槐花多糖的提取、純化和抗氧化活性分析

張玉梅，邢慧珍，劉會(huì)平，喬賽鳳

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

槐花是豆科植物槐（Sophora japonicaL.）的干燥花及花蕾，屬于藥食同源類植物，主要分布在黃土高原和華北平原[1-2]。研究表明，槐花由蘆丁、酚類化合物、氨基酸、多糖、三萜和生物堿等化學(xué)成分組成[3]，具有多種藥理特性，包括抗氧化、抗菌、抗衰老、鎮(zhèn)痛和抗過(guò)敏[4]。多糖是由10 個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵結(jié)合而成的高分子聚合物[5]，具有多種生物活性，如降血糖[6]、抗腫瘤[7]、抗病毒[8]、抗氧化[9]等。

常見的槐花多糖的提取方法有水提醇沉法、酶提法[10]、超聲輔助提取法[11]等。水提法是最傳統(tǒng)的方法，具有工藝過(guò)程簡(jiǎn)單、設(shè)備要求低、多糖結(jié)構(gòu)不易被破壞等優(yōu)點(diǎn)。目前水提法提取槐花多糖主要采用正交法優(yōu)化提取工藝，關(guān)于響應(yīng)面法優(yōu)化水提法提取槐花多糖工藝的的研究較少。王紅慶等[12]采用正交法優(yōu)化槐花多糖的提取工藝，得出最佳工藝條件為料液比1:25 g/mL、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間6 h，該工藝條件下槐花多糖的提取率為3.10%。胡喜蘭等[13]采用正交試驗(yàn)法得出水提法提取槐花多糖的最佳工藝條件為料液比1:15 g/mL、浸提溫度95 ℃、浸提時(shí)間6 h，所得槐花多糖的含量為0.0626 g/g。

此外，目前關(guān)于槐花純化多糖組分抗氧化活性的研究較少。王麗華[14]從槐花中分離純化出了三種分子量較低（10.85、7.72 和2.88 kDa）的多糖組分，發(fā)現(xiàn)這三種組分均具有一定的抗氧化能力。研究表明，多糖的均勻性和分子量會(huì)對(duì)其生物活性造成影響，且不同產(chǎn)地、不同提取條件下所得多糖的抗氧化活性不同[15]。

本研究以槐花為原料，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化水提法提取槐花多糖的工藝條件，并經(jīng)過(guò)脫蛋白、透析、Sephadex G-200 凝膠柱層析得到一種新型的大分子純化多糖組分，命名為SJP，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并以VC為陽(yáng)性對(duì)照，DPPH·、·OH、ABTS+·清除率及總還原力為指標(biāo)探究其抗氧化活性，為槐花多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

干燥的槐花 天津同仁堂中藥店提供；牛血清白蛋白（BSA）、半乳糖醛酸、葡萄糖、葡聚糖凝膠G-200、抗壞血酸（VC）、ABTS 北京索萊寶科技有限公司；水楊酸、DPPH、鐵氰化鉀、氯化鐵、硫酸亞鐵麥克林生化科技有限公司；所使用的試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SE-2000 高速粉碎機(jī) 浙江永康市圣象電器有限公司；DF-101S 恒溫水浴鍋 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；BS-100A 自動(dòng)收集器 上海滬西儀器分析廠；FD-1A-50 冷凍干燥機(jī) 上海比朗儀器制造有限公司；Synergy HTX 酶標(biāo)儀 美國(guó)伯騰儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；Smartlab-3KW X 射線衍射儀 日本理學(xué)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 槐花多糖的提取 將干燥的槐花粉碎并使用石油醚在70 ℃條件下對(duì)其進(jìn)行脫脂處理，然后按照一定的料液比和提取時(shí)間，100 ℃水浴提取，冷卻后以4000 r/min 離心10 min，將所得上清液濃縮至原體積的1/3，然后向其中加入一定體積的無(wú)水乙醇，4 ℃冰箱放置過(guò)夜，收集離心后的沉淀物，用蒸餾水復(fù)溶，8000 r/min 離心10 min，收集上清液并冷凍干燥，得到槐花粗多糖，命名為cSJP。cSJP 的得率由公式（1）計(jì)算：

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 料液比對(duì)cSJP 得率的影響 固定提取時(shí)間120 min，醇沉濃度60%，提取次數(shù)1 次，探究料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對(duì)cSJP 得率的影響。

1.2.2.2 提取時(shí)間對(duì)cSJP 得率的影響 固定料液比1:20 g/mL，醇沉濃度60%，提取次數(shù)1 次，探究提取時(shí)間（60、90、120、150、180 min）對(duì)cSJP 得率的影響。

1.2.2.3 提取次數(shù)對(duì)cSJP 得率的影響 固定料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間120 min，醇沉濃度60%，探究提取次數(shù)（1、2、3、4、5 次）對(duì)cSJP 得率的影響。

1.2.2.4 醇沉濃度對(duì)cSJP 得率的影響 固定料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間120 min，提取次數(shù)1 次，探究醇沉濃度（40%、50%、60%、70%、80%）對(duì)cSJP 得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、醇沉濃度（C）作為考察因素，cSJP 得率為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken 原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，因素和水平的設(shè)計(jì)如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Response surface test design factors and levels

1.2.4 槐花多糖的純化 采用Sevag 法脫除蛋白質(zhì)，然后使用截留分子量為10 kDa 的透析袋透析除去小分子物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽，并通過(guò)Sephadex G-200 凝膠柱層析（柱尺寸為1.6 cm×40 cm，洗脫速度為0.3 mL/min，體積為3 mL/管）得到純化多糖組分，命名為SJP。

1.2.5 SJP 的結(jié)構(gòu)表征

1.2.5.1 SJP 的分子量測(cè)定 采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定SJP 的分子量。用超純水配制1 mg/mL的SJP 溶液，過(guò)0.22 μm 水系濾膜后裝入液相小瓶中待測(cè)。選用示差檢測(cè)器，溫度設(shè)置為35 ℃；柱溫設(shè)置為30 ℃；超純水為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；采用T 系列（T-10、T-70、T-100、T-300、T-500 和T-2000）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品建立lg Mw-Rt標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算SJP 的分子量。

1.2.5.2 SJP 化學(xué)成分的測(cè)定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定SJP 中的總糖含量[16]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[17]。以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用間羥基聯(lián)基法測(cè)定糖醛酸含量[18]。

1.2.5.3 剛果紅實(shí)驗(yàn) 將SJP 溶液（2 mL，0.4 mg/mL）、剛果紅溶液（2 mL，50 μmol/L）與不同梯度濃度的NaOH 溶液混合，使得NaOH 的最終濃度分別為0，0.05，0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35 和0.4 mol/L，在室溫下衍生化10 min 后，在400～600 nm 范圍內(nèi)測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.5.4 X-射線衍射分析 SJP 的X-射線衍射圖譜（XRD）由X-射線衍射儀測(cè)定，具體掃描角度范圍為5°～90°，掃描速度為2°/min。

1.2.6 SJP 抗氧化活性的測(cè)定 以下試驗(yàn)均以VC為陽(yáng)性對(duì)照組，測(cè)定不同濃度（0.1～5 mg/mL）SJP 溶液的抗氧化活性。

1.2.6.1 DPPH·清除率的測(cè)定 將SJP 溶液與0.2 mmol/L DPPH-無(wú)水乙醇溶液按照體積比1:4 充分混勻，避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度值[19]。按照公式（2）計(jì)算清除率：

式中：A1為SJP 溶液的吸光度值；A2為無(wú)水乙醇代替DPPH-無(wú)水乙醇溶液的吸光度值；A0為蒸餾水代替SJP 溶液的吸光度值。

1.2.6.2 ·OH 清除率測(cè)定 向SJP 溶液中加入等體積的FeSO4溶液（6 mmol/L）、水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）以及H2O2溶液（0.1%），37 ℃恒溫水浴30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度值[20]。按照公式（3）計(jì)算清除率：

式中：A1為SJP 溶液的吸光度值；A2為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度值；A0為蒸餾水代替SJP溶液的吸光度值。

1.2.6.3 ABTS+·清 除 率 測(cè) 定 將 ABTS+·溶 液（7 mmol/L）與過(guò)硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）以體積比1:1 混合，避光12 h 后，用蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處的吸光度值為0.7±0.02，得到ABTS+·工作液。移取10 μL SJP 溶液和200 μL 工作液于96 孔板中，室溫放置6 min，在734 nm 處測(cè)定吸光度值[21]。按照公式（4）計(jì)算清除率：

式中：A1為SJP 溶液的吸光度值；A2為蒸餾水代替ABTS+·工作液的吸光度值；A0為蒸餾水代替SJP 溶液的吸光度值。

1.2.6.4 總還原力的測(cè)定 向1 mL SJP 溶液中先后加入2.5 mL 磷酸緩沖液（0.2 moL/L，pH6.6）和2.5 mL 鐵氰化鉀溶液（1%），50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL 三氯乙酸（10%），充分混勻，3000 r/min離心10 min，取100 μL 上清液于96 孔板中，加入100 μL 蒸餾水和20 μL FeCl3溶液（0.1%），混勻后靜置10 min，在700 nm 處測(cè)定吸光度值[22]。根據(jù)公式（5）計(jì)算：

式中：A1為SJP 溶液的吸光度值；A2為蒸餾水代替SJP 溶液的吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用單因素方差分析（One-way ANOVA）進(jìn)行組間比較，P＜0.05 或P＜0.01 表示差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 22、Origin 2018 和Design-Expert 10 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)cSJP 得率的影響 由圖1 可知，cSJP得率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)料液比為1:20（g/mL）時(shí)，cSJP 得率達(dá)到最高為3.81%。這與Li 等[23]研究發(fā)現(xiàn)的黃芪多糖得率隨料液比變化的趨勢(shì)相同。這種現(xiàn)象的發(fā)生是因?yàn)楫?dāng)蒸餾水比例過(guò)低時(shí)，受固液接觸面積及植物細(xì)胞內(nèi)部與溶劑之間濃度差的限制，多糖無(wú)法全部溶出，溶劑比例越大，濃度差異越明顯，多糖分子擴(kuò)散的越快，但過(guò)高的溶劑比例會(huì)延長(zhǎng)分子從組織內(nèi)部擴(kuò)散的距離并導(dǎo)致雜質(zhì)溶出的增多而抑制多糖的溶出[24-25]。此外，過(guò)量的溶劑會(huì)增加后續(xù)濃縮過(guò)程的負(fù)擔(dān)，并導(dǎo)致溶劑的浪費(fèi)。因此選擇1:15、1:20、1:25（g/mL）三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖1 料液比對(duì)cSJP 得率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the yield of cSJP

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)cSJP 得率的影響 提取時(shí)間是影響多糖得率的重要因素。由圖2 可知，當(dāng)提取時(shí)間從60 min 增加至120 min 時(shí)，cSJP 得率顯著增加（P＜0.05），在120 min 時(shí)達(dá)到最大值為3.85%，之后繼續(xù)增加提取時(shí)間，多糖的得率略有下降（P＞0.05），這是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)短，受傳質(zhì)速率的影響，多糖無(wú)法全部溶出，而提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則會(huì)導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)的破壞以及雜質(zhì)溶出的增多[26-27]。綜合考慮多糖提取的時(shí)間成本及其最終得率，選擇90、120、150 min 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖2 提取時(shí)間對(duì)cSJP 得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of cSJP

2.1.3 提取次數(shù)對(duì)cSJP 得率的影響 由圖3 可知，隨著提取次數(shù)的增多，cSJP 得率的增加由快變緩。當(dāng)提取次數(shù)為3 次時(shí)，cSJP 得率為3.67%，提取次數(shù)為4 次和5 次時(shí)，cSJP 得率分別為3.71%、3.73%，與提取3 次的結(jié)果均無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明繼續(xù)增加提取次數(shù)，對(duì)cSJP 得率的增加已不多，為節(jié)省提取時(shí)間，減少水資源損耗，最終確定最佳提取次數(shù)為3 次。

圖3 提取次數(shù)對(duì)cSJP 得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the yield of cSJP

2.1.4 醇沉濃度對(duì)cSJP 得率的影響 由圖4 可知，當(dāng)乙醇濃度從40%增加到60%時(shí)，cSJP 的得率顯著增加（P＜0.05），總增加值為1.09%，繼續(xù)加大醇沉濃度，cSJP 得率上升的趨勢(shì)變緩，且醇沉濃度為70%時(shí)的cSJP 得率與60%相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。在保證多糖得率并考慮成本節(jié)約的前提下，最終選擇50%、60%和70%進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

圖4 醇沉濃度對(duì)cSJP 得率的影響Fig.4 Effect of alcoholic precipitation concentration on the yield of cSJP

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取料液比（A）、提取時(shí)間（B）和醇沉濃度（C）三個(gè)因素設(shè)計(jì)出17 組實(shí)驗(yàn)，以cSJP 得率為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到的二階多項(xiàng)式回歸方程為：Y=3.98+0.034A+0.058B+0.061C-0.01AB+0.047AC-0.06BC-0.11A2-0.19B2-0.14C2。

由表3 可知，P值＜0.0001，表明該回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.6987＞0.05，表明失擬項(xiàng)不顯著；相關(guān)系數(shù)R2和校正決定系數(shù)R2（Adj）分別為0.9786 和0.9510，表明模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)值擬合度高，誤差小，具有較高的可信度[28]。由F值可知，三個(gè)因素對(duì)cSJP 得率的影響程度為：醇沉濃度（C）＞提取時(shí)間（B）＞料液比（A）。通過(guò)P值可知，B、C、A2、B2、C2都表現(xiàn)為差異極顯著水平（P＜0.01），A、AC、BC 表現(xiàn)為差異顯著水平（P＜0.05）。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results

2.2.2 各因素之間的交互作用分析 如圖5（a）所示，提取時(shí)間響應(yīng)曲面的陡峭程度大于料液比響應(yīng)曲面，表明提取時(shí)間對(duì)cSJP 得率的影響大于料液比；由圖5（b）可知，醇沉濃度對(duì)cSJP 得率的影響大于料液比[29]，與方差分析結(jié)果一致。通過(guò)3D 圖發(fā)現(xiàn)曲面呈中間凸四面凹的形狀，說(shuō)明曲面有最高點(diǎn)，也表明存在最優(yōu)條件。

圖5 各因素交互作用對(duì)cSJP 得率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots of the effects of the interaction of various factors on the cSJP yield

2.2.3 最佳工藝的預(yù)測(cè)與驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出cSJP 最佳提取條件為：料液比1:20.943 g/mL，提取時(shí)間123.411 min，醇沉濃度62.199%，槐花多糖得率的理論值為3.989%。在實(shí)際提取過(guò)程中，修正工藝條件為料液比1:20 g/mL，提取120 min，醇沉濃度60%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，多糖得率的平均值為3.94%，與預(yù)測(cè)得率相差不大，相對(duì)誤差為1.2%，說(shuō)明該模型預(yù)測(cè)槐花多糖的得率是可行的。

2.3 多糖的純化

cSJP 的高效液相色譜圖如圖6（a）所示，將cSJP脫蛋白、透析之后，再用Sephadex G-200 層析柱純化，以超純水作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每管收集3 mL多糖洗脫溶液，測(cè)定每管糖含量。洗脫曲線如圖6（b）所示，收集洗脫峰上最高處的兩管，凍干后得到單一組分槐花多糖SJP。由圖6（c）可知，SJP 僅在7.556 min處出現(xiàn)單一對(duì)稱峰，表明純化效果良好，SJP 純度較高，是一種均質(zhì)多糖[30]。

圖6 分離純化效果圖Fig.6 Results of separation and purification

2.4 SJP 的結(jié)構(gòu)表征

2.4.1 分子量測(cè)定 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=-0.3216x+8.7973，R2=0.9989，得SJP 的分子量約為2.32×106Da（Rt=7.556 min）。王麗華[14]從槐花中分離出了三種組分的多糖，其分子量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于本實(shí)驗(yàn)中所提取出的SJP，這可能與槐花的來(lái)源及提取工藝條件有關(guān)。

2.4.2 化學(xué)成分 經(jīng)測(cè)定，SJP 中的總糖含量為93.47%±0.83%（y=7.87x-0.003，R2=0.9997），蛋白質(zhì)含量為1.62%±0.13%（y=1.1253x+0.0074，R2=0.9953），糖醛酸含量為7.13%±0.51%（y=5.12x+0.0098，R2=0.9965）。

2.4.3 剛果紅實(shí)驗(yàn) 一般情況下可以通過(guò)剛果紅實(shí)驗(yàn)來(lái)確定多糖中是否含有三螺旋構(gòu)象，這是因?yàn)榫哂腥菪Y(jié)構(gòu)的多糖樣品在弱堿性條件下能與剛果紅形成絡(luò)合物，導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)（λmax）發(fā)生紅移，而在強(qiáng)堿性條件下，多糖分子之間的氫鍵被破壞，三螺旋結(jié)構(gòu)分解，造成λmax迅速下降[31]。SJP 的剛果紅實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖7 所示，不同NaOH 濃度下SJP 與剛果紅混合后λmax變化曲線與對(duì)照組剛果紅溶液的λmax變化曲線的趨勢(shì)相同，即λmax隨NaOH 濃度的增加而逐漸下降，表明SJP 中不含三股螺旋結(jié)構(gòu)?？茖W(xué)研究表明提取方法的不同會(huì)造成多糖三螺旋構(gòu)象的差異，如Gu 等[32]分別采用熱水提取法、超聲輔助提取法和亞臨界水提取法從歐洲慈姑中提取出3 種多糖（SSW、SSU、SSP），結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSU 和SSP 具有三螺旋結(jié)構(gòu)，而SSW 不具有三螺旋結(jié)構(gòu)，這可能是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的高溫萃取會(huì)導(dǎo)致氫鍵的斷裂，從而對(duì)SSW 的三螺旋結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞性影響。

圖7 不同NaOH 濃度下剛果紅與SJP 混合的λmax 變化Fig.7 Variation of λmax of the mixture of Congo red and SJP at different NaOH concentrations

2.4.4 X-射線衍射分析 XRD 作為一種闡明多糖結(jié)構(gòu)的分析技術(shù)，通常用于評(píng)估聚合物的無(wú)定形或晶體性質(zhì)。高結(jié)晶度的多糖存在尖銳的衍射峰，而結(jié)晶度較差的多糖則出現(xiàn)較寬的衍射峰。從圖8 中可以看出SJP 顯示出“包狀”的XRD 曲線，且僅在22°左右出現(xiàn)較寬的衍射峰，表明SJP 結(jié)晶度低，為無(wú)定型結(jié)構(gòu)[33]。

圖8 SJP 的X-射線衍射圖譜Fig.8 X-ray diffraction pattern of SJP

2.5 SJP 的抗氧化活性研究

2.5.1 SJP 對(duì)DPPH·的清除能力 DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，已被廣泛用于評(píng)估各種植物多糖樣品的抗氧化能力[34]。由圖9（a）可知，隨著SJP 濃度的增加，其對(duì)DPPH·的清除能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)SJP 濃度為4 mg/mL 時(shí)，DPPH·清除率為86.4%，當(dāng)濃度增至5 mg/mL 時(shí)，DPPH·的清除率為89.24%，經(jīng)計(jì)算，SJP 清除DPPH·的IC50值為1.09 mg/mL。結(jié)果表明，SJP 具有一定的DPPH 自由基清除能力，但其效果弱于VC。

圖9 不同濃度SJP 和VC 的抗氧化能力Fig.9 Antioxidant capacity of SJP and VC at different concentrations

2.5.2 SJP 對(duì)·OH 的清除能力 OH 自由基很容易與大多數(shù)生物大分子反應(yīng)并造成嚴(yán)重的氧化損傷，因此可以通過(guò)測(cè)量多糖對(duì)·OH 的清除作用來(lái)評(píng)估多糖的抗氧化活性[35]。由圖9（b）可知，SJP 的濃度越大，其對(duì)·OH 的清除能力越強(qiáng)。在0.1～5 mg/mL 的范圍內(nèi)，SJP 對(duì)·OH 的清除率由2.37%上升至63.61%，經(jīng)計(jì)算可得VC和SJP 清除·OH 的IC50值分別為0.3 和4.31 mg/mL。結(jié)果表明SJP 對(duì)·OH 的清除能力較DPPH·與ABTS+·較弱，這可能與SJP 中的糖醛酸含量較低有關(guān)[36-37]。

2.5.3 SJP 對(duì)ABTS+·的清除能力 ABTS+自由基清除作用也可以用于評(píng)估多糖的抗氧化能力[34]。由圖9（c）可知，SJP 對(duì)ABTS+·的清除率隨濃度的升高而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，VC對(duì)ABTS+·的清除率為99.85%，SJP 對(duì)ABTS+·的清除率為98.5%，其清除效果達(dá)到了VC的98.65%。經(jīng)計(jì)算可得SJP 清除ABTS+·的IC50值為1.39 mg/mL，表明SJP 對(duì)ABTS+·有較好的清除效果。

2.5.4 總還原力的測(cè)定 如圖9（d）所示，在0.1～5 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，SJP 的總還原力隨著濃度的增加呈逐漸上升的趨勢(shì)，但在同質(zhì)量濃度下始終弱于VC。當(dāng)SJP 濃度為5 mg/mL 時(shí)，其總還原力可以達(dá)到0.57。

3 結(jié)論

本文采用單因素結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了水提法提取槐花多糖的工藝條件，得出最佳組合為料液比1:20 g/mL，提取時(shí)間120 min，醇沉濃度60%，該條件下多糖的實(shí)際得率為3.94%。提取出的粗多糖經(jīng)過(guò)脫蛋白、透析和Sephadex G-200 凝膠柱層析得到純化多糖組分SJP，經(jīng)測(cè)定其分子量為2.32×106Da，總糖含量、蛋白質(zhì)含量和糖醛酸含量分別為93.47%±0.83%、1.62%±0.13%和7.13%±0.51%。剛果紅實(shí)驗(yàn)表明SJP 不含三螺旋結(jié)構(gòu)，X-射線衍射分析結(jié)果表明SJP 結(jié)晶度低，為無(wú)定型結(jié)構(gòu)?？寡趸瘜?shí)驗(yàn)結(jié)果表明SJP 具有良好的DPPH·和ABTS+·清除效果，具有開發(fā)成為抗氧化劑的潛力。本研究為槐花多糖的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)，但關(guān)于槐花多糖更深層次的結(jié)構(gòu)表征及具體的構(gòu)效關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。