基于HS-SPME-GC-MS 分析不同鹵制條件下鹵制液香氣差異

吳梓仟，周勁松，劉特元，蔣立文，劉 洋,*，尹世鮮，榮智興，陳 歡

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；3.勁仔食品集團(tuán)股份有限公司，湖南岳陽 414000；4.湖南省健康休閑食品工程技術(shù)研究中心，湖南岳陽 414000）

香辛料是指一類具有典型氣味和滋味的調(diào)味品，使用后不僅可賦予食材特殊色、香、味，還能矯正食材中的不良?xì)馕禰1]，如水產(chǎn)制品中的魚腥味和肉制品的血腥味[2]。因此，香辛料普遍用于食材加工。鹵制液多使用鹵料包（復(fù)合香辛料）熬煮而成，其香氣主要來自于香辛料中有效成分的釋放與轉(zhuǎn)移，可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)與食材間的香氣轉(zhuǎn)換[3]。食材經(jīng)鹵制液鹵制后風(fēng)味濃郁且食用方便，深受消費(fèi)者喜愛[4]。然而目前大多數(shù)企業(yè)在醬鹵生產(chǎn)工藝中仍使用傳統(tǒng)的老鹵汁鹵制方式。一定程度上，老鹵湯香氣更加濃郁，但鹵湯的反復(fù)利用可導(dǎo)致大量有害物質(zhì)析出，并富集于鹵制食材之上，如雜環(huán)胺，脂肪氧化物等，存在安全隱患。此外，老鹵湯原輔料利用率低且不同生產(chǎn)批次產(chǎn)品香氣差異明顯，較難實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的工業(yè)化。因此，需對鹵制液制備進(jìn)行調(diào)整。

研究表明，鹵制液的香氣因制備條件的改變而改變，如煮制時(shí)間、次數(shù)、溫度及壓力等。秦艷秀等[5]探究香葉循環(huán)煮制對肉湯揮發(fā)性風(fēng)味的影響，發(fā)現(xiàn)隨煮制次數(shù)的增加，肉湯中揮發(fā)性化合物的種類和含量總體呈下降趨勢。劉悅[6]對不同鹵制時(shí)長的鹵烤兔進(jìn)行感官評價(jià)，結(jié)果顯示過長的鹵煮時(shí)間會(huì)導(dǎo)致香辛料中的苦味物質(zhì)析出，最終聚集于產(chǎn)品間，造成綜合感官評分下降。而在香辛料熬煮過程中施加壓力，可以加快揮發(fā)性香氣物質(zhì)釋放速度，縮短鹵制時(shí)間，有效減少因長時(shí)間鹵制而帶來的異味[7]?；诖?，分析不同鹵制條件下鹵制液香氣差異對鹵制液制備的調(diào)整是很有必要的。

頂空固相微萃取（headspace-solid-phase microextraction，HS-SPME）常與氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用，廣泛應(yīng)用于食品揮發(fā)性成分分析[8]，但現(xiàn)階段該技術(shù)多應(yīng)用于對單一香辛料水煮液的揮發(fā)性成分分析，對復(fù)合香辛料水煮液的揮發(fā)性成分以及關(guān)鍵香氣成分分析較少。綜上所述，為了改進(jìn)傳統(tǒng)鹵制工藝的缺點(diǎn)，現(xiàn)對鹵制液的加工條件進(jìn)行優(yōu)化，采用HS-SPMEGC-MS 分析不同鹵制方式下鹵制液中揮發(fā)性組成成分差異，結(jié)合氣味活度值（odour active value，OAV）及主成分分析法（principal component analysis，PCA）更加完整的比較不同加工方式對鹵料液香氣的影響，進(jìn)一步明確鹵制液鹵制條件，對提高鹵料包的利用率及實(shí)現(xiàn)復(fù)鹵產(chǎn)品風(fēng)味的工業(yè)化統(tǒng)一均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹵制液樣品 由八角、桂皮、小茴香、丁香、肉豆蔻、草果、高良姜、山奈、蓽撥、豆蔻、白芷、花椒、砂仁、陳皮、甘草組成的鹵料包經(jīng)不同條件鹵制而成 湖南勁仔食品集團(tuán)股份有限公司提供；2-甲基-3-庚酮 分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

7890B5977 型Agilent 氣質(zhì)聯(lián)用儀 美國Agilent公司；57330-U 型手動(dòng)SPME 進(jìn)樣器、57310-U 型聚二甲基硅氧烷萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDM）美國SUPELCO 公司；BSa224S 分析天平 Sartorius 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不同鹵制條件鹵汁的制作 第一鍋鹵制液（0525-1）：3 包新鹵料包熬煮；第二鍋鹵制液：第一鍋鹵制液時(shí)用的3 包鹵料包基礎(chǔ)上加1 包新鹵料包熬煮；第三鍋鹵制液：第二鍋鹵制液時(shí)用的4 包鹵包基礎(chǔ)上加1 包新鹵料包，以此類推第五鍋鹵制液（0525-4）為第四鍋鹵制液時(shí)用的6 包鹵包鹵制基礎(chǔ)上再加1 包新鹵料包。

微壓鹵制液（0525-H）根據(jù)現(xiàn)有工藝設(shè)備制作。在第一鍋中加入3 個(gè)鹵包，熬制完成后將第一鍋鹵制液全部抽出；無需加新鹵包，繼續(xù)在鍋內(nèi)加入一鍋量的水進(jìn)行熬煮，熬煮后，將第二鍋鹵制液全部抽出與第一鍋抽出的鹵制液混合；然后在鍋內(nèi)再加入一鍋量的水進(jìn)行熬煮，熬煮完成后，將第三鍋鹵制液抽出與第一鍋、第二鍋抽出的鹵制液混合。所有熬煮操作均在微壓條件下進(jìn)行，即3 個(gè)鹵包進(jìn)行了3 次微壓熬煮，將3 次熬制后的鹵制液混合后使用。

鹵制液鹵制條件及樣品編號見表1。取樣后于4 ℃冰箱中冷藏密封保存。

表1 鹵制液鹵制條件Table 1 Halogenation conditions for brine solution

1.2.2 SPME-GC-MS 分析條件 參考周曉等[4]的方法并稍作修改，采用頂空固相微萃?。℉S-SPME）對鹵制液香氣進(jìn)行提?。簩? mL 樣品置于20 mL 氣相小瓶中，加入2.5 g NaCl 和40 μL 內(nèi)標(biāo)（2-甲基-3-庚酮 1.7 μg/mL），置于恒溫磁力攪拌機(jī)下（轉(zhuǎn)速為30 r/min），在50 ℃下預(yù)熱5 min。隨后將萃取頭從墊片穿過并推出纖維頭，吸附40 min。

揮發(fā)性化合物在HP-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）上分離。升溫程序如下進(jìn)行：初溫40 ℃，保持3 min 后，以4 ℃/min 的速度升溫至150 ℃ 保持0 min，再以10 ℃/min 的速度升溫至250 ℃ 保持5 min。載氣為氦氣（1 mL/min），離子源溫度為250 ℃，電離能為70 eV，質(zhì)量范圍為45～500 m/z。

將GC-MS 檢測到的揮發(fā)性化合物與NIST20庫數(shù)據(jù)庫進(jìn)行質(zhì)譜比較。選擇匹配度高于85%的物質(zhì)作為定性結(jié)果，使用內(nèi)標(biāo)法計(jì)算揮發(fā)性化合物的含量作為定量結(jié)果，計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[9]：

其中，S1是內(nèi)標(biāo)的峰面積；S2是揮發(fā)性化合物的峰面積；C 是內(nèi)標(biāo)的初始濃度；M 是樣品的體積。

1.2.3 氣味活度值計(jì)算公式 氣味活度值（OAV）是揮發(fā)性化合物的含量（C）與其閾值（T）之比，計(jì)算公式參考文獻(xiàn)[10]：

1.2.4 排序檢驗(yàn)法 參照《GB/T 12315-2008 感官分析 方法學(xué) 排序法》，對鹵制液香氣濃郁程度進(jìn)行排序。10 名品評成員（4 男6 女，年齡在28～37 歲之間）來自勁仔食品集團(tuán)股份有限公司，感官實(shí)驗(yàn)在專業(yè)品評室進(jìn)行，要求品評員對鹵制液樣中散發(fā)的出鹵香氣味濃郁程度進(jìn)行排序。實(shí)驗(yàn)完成后，計(jì)算同一樣品同一特征的秩次總和（秩和）。

其中，j 是品評員的數(shù)量；P 是樣品的數(shù)量；R 是樣品的秩和。排序檢驗(yàn)分析通過Friedman 檢驗(yàn)法計(jì)算樣品間是否存在顯著性差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹵制方式鹵制液揮發(fā)性化合物分析

3 種不同鹵制方式的鹵制液通過GC-MS 分析，結(jié)果如表2 所示，共鑒定出8 類化合物（43 種物質(zhì)），分別為醇類（7 種）、酚類（7 種）、酮類（5 種）、烯類（5 種）、酯類（5 種）、醚類（4 種）、酸類（2 種）、其他化合物（7 種）。由圖1 可知，不同樣品檢出的風(fēng)味物質(zhì)組成差異明顯，總含量由高至低分別為0525-H（107.90 μg/mL）、0525-1（37.83 μg/mL）、0525-4（24.16 μg/mL），其中酚類、醚類為0525-1 與0525-H 的主要化合物，而0525-4 中以酚類、烯類為主要化合物。

圖1 不同鹵制方式鹵制液中各揮發(fā)性化合物含量圖Fig.1 Volatile compounds diagram in marinade with different brine conditions

表2 不同鹵制條件鹵制液中揮發(fā)性成分的組成及含量Table 2 Composition and content of volatile components in marinade with different brine conditions

3 種樣品（0525-1、0525-4、0525-H）中分別檢測出33、28 和22 種揮發(fā)性化合物，僅有14 種共有化合物（圖2），包括芳樟醇、丁香酚、甲氧基肉桂酸乙酯、肉豆蔻醚、欖香素、茴香甙等，而3 種樣品的特有成分分別有8 種、6 種、3 種。表明鹵制條件的更改能夠進(jìn)一步影響鹵制液中揮發(fā)性化合物的形成，進(jìn)一步影響鹵制液的香氣。

圖2 不同鹵制方式鹵制液中揮發(fā)性化合物數(shù)量分析圖Fig.2 Number of volatile compound diagram in marinade with different brine conditions

整體而言，鹵料包經(jīng)過反復(fù)熬煮之后，僅烯烴類及酚類物質(zhì)含量呈現(xiàn)上升狀態(tài)，其余皆呈現(xiàn)不同程度降低，推測原因?yàn)楦邷亻L時(shí)間蒸煮導(dǎo)致部分揮發(fā)性成分受熱分解或者揮發(fā)損失，這與劉洋等[11]對火鍋底料氣質(zhì)分析相吻合；在微壓條件下，只有烯烴類及酸類化合物有不同程度的降低，其余均呈上升狀態(tài)，可知微壓有助于促進(jìn)揮發(fā)性化合物的釋放[12]。

酚類化合物大多數(shù)可表現(xiàn)為花果香[13]。0525-H中酚類化合物含量最高（39.45 μg/mL），而0525-1與0525-H 均為12.21 μg/mL，微壓條件對鹵制液中酚類揮發(fā)物質(zhì)影響明顯[14]，在壓力的作用下，酚類化合物更易釋放出來。丁香酚、甲基丁香酚、（E）-2-甲氧基-4-（1-丙烯基苯酚）、反式甲基異丁香酚在三個(gè)樣品中均被檢出。除丁香酚外，其余化合物在三種樣品中含量較低。0525-H 中丁香酚的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0525-1 與0525-4，說明丁香酚在壓力作用下更容易被浸出，此結(jié)論與FROHLICH 等[15]一致。丁香酚一般呈現(xiàn)丁香味及煙熏味，源自桂皮，除呈香功能外，還具有良好的抑菌防腐及保鮮作用[16]。

酯類化合物與羧酸和醇的酯化作用相關(guān)，多散發(fā)香甜氣息[17]。0525-1、0525-4、0525-H 樣品中酯類化合物含量分別為3.58、0.76 和16.54 μg/mL，據(jù)報(bào)道，熱處理會(huì)加速酯類化合物的降解而損失[18]。甲氧基肉桂酸乙酯，其來源于山奈并具有較強(qiáng)的廣譜抑菌性能[19]，是三個(gè)樣品共有的化合物，大量存在于0525-H 樣品中。肉桂酸乙酯源自桂皮[20]。乙酸丁香酚酯為丁香酚的衍生物[21]，只在0525-H 中被檢出。由上知，鹵制液制備過程中施加壓力有助于酯類物質(zhì)的析出。

醚類化合物主要來源于香辛料中的呈味物質(zhì)，其閾值與碳鏈的組成相關(guān)，多呈辛香味[22]。醚類化合物在0525-H 中含量最高，0525-1 其次，0525-4 最低，循環(huán)煮制不利于醚類化合物的累積。三個(gè)樣品中均檢測出肉豆蔻醚和對烯丙基苯甲醚。肉豆蔻醚來源自肉豆蔻，除能提供香味外，還可有效治療心臟疾病[23]。肉豆蔻醚在常壓下煮制變化并不明顯，而微壓條件下含量卻明顯上升，原因可能系壓力條件下，肉豆蔻的揮發(fā)性化合物更易被提出[24]。茴香腦來自于八角茴香、小茴香、大茴香等物，其含量在醚類中占比最大，具有濃烈的茴香味[25]，但經(jīng)過循環(huán)煮制后，茴香腦的含量低于檢測線。據(jù)邰佳等[26]報(bào)道，茴香腦熱穩(wěn)定性較差，反復(fù)多次熱處理對茴香腦的損失較大。

大部分醇類化合物具有令人愉快的香氣，通常不飽和醇類的閾值較低，對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，一般擁有植物清香[27]，反之飽和醇閾值較高，但獨(dú)立存在時(shí)，碳鏈較長的飽和醇可表現(xiàn)為植物香或花脂香特征[28]。醇類化合物總含量由高至低為0525-H、0525-1、0525-4，循環(huán)煮制致使醇類化合物含量下降。二甲基-硅烷二醇、桉葉油醇、芳樟醇和α-松油醇為共有化合物，但在樣品中差異明顯。桉葉油醇主要來源于肉桂、陳皮、豆蔻和八角茴香等香辛料，呈現(xiàn)樟腦氣息和草藥味[29]。由于熬煮總時(shí)長過高會(huì)導(dǎo)致桉葉油醇損失較大[30]，因此其在0525-H 中含量較高為0.61 μg/mL，0525-1（0.4 μg/mL）次之，0525-4 最低，僅有0.06 μg/mL。芳樟醇具有玲蘭香氣和香檸檬香味，通常由八角、花椒等香辛料析出[31]，經(jīng)循環(huán)煮制后，其含量出現(xiàn)明顯下降，但在微壓條件下含量上升，與趙旭飛等[32]研究結(jié)果相吻合。肉桂醇具有風(fēng)信子的香氣，但未在0525-4 中檢測到，推測是煮制次數(shù)過多其暴露在空氣中迅速氧化形成其他物質(zhì)所致[33]。

酮類化合物主要呈現(xiàn)奶油香或清香，通常由美拉德反應(yīng)/脂質(zhì)的降解與氧化等反應(yīng)產(chǎn)生[34]。其在0525-H 中含量最高（3.27 μg/mL），0525-1 次之（2.26 μg/mL），0525-4 最少（0.73 μg/mL），在壓力的作用下，酮類物質(zhì)化合物得到提升，與張棟昊等[35]探究不同加工方式對米飯風(fēng)味影響的結(jié)論一致。酸類存在于0525-1 與0525-4 兩個(gè)樣品中，其香味閾值較高，對鹵汁風(fēng)味貢獻(xiàn)不大[36]。烯烴多具有辛香/木香/果香等香氣[37]，未在0525-H 中檢測出，這可能是在微壓作用下，長鏈烷/烯烴會(huì)發(fā)生裂化作用，劉振宇等[18]研究不同壓力下綠豆粉的香氣成分變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過壓力處理后烷烴種類數(shù)和含量顯著減小，二十碳以上的烷烴消失，與本結(jié)果相符。具有茴香氣息的茴香烯源自茴香、桂皮[38]。醛類物質(zhì)閾值較低，香氣較為濃烈，可以賦予香辛料水煮液獨(dú)特風(fēng)味[39]。桂皮醛于0525-1 和0525-H 樣品中檢測出，是一種很好的植物抗菌劑，通常來源自肉桂等植物體內(nèi)，有特殊的肉桂芳香氣味[40]。呋喃等雜環(huán)類化合物可能源于美拉德/焦糖化反應(yīng)[41]。欖香素、茴香甙為三者共有的化合物，但差異不大。欖香素主要來源于鹵制液中肉豆蔻或花椒等香辛料，具有令人愉悅的花香氣息。茴香甙不但能為鹵制液提供辛香味，還可提供良好的防腐保鮮效果[42]。綜合來看，控制鹵制液的熬煮次數(shù)/壓力能夠明顯影響揮發(fā)性化合物質(zhì)的釋放，特別是微壓條件促使各類揮發(fā)性化合物（酚類、酯類、醚類、醇類及其他類）上升尤為明顯。

2.2 不同鹵制方式鹵制液關(guān)鍵香氣成分

僅以揮發(fā)性化合物的含量判斷鹵料液的香氣具有局限性，因此需結(jié)合氣味活度值（OAV）才能更完整的評判鹵料液的整體香氣。通常OAV≥1 的化合物為關(guān)鍵香氣化合物，并且值越大越說明該化合物對整體香氣影響越大；當(dāng)0.1＜OAV＜1 時(shí)，盡管并非關(guān)鍵香氣，但同樣對整體的氣味起一定修飾作用[45]。通過查閱相關(guān)書籍[46]找到以下22 種揮發(fā)性物質(zhì)的氣味閾值，并通過公式（2）求出各揮發(fā)性氣味物質(zhì)的OAV 值，結(jié)果如圖3 所示。三個(gè)樣品中有15 個(gè)揮發(fā)性化合物OAV＞1，這些揮發(fā)性物質(zhì)的香氣對鹵制液的整體香氣起重要作用。其中丁香酚（丁香味、煙熏味）、桉葉油醇（草藥味）、芳樟醇（鈴蘭香味）、肉豆蔻醚（香膏味）、對烯丙基苯甲醚（甘草味）為共有的關(guān)鍵揮發(fā)性化合物，說明三種樣品的基本香氣特征為花香味、煙熏味、草木香以及香膏味。盡管這五種化合物在三個(gè)樣品中均被檢出，但OAV 值大小差異明顯，無論是單一物質(zhì)還是總物質(zhì)，0525-H 的OAV 值均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他兩個(gè)樣品，可以得知在香氣特征相同的條件下，0525-H 香氣會(huì)更加濃郁。聚類分析將三個(gè)樣品分為常壓類與微壓類，常壓條件的兩個(gè)樣品香氣組成更接近。

圖3 不同鹵制方式鹵制液樣品氣味活度值熱圖Fig.3 Heat map of OAV value in marinade with different brine conditions

三個(gè)樣品中（0525-1、0525-4 與0525-H）OAV≥1 的化合物分別為11 個(gè)、9 個(gè)和8 個(gè)。在共有的香氣特征基礎(chǔ)上，0525-1 中含有獨(dú)特的干香草味（香豆素）、淡丁香味（1-石竹烯）、香脂味（苯乙烯），而煙熏味（4-羥基苯乙烯）及茴香味（茴香烯）為0525-4 的側(cè)重香氣。0525-H 擁有更明顯的丁香味、煙熏味（異丁香酚）。散發(fā)著果香的4-辛酮僅存在于常壓組中，推測為壓力條件下4-辛酮穩(wěn)定性被破壞[32]。肉桂酸乙酯與肉桂醇的香氣特征分別為甜橙香與風(fēng)信子香，存在0525-H 與0525-1 兩個(gè)樣品中，且0525-H 中香氣更為濃郁。綜上所述，0525-1 的香氣較為豐富，而0525-H 的香味更為濃郁。

2.3 不同鹵制方式鹵制液排序檢驗(yàn)分析

不同鹵制條件鹵制液感官排序檢驗(yàn)結(jié)果如表3所示。三個(gè)樣品中，0525-H 秩和最小，0525-4 最大，初步表明3 個(gè)樣品的香氣濃度順序?yàn)?525-H＞0525-1＞0525-4，與OAV 結(jié)果相吻合。通過公式（3）計(jì)算可得Ftest=13.4，查閱感官表，j=10，P=3，α=0.01 時(shí)所對應(yīng)的臨界值為9.60，F(xiàn)test＞F，認(rèn)為樣品的秩次間存在差異，即消費(fèi)者對試驗(yàn)中三個(gè)樣品的喜好顯著差異。

表3 不同鹵制條件鹵制液感官排序檢驗(yàn)結(jié)果Table 3 Ranking test in marinade with different brine conditions

2.4 不同鹵制方式鹵制液香氣成分主成分分析

對三種不同樣品的香氣成分進(jìn)行主成分分析，由圖4 知PCA1 和PCA2 的貢獻(xiàn)率分別為2.93%和96.26%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為99.19%，表明結(jié)果足以區(qū)分3 個(gè)樣品。PCA1 與PCA2 方向上，三個(gè)樣品之間能良好地區(qū)分，且3 個(gè)樣品重復(fù)性較好，并歸屬于相對獨(dú)立的區(qū)域。0525-1 和0525-4 間距離最小，表示二者香氣成分較為相似，而微壓處理的鹵制液距離常壓樣品均較遠(yuǎn)，與聚類所得結(jié)果一致。

圖4 不同鹵制方式鹵制液樣品 PCA 分析圖Fig.4 PCA analysis chart of marinade with different brine conditions

3 結(jié)論

為分析不同鹵制條件下鹵制液中的香氣差異，采用HS-SPME-GC-MS 結(jié)合OAV、感官排序檢驗(yàn)以及PCA 對不同鹵制方式鹵制液進(jìn)行分析。利用GC-MS 在三個(gè)樣品中共鑒定出43 種揮發(fā)性化合物，其中0525-1 樣品中揮發(fā)性化合物種類較豐富，而0525-H 中的揮發(fā)性化合物總含量更高。通過計(jì)算OAV 值可知，鹵制液中的主體風(fēng)味物質(zhì)共15 種，其中0525-1、0525-4、0525-H 中分別有11 個(gè)、9 個(gè)、8 個(gè)，且花香味（丁香酚、芳樟醇）、草木香（桉葉油醇、對烯丙基苯甲醚）以及香膏味（肉豆蔻醚）為三種樣品的主要特征香氣。綜合分析，0525-H 樣品的香氣更為濃郁，0525-1 的香氣更為豐富，與GC-MS 結(jié)果相吻合，感官排序結(jié)果同樣可驗(yàn)證0525-H 樣品香氣更濃郁。聚類結(jié)果顯示常壓組兩個(gè)樣品香氣更接近，PCA 亦顯示0525-4 和0525-H 之間香氣差異較大，而0525-1 和0525-H 相似度高。綜上，微壓鹵制能明顯提升鹵制液的整體香氣，但會(huì)導(dǎo)致部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的散失。本研究可為后續(xù)鹵制液的工藝優(yōu)化和產(chǎn)品風(fēng)味提升提供理論支持。