基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的巴旦木氧化程度快速檢測(cè)

錢 玉，劉 帥，金 龍，孫 美，顏 玲，劉長虹，董保磊,*，鄭 磊,*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230031；2.洽洽食品股份有限公司，安徽合肥 230031）

堅(jiān)果富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，是重要的膳食補(bǔ)充食品[1]。近年來我國堅(jiān)果及相關(guān)產(chǎn)業(yè)規(guī)模增長迅速，已經(jīng)位列休閑食品首位。巴旦木是薔薇科植物巴旦杏Amygdalus communisL.的成熟種子[2-3]，在我國也被俗稱為薄殼杏仁、巴旦杏、扁桃等[4]。巴旦木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素類、多酚類化合物和不飽和脂肪酸等，具有調(diào)節(jié)人體血糖與血脂，改善人體腸道菌群等有益的功效[5]。隨著巴旦木產(chǎn)業(yè)的發(fā)展及消費(fèi)量的逐年增加，其產(chǎn)品的品質(zhì)也受到了消費(fèi)者更多的關(guān)注。油脂含量豐富的巴旦木在采收、貯藏和加工等過程中易受光照、氧氣等因素的影響而發(fā)生氧化酸敗并伴隨哈敗味[6-7]。巴旦木氧化程度的加劇不僅嚴(yán)重破壞了其獨(dú)特的口感和風(fēng)味，降低了營養(yǎng)價(jià)值，甚至可能對(duì)消費(fèi)者的健康產(chǎn)生危害，導(dǎo)致食品安全問題。因此對(duì)巴旦木的氧化程度進(jìn)行快速且精準(zhǔn)的檢測(cè)是提升堅(jiān)果產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)價(jià)值和保障食品安全的重要手段。目前國內(nèi)外針對(duì)巴旦木等油性堅(jiān)果氧化程度的檢測(cè)方法主要有感官評(píng)價(jià)，理化指標(biāo)檢測(cè)，以及儀器分析檢測(cè)等[8]。然而上述方法多存在缺陷，例如感官評(píng)價(jià)耗時(shí)長，主觀性強(qiáng)等，評(píng)價(jià)結(jié)果往往受測(cè)評(píng)人員自身因素影響。國標(biāo)法通過測(cè)定油性堅(jiān)果的過氧化值和酸價(jià)等理化指標(biāo)檢測(cè)來判定其氧化程度，存在操作繁瑣耗時(shí)，有機(jī)試劑用量大且檢測(cè)靈敏度低等問題。基于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等儀器分析方法可以用于測(cè)定油性堅(jiān)果的氧化程度，然而目前與巴旦木氧化程度相關(guān)的特征性揮發(fā)成分仍然不明確[9]；此外氣相色譜等儀器分析方法也具有檢測(cè)過程繁瑣、檢測(cè)成本昂貴且專業(yè)性要求高等不足，因而限制了其在巴旦木等油性堅(jiān)果氧化程度快速檢測(cè)中的應(yīng)用。

拉曼光譜是光子的一種非彈性散射現(xiàn)象，即入射光中的光子會(huì)與待測(cè)物質(zhì)的分子發(fā)生相互作用，部分反射光子的頻率會(huì)發(fā)生變化。通過拉曼光譜可以獲得待分析物質(zhì)的指紋圖譜，進(jìn)而對(duì)分子結(jié)構(gòu)等信息進(jìn)行分析[10]。然而普通拉曼光譜的信號(hào)非常微弱，因而限制了其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的應(yīng)用。近年來表面增強(qiáng)拉曼光譜（Surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）因具有光譜信息豐富、靈敏度高、檢測(cè)響應(yīng)迅速等顯著優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于分析傳感、環(huán)境監(jiān)測(cè)、食品安全等眾多領(lǐng)域[11-12]。因此，利用SERS 技術(shù)實(shí)現(xiàn)油性堅(jiān)果氧化程度的快速測(cè)定是保障其品質(zhì)安全的一種高效的技術(shù)手段[13]。目前有報(bào)道表明，堅(jiān)果所含有的油脂及其氧化產(chǎn)物類物質(zhì)的拉曼散射截面低，這在很大程度上限制了通過直接測(cè)定樣品拉曼信號(hào)的方式來判定油性堅(jiān)果的氧化程度[14-15]。因此，亟需建立一種基于新型增強(qiáng)基底的SERS 方法實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確且高效的油性堅(jiān)果氧化程度的鑒別方法。針對(duì)目前適用于油脂樣品的SERS 基底存在的種類少、制備復(fù)雜且成本高等問題。

本研究開發(fā)一種基于表面配體交換的方法以實(shí)現(xiàn)將水熱法合成的金納米粒子（Gold nanoparticles，AuNPs）轉(zhuǎn)相到甲苯溶液，制備出油溶性AuNPs。配體輔助的轉(zhuǎn)相策略是一種制備適用于非水相基質(zhì)SERS 基底的新型高效的手段，基于該策略構(gòu)建的SERS 檢測(cè)方法也逐漸應(yīng)用于食品中有害化合物的檢測(cè)。Xing 等[16]通過還原法制備了檸檬酸保護(hù)的Au@AgNPs，在油胺配體輔助下轉(zhuǎn)相制備出油溶性的納米粒子用作SERS 基底，實(shí)現(xiàn)了結(jié)晶紫的高靈敏檢測(cè)。Li 等[17]利用水熱還原法合成銀納米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs），AgNPs 在十八烷基胺輔助下于正己烷-水界面形成納米膜可用于食品中Hg2+的痕量檢測(cè)。Zhang 等[18]研究表明聚4 乙烯基吡啶可以促進(jìn)AuNPs 在水-氯仿界面共組裝成納米膜SERS 基底，可以用于食品中多種抗生素殘留檢測(cè)?；谏鲜龅难芯拷Y(jié)果，油溶性AuNPs可作為有效的增強(qiáng)基底用于油脂的原位SERS 檢測(cè)。本研究基于油溶性AuNPs 基底所建立的SERS方法可以實(shí)現(xiàn)巴旦木氧化程度的快速檢測(cè)，結(jié)合PCA分析法可以實(shí)現(xiàn)不同氧化程度樣品的快速分類，可為巴旦木等油性堅(jiān)果的品質(zhì)控制供新的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的巴旦木 洽洽食品有限公司，采購自美國加州，-20 ℃冰箱中放置備用；甲苯、乙醇、石油醚（沸點(diǎn)30～60 ℃）、氯金酸、檸檬酸 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；十八烷硫醇 分析純，TCI 化學(xué)試劑有限公司。

ATR3110 便攜式拉曼光譜儀 廈門奧普天成有限公司；Tecnai G2 F20 場(chǎng)發(fā)射高分辨透射電鏡 美國FEI NanoPorts 公司；SU5000 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡日本日立公司；Zetasizer Nano ZS 激光粒度儀 英國Malvern Instruments 公司；精密型電子天平 德國Sartorius 公司；微量可調(diào)移液器 德國Eppendorf公司；5425R 型離心機(jī) 德國Eppendorf 公司；集熱式加熱磁力攪拌器 德國IKA 公司；渦旋混合器海門其林貝爾有限公司；Milli-Q 超純水儀 Millipore 公司；Evolution 紫外可見分光光度計(jì) 美國Thermo-Fisher 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水溶性AuNPs 的制備 采用經(jīng)典的“水熱還原法”制備平均尺寸為40 nm 的水溶性球形AuNPs[19]，具體步驟如下：將3.0 mL 的檸檬酸鈉溶液（濃度35.0 mmol/L）和1.0 mL 的氯金酸溶液（25.0 mmol/L）依次加入到100.0 mL 沸騰的超純水中，持續(xù)加熱并攪拌30 min 后，得到呈酒紅色的溶液并攪拌并自然冷卻至室溫，最終獲得平均粒徑為40 nm 的水溶性AuNPs。制備的AuNPs 表面由檸檬酸鈉配體穩(wěn)定，其納米形貌和分散性等特征通過透射電鏡和粒度分析儀等進(jìn)行表征鑒定。

1.2.2 油溶性AuNPs 的轉(zhuǎn)相制備 本研究中通過借助配體交換策略實(shí)現(xiàn)將檸檬酸鈉配體穩(wěn)定的水溶性AuNPs 轉(zhuǎn)化為十八胺配體穩(wěn)定的油溶性AuNPs[20-21]。具體轉(zhuǎn)相制備步驟如下：將制備的水溶性AuNPs 溶液與十八胺的甲苯溶液（1.0 mmol/L）以5:1 的體積比混合；混合液劇烈渦旋振蕩3 min 后靜置至溶液分層，水相中AuNPs 會(huì)轉(zhuǎn)移到油相的甲苯溶液中。分離并收集轉(zhuǎn)移后的油相AuNPs 溶液，以上所有的操作均在室溫條件下進(jìn)行。

1.2.3 巴旦木樣品的處理及拉曼光譜測(cè)定油脂氧化程度

1.2.3.1 樣品處理 北美當(dāng)季新鮮的巴旦木與室溫儲(chǔ)藏9、11、13、15 和17 個(gè)月的5 組巴旦木實(shí)際樣品均由洽洽公司提供，將新鮮的巴旦木放置在溫度為60 ℃的恒溫恒濕箱中進(jìn)行加速氧化處理。參照GB 5009.227-2016《食品中過氧化值的測(cè)定》中的方法提取60 ℃加速氧化巴旦木和5 組巴旦木實(shí)際樣品的油脂，并測(cè)定60 ℃加速氧化巴旦木油脂的過氧化值。

1.2.3.2 拉曼光譜條件 拉曼信號(hào)采集條件參數(shù)：激光功率為25 mW，溫度為25 ℃，積分時(shí)間為30 s，掃描次數(shù)為1 次，掃描范圍為200～2500 cm-1。常規(guī)拉曼信號(hào)采集方法：取20 μL 巴旦木油脂加入石英微孔板中，調(diào)整拉曼光譜儀的激光頭高度至合適信號(hào)強(qiáng)度后固定并進(jìn)行測(cè)定，采集每個(gè)樣品的拉曼光譜。油脂的表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）信號(hào)采集方法：巴旦木油脂與油相AuNPs 的體積比、孵育溫度、孵育時(shí)間經(jīng)優(yōu)化后選擇適宜的實(shí)驗(yàn)條件采集油脂的SERS 光譜信號(hào)；其他條件同常規(guī)拉曼信號(hào)采集方法一致。

1.2.3.3 SERS 檢測(cè)條件的優(yōu)化 為獲得SERS 檢測(cè)巴旦木油脂的最佳性能，本研究對(duì)巴旦木油脂與油相AuNPs 的體積比、孵育溫度、孵育時(shí)間三個(gè)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs的體積比，將新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以1:1、2:1、3:1、4:1、3:2、4:3 的體積比例混合，50 ℃水浴1 h，采集油脂的SERS 信號(hào)，以1655 cm-1處SERS強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳體積比。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs 的孵育溫度，新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以3:2 的體積比混合，分別于40、45、50、55、60 ℃水浴中孵育1 h，采集油脂的SERS 信號(hào)，以1655 cm-1處SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳孵育溫度。為優(yōu)化巴旦木油脂與油相AuNPs 的孵育時(shí)間，新鮮的巴旦木油脂與油相AuNPs 以3:2 的體積比混合，于50 ℃分別孵育0.5、1、1.5、2、2.5 h，采集油脂的SERS 信號(hào)，以1655 cm-1處SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)得到油脂與油相AuNPs 的最佳孵育時(shí)間。

1.3 數(shù)據(jù)處理

油脂的過氧化值平行測(cè)定5 次，油脂常規(guī)拉曼光譜和SERS 光譜每個(gè)樣品均采集20 條，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用Origin 2020 Pro 軟件進(jìn)行檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合，得到拉曼光譜信號(hào)值與加速氧化時(shí)間之間的線性關(guān)系。使用Matlab R2016a軟件進(jìn)行拉曼光譜的主成分分析（Principal component analysis，PCA）數(shù)據(jù)處理和擬合，建立巴旦木新鮮度的分析模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米粒子的制備與轉(zhuǎn)相

基于金納米材料的增強(qiáng)基底具有穩(wěn)定性高、增強(qiáng)效果好等優(yōu)點(diǎn)，可以有效提高SERS 的檢測(cè)靈敏度[22-23]。AuNPs 因具有易于制備、成本低、性質(zhì)穩(wěn)定等突出的優(yōu)勢(shì)，是目前應(yīng)用最為廣泛的一類SERS基底[24-25]。甲苯等有機(jī)相中通過還原法制備的金納米粒子通常粒徑小于10 nm，過小粒徑的金納米粒子不利于拉曼信號(hào)的有效增強(qiáng)，因此難以用作SERS 檢測(cè)的基底[26]。因此，本研究通過水熱還原法制備水溶性的AuNPs，進(jìn)一步采用配體交換的轉(zhuǎn)相策略實(shí)現(xiàn)較大金納米粒子從水溶液到非極性有機(jī)相的成功轉(zhuǎn)相[20-21]。

本研究選用甲苯作為有機(jī)油相，采用長鏈脂肪胺類化合物—十八烷基胺作為油相配體進(jìn)行金納米粒子的轉(zhuǎn)相。AuNPs 的轉(zhuǎn)相過程如圖1 所示，水熱還原法制備AuNPs 的表面由檸檬酸配體包覆，可以良好地分散于水溶液。十八烷基胺的甲苯溶液加入AuNPs 溶液后，會(huì)與水溶液之間形成明顯的界面。十八烷基胺分子會(huì)通過界面向水溶液中進(jìn)行擴(kuò)散，且十八烷基胺分子與AuNPs 的親和力要高于檸檬酸分子與AuNPs 的親和力。AuNPs 與檸檬酸配體是通過靜電作用力相結(jié)合，而含有氨基的化合物可以取代AuNPs 表面的檸檬酸根，AuNPs 與十八烷基胺的相互作用力高于與檸檬酸根的靜電作用力[20,27]。因此在上述的界面擴(kuò)散過程中，十八烷基胺分子會(huì)取代AuNPs 表面原有的檸檬酸分子，使得AuNPs 改變?yōu)殡娭行缘氖杷砻?，進(jìn)而可成功分散于非極性的甲苯溶液中。

圖1 基于配體交換策略的油相AuNPs 制備流程示意圖Fig.1 Preparation of oil-phase AuNPs based on ligand exchange strategy

如圖2a 所示的SEM 結(jié)果表明，水熱還原法制備AuNPs 的粒徑分布均勻；圖2b 所示的TEM 結(jié)果表明其平均粒徑約為40 nm。動(dòng)態(tài)光散射測(cè)試（DLS）表明水溶液中AuNPs 的平均水合粒徑為49 nm，與電鏡表征的結(jié)果相一致（圖2c）。UV-vis吸收光譜測(cè)試表明水溶液中AuNPs 的最大吸收波長為522 nm。通過水熱還原法制備的金納米粒子具有良好的水溶性，但是難以用于油相樣品的SERS檢測(cè)。因此本研究首先合成水相的AuNPs，通過油相配體交換的轉(zhuǎn)相策略實(shí)現(xiàn)了油相的AuNPs 的制備。從圖2d 中TEM 圖像中可發(fā)現(xiàn)，相轉(zhuǎn)移后得到的油相AuNPs 分散性良好，粒子的納米形貌未發(fā)生明顯的變化，上述結(jié)果表明配體交換介導(dǎo)的轉(zhuǎn)相過程不會(huì)明顯地改變金納米粒子的分散性與形貌尺寸，可以開展進(jìn)一步的研究。UV-vis 吸收光譜表明相轉(zhuǎn)移后的油相AuNPs的最大吸收波長從522 nm 紅移到528 nm（圖2e）。相轉(zhuǎn)移過程中，AuNPs 表面負(fù)電荷的檸檬酸鈉配體被電中性的十八烷基胺分子所取代，進(jìn)而導(dǎo)致了上述吸收光譜紅移現(xiàn)象的發(fā)生。綜上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用配體交換的策略，可以成功地將水溶液中的AuNPs轉(zhuǎn)相到非極性甲苯中。轉(zhuǎn)相后的AuNPs 表面被十八烷基胺分子包覆，使其可以很好地分散到油脂中，進(jìn)而起到拉曼增強(qiáng)基底的作用。

2.2 油相金納米粒子SERS 增強(qiáng)信號(hào)評(píng)價(jià)

為了驗(yàn)證油相溶液中油溶性AuNPs，可以通過表面配體交換的方式來實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的拉曼信號(hào)增強(qiáng)，本研究中采用十八烷基硫醇作為模式SERS 信號(hào)分子開展評(píng)估試驗(yàn)，并進(jìn)一步測(cè)定油溶性AuNPs 的SERS 增強(qiáng)性能。十八烷基硫醇分子可以通過表面配體交換的方式，以形成金-巰等形式結(jié)合到AuNPs的表面[28-29]。本研究通過測(cè)定十八烷基硫醇的SERS 信號(hào)增強(qiáng)，來計(jì)算油溶性AuNPs 的增強(qiáng)因子[30]，進(jìn)而評(píng)估其增強(qiáng)性能。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金-巰鍵的特征性拉曼信號(hào)位于300 cm-1至350 cm-1范圍內(nèi)[31-32]。圖3a 是用甲苯稀釋后濃度為10 μmol/L 的十八烷基硫醇溶液的常規(guī)拉曼光譜與SERS 光譜，從圖中的結(jié)果中可知，常規(guī)拉曼光譜中難以分辨出十八烷基硫醇中巰基所對(duì)應(yīng)的拉曼信號(hào)峰。基于油相AuNPs 作為增強(qiáng)基底的十八烷基硫醇的SERS 光譜中344 cm-1處的特征峰對(duì)應(yīng)AuNPs 表面形成的金-巰鍵。從光譜結(jié)果的對(duì)比可知，十八烷基硫醇分子中巰基基團(tuán)經(jīng)過表面增強(qiáng)以后信號(hào)強(qiáng)度比常規(guī)拉曼有顯著的增加，表明油相AuNPs 可以用于增強(qiáng)基底用于油脂樣品的檢測(cè)。為了評(píng)估SERS 檢測(cè)信號(hào)的可重復(fù)性，在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中收集50 個(gè)隨機(jī)點(diǎn)處十八烷基硫醇的SERS光譜。如圖3b 和圖3c 所示，對(duì)344 cm-1處峰值強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為4.86%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的可重復(fù)性。綜上，經(jīng)過轉(zhuǎn)相制備的油溶性AuNPs 可以作為良好的增強(qiáng)基底，實(shí)現(xiàn)油相溶液中待測(cè)物的原位SERS 檢測(cè)。

圖3 油相AuNPs 的SERS 增強(qiáng)信號(hào)與重復(fù)性Fig.3 SERS enhanced signal and repeatability of oil phase AuNPs

2.3 加速氧化過程中巴旦木油脂拉曼光譜信號(hào)的特征變化

在常規(guī)理化分析中，過氧化值是鑒定油性堅(jiān)果氧化程度的重要指標(biāo)之一，反映了油脂初級(jí)氧化產(chǎn)物的濃度。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19300-2014：《堅(jiān)果與籽類食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定，巴旦木等油性堅(jiān)果樣品的過氧化值要低于0.08 g/100 g（以提取油脂計(jì)）。加速氧化過程中巴旦木的過氧化值變化情況如圖4a 所示，隨著加速氧化時(shí)間的延長，其過氧化值總體呈上升趨勢(shì)。實(shí)際研究中發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)過60 ℃條件下存儲(chǔ)30 d，巴旦木樣品的過氧化值仍然只達(dá)到0.04 g/100 g，其值仍小于國標(biāo)限量。但是上述氧化后的巴旦木出現(xiàn)了嚴(yán)重的酸敗氣味，不符合國標(biāo)規(guī)定的感官要求。因此上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在實(shí)際應(yīng)用中，過氧化值等單一的理化指標(biāo)難以有效且真實(shí)地反映巴旦木的氧化程度變化。巴旦木油脂氧化過程中，樣品的拉曼信號(hào)的變化主要由氧化導(dǎo)致的油脂結(jié)構(gòu)的變化而引起。圖4b 是新鮮的巴旦木油脂與加速氧化30 d 后的巴旦木油脂的常規(guī)拉曼光譜（因結(jié)果圖相似度較高，部分天數(shù)未呈現(xiàn)）。由圖4b可知巴旦木油脂的拉曼信號(hào)峰主要集中于700～1800 cm-1的范圍內(nèi)，巴旦木油脂的特征拉曼光譜區(qū)域主要包含：860 cm-1附近處的拉曼峰，對(duì)應(yīng)-（CH2）n-基團(tuán)的伸縮振動(dòng)；968 cm-1處的拉曼峰，對(duì)應(yīng)的反式雙鍵（=C-H）彎曲振動(dòng)；1264 cm-1處的順式雙鍵（=C-H）彎曲振動(dòng)；1302 及1442 cm-1處的亞甲基（-CH2-）彎曲振動(dòng)；1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）伸縮振動(dòng)；1747 cm-1處的酯鍵（-C=O）伸縮振動(dòng)等[33]。

圖4 60 ℃加速氧化巴旦木油脂的過氧化值和常規(guī)拉曼光譜Fig.4 Oxidation value and conventional Raman spectra of almonds oil at 60 ℃

在巴旦木油脂的氧化程度加深的過程中，油脂中不飽和脂肪酸分子的順式雙鍵發(fā)生異構(gòu)化并趨向于通過分子重排成為穩(wěn)定的反式雙鍵構(gòu)型[34]。如圖4b所示，隨著氧化程度的加深，巴旦木油脂中不飽和脂肪酸的反式雙鍵（=C-H）在967 cm-1處拉曼信號(hào)強(qiáng)度較弱且信噪比偏低；順式雙鍵δ（=C-H）在1264 cm-1處的拉曼信號(hào)強(qiáng)度變化無明顯規(guī)律， 1747 cm-1（-C=O）處峰強(qiáng)度在氧化過程中發(fā)生的變化較微小。在加速氧化過程中，巴旦木油脂不飽和鍵被破壞是氧化過程中最典型的變化，即順式雙鍵在減少。巴旦木油脂的拉曼光譜信號(hào)測(cè)定過程中，樣品的提取試劑及測(cè)試時(shí)的條件等會(huì)引起測(cè)試信號(hào)的差異。本研究選擇1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）作為特征拉曼信號(hào)，選擇波長較為接近的酯鍵的1747 cm-1作為參比信號(hào)，用I1655/I1747值表征巴旦木油脂的氧化程度隨加速氧化時(shí)間的變化。圖4c 結(jié)果表明I1655/I1747值的整體趨勢(shì)是隨著加速氧化天數(shù)的增加而降低，說明總不飽和脂肪酸在降低。此外由圖4b 中的結(jié)果也可知，常規(guī)拉曼光譜存在基線噪聲信號(hào)較大，信噪比較低且與氧化程度相關(guān)的特征峰變化不顯著等不足，限制了其在精確監(jiān)測(cè)油脂氧化程度中的應(yīng)用。

2.4 基于SERS 光譜的巴旦木氧化程度的快速檢測(cè)

巴旦木油脂與油溶性AuNPs 的體積比、孵育溫度以及時(shí)間會(huì)對(duì)油脂的SERS 強(qiáng)度產(chǎn)生影響，如圖5所示以油脂1655 cm-1處特征峰的SERS 強(qiáng)度為指標(biāo)優(yōu)化檢測(cè)條件。圖5a 顯示了油脂與油溶性AuNPs的體積比對(duì)SERS 強(qiáng)度的影響，油脂體積越大，SERS強(qiáng)度有所降低，增加AuNPs 的體積SERS 強(qiáng)度增加，當(dāng)油脂與油相AuNPs 的體積比為3:2 時(shí)，SERS強(qiáng)度最大，因此選定油脂與油相AuNPs 的體積比為3:2。油脂與油溶性AuNPs 的孵育溫度和時(shí)間也會(huì)影響到SERS 強(qiáng)度，如圖5b 和圖5c 所示。溫度升高，SERS 強(qiáng)度增加，50 ℃時(shí)達(dá)到峰值，溫度繼續(xù)增加SERS 強(qiáng)度降低，50 ℃是最佳的孵育溫度。在油脂與油溶性AuNPs 的孵育0.5 h 時(shí)SERS 強(qiáng)度最大，增加孵育時(shí)間SERS 強(qiáng)度會(huì)降低，0.5 h 是最佳的孵育時(shí)間。綜上所述，油脂與油溶性AuNPs 的體積比為3:2，孵育溫度是50 ℃，孵育時(shí)間是0.5 h。

圖5 SERS 檢測(cè)條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of conditions for SERS measurement

為了嘗試解決常規(guī)拉曼光譜的不足，本研究通過使用油溶性AuNPs 作為增強(qiáng)基底，測(cè)定巴旦木油脂的SERS 信號(hào)。巴旦木油脂氧化程度相關(guān)的SERS 信號(hào)的主要通過氧化的脂肪類分子與油溶性AuNPs 表面的十八胺分子發(fā)生配體交換引發(fā)。油溶性AuNPs 可以與巴旦木油脂均勻地混合，在原位SERS 檢測(cè)過程中，巴旦木油脂的氧化產(chǎn)物吸附到油相AuNPs 的表面，通過測(cè)定SERS 信號(hào)的強(qiáng)弱可以得出油脂的氧化產(chǎn)物的相對(duì)含量，從而精確地反映出巴旦木油脂的氧化程度。圖6a 是加速氧化后巴旦木樣品油脂的SERS 光譜。由于AuNPs轉(zhuǎn)相中采用甲苯為溶劑，所以空白的油溶性AuNPs在1002 cm-1處存在甲苯分子的特征拉曼峰。在巴旦木油脂的反式雙鍵特征峰（968 cm-1）附近，甲苯分子的存在具有較大的干擾作用，因此在分析樣品的SERS 光譜時(shí)舍棄了968 cm-1位置的拉曼特征峰。

圖6 60 ℃加速氧化巴旦木油脂和5 組實(shí)際樣品的SERS 分析結(jié)果Fig.6 SERS analysis results of accelerated oxidation of oil of almonds at 60 ℃ and 5 groups of actual samples

本研究同樣采用內(nèi)參法對(duì)巴旦木油脂的SERS特征峰的信號(hào)強(qiáng)度變化進(jìn)行分析，采用1655 cm-1處的順式雙鍵（C=C）作為特征拉曼信號(hào)，選擇波長較為接近的酯鍵的1747 cm-1作為參比信號(hào)，用相對(duì)強(qiáng)度來分析巴旦木油脂的SERS 光譜，進(jìn)而評(píng)價(jià)分析巴旦木的氧化程度。圖6b 中展示了采用SERS 光譜監(jiān)測(cè)巴旦木樣品的油脂在加速氧化過程中的變化趨勢(shì)，I1655/I1747值隨著氧化程度的增加而顯著降低，歸因于油脂中順式結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸分子的消耗。為了驗(yàn)證SERS 檢測(cè)方法在快速判定巴旦木氧化程度的能力以及闡明SERS 信號(hào)強(qiáng)度和氧化程度之間的關(guān)系，將60 ℃加速氧化不同時(shí)期巴旦木油脂的SERS 的相對(duì)強(qiáng)度和其加速氧化時(shí)間進(jìn)行了曲線擬合，得到了擬合模型（圖6b），R2達(dá)到0.98，顯示出良好的擬合效果并可用于評(píng)價(jià)巴旦木的氧化程度?，F(xiàn)對(duì)洽洽公司庫存的5 組不同儲(chǔ)藏時(shí)間的巴旦木實(shí)際樣品提取油脂后測(cè)定SERS 光譜，如圖6c 所示，5 個(gè)巴旦木實(shí)際樣品SERS 光譜的I1655/I1747值，與其實(shí)際儲(chǔ)藏時(shí)間具有良好的相關(guān)性，表明該方法可以用于實(shí)際巴旦木樣品氧化程度的初步判定。

本研究進(jìn)一步使用SERS 光譜結(jié)合PCA 分析用于巴旦木氧化程度的快速判定和分類。PCA 可以在光譜數(shù)據(jù)分析中用于轉(zhuǎn)換原始的多維冗余光譜變量，可以有效消除重疊和不相關(guān)的信息。實(shí)驗(yàn)中首先通過收集來自不同加速氧化天數(shù)的巴旦木油脂的10 組SERS 光譜進(jìn)行PCA 分析。圖6d 中的分析結(jié)果表明，采用3D 分析圖進(jìn)行PCA 識(shí)別分析可以實(shí)現(xiàn)良好的效果，通過前三個(gè)主成分可以很好地實(shí)現(xiàn)對(duì)新鮮巴旦木以及分別加速氧化6、15、24 及30 d 的巴旦木樣品的分類，前三個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別是79.21%、19.97%和0.52%。針對(duì)上述5 個(gè)巴旦木實(shí)際樣品的PCA 分析同樣取得了良好的分類效果，可對(duì)5 個(gè)不同儲(chǔ)藏時(shí)間的樣品進(jìn)行分類，前三個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別是93.47%、4.44%和0.78%。上述研究結(jié)果表明借助SERS 光譜和PCA 分析方法可成功實(shí)現(xiàn)不同氧化程度的巴旦木樣品的分類分析。

堅(jiān)果的新鮮度是其營養(yǎng)與品質(zhì)的一個(gè)重要影響因素，目前堅(jiān)果新鮮度的檢測(cè)方法包括感官檢測(cè)、理化檢測(cè)和快速檢測(cè)等[35]，然而這些檢測(cè)技術(shù)存在操作繁瑣及檢測(cè)靈敏度低等問題。與肉類產(chǎn)品、水果等相比，巴旦木等堅(jiān)果具有油脂含量高、水分含量低且微生物不易滋生等特點(diǎn)，因此其各成分的氧化程度是其新鮮度的最重要體現(xiàn)。巴旦木等堅(jiān)果的不飽和脂肪酸等容易發(fā)生氧化，因此采用油脂的氧化程度來表示巴旦木等堅(jiān)果新鮮度是一種便捷且準(zhǔn)確的方法[36]。本研究建立的基于SERS 光譜的巴旦木油脂氧化程度快速檢測(cè)方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)巴旦木新鮮度的快速判定，為保障堅(jiān)果的品質(zhì)安全提供了新的技術(shù)手段。

3 結(jié)論

本研究成功建立了基于SERS 光譜的巴旦木氧化程度快速檢測(cè)方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。針對(duì)適用于油脂類食品的拉曼增強(qiáng)基底存在的種類較少、制備復(fù)雜等不足，本研究采用表面配體交換的策略，成功實(shí)現(xiàn)了將水熱法合成的AuNPs 轉(zhuǎn)相到甲苯溶液。本研究制備的油溶性AuNPs 可作為有效的增強(qiáng)基底用于油脂類樣品的原位SERS 檢測(cè)，同時(shí)具有成本低、制備過程簡潔等顯著優(yōu)勢(shì)?；谟腿苄訟uNPs 基底所建立的SERS 方法可以實(shí)現(xiàn)巴旦木氧化程度的快速檢測(cè)，建立了SERS 信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度（I1655/I1747）和氧化天數(shù)之間的分析模型，為定性分析巴旦木的氧化程度提供了一種新方法。同時(shí)本研究結(jié)合使用PCA 分析方法對(duì)不同氧化程度的巴旦木進(jìn)行快速分類，結(jié)果表明了不同氧化時(shí)間樣品之間區(qū)分較好。綜上所述，本研究表明基于SERS 光譜的快速檢測(cè)方法展示了對(duì)巴旦木氧化程度的快速檢測(cè)和分類的能力，為食品快速檢測(cè)提供了新的思路。