顯著的正相關(guān)性。綜上，消化后，和余甘子凍干粉相比，醇提物的抗氧化能力更強(qiáng)。作為“食藥同源”的食品的開發(fā)應(yīng)用，經(jīng)過適當(dāng)?shù)奶崛〖庸た墒沟糜喔首赢a(chǎn)品可能會(huì)有更高的健康效益。

本研究基于體外消化模型，創(chuàng)新性地比較余甘子凍干粉與提物經(jīng)體外口腔-胃腸道消化后的差異，旨在探究余甘子在此過程中活性成分和抗氧化能力的變化規(guī)律。本項(xiàng)目可將研究成果更好地應(yīng)用于功能性食品開發(fā)；滿足健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展需求，為余甘子食品產(chǎn)品的設(shè)計(jì)提供新思路和新方法，為切實(shí)推動(dòng)我國食品營養(yǎng)健康發(fā)展、落實(shí)《“健康中國2030”規(guī)劃綱要》、促進(jìn)國民營養(yǎng)健康需求提供科學(xué)依據(jù)。