響應面法優(yōu)化結(jié)球菊苣多糖的磷酸化修飾工藝

姜振浩，朱建星，張萬忠

（沈陽化工大學制藥與生物工程學院，遼寧沈陽 110142）

結(jié)球菊苣（Cichoricum intybusvar.foliosumHegi），是菊苣屬的一種多年宿根性草本植物。作為一種藥食兩用植物，紅菊苣顏色鮮艷，營養(yǎng)價值很高，既可以直接食用也有很高的藥用價值[1]。結(jié)球菊苣含有多種活性成分，其中結(jié)球菊苣多糖含量最多。菊苣多糖具有抗氧化、消炎調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、抗腫瘤、抗病毒等生物活性[2-3]。

結(jié)構(gòu)修飾可以改變多糖的分子量、取代基團類型和分子結(jié)構(gòu)，從而影響多糖的生物活性[4]。到目前為止，常見的幾種化學改性方法包括羧甲基化[5]、硫酸化[6]、硒化[7]、磷酸化[8-9]、乙?；痆10]等。磷酸化后的多糖與天然多糖比一些基團（例如羥基等）被磷酸根所取代，分子量也同時發(fā)生了改變，從而導致其多糖生物活性增強[11-13]。Lin 等[14]對川牛膝多糖磷酸化研究發(fā)現(xiàn)磷酸化修飾后提高了其免疫活性；胡曉波等[15]對桑葚多糖磷酸化修飾前后的抗氧化活性研究，實驗表明磷酸化修飾后的桑葚多糖的抗氧化活性增強。常用的磷酸化方法有三氯氧磷（POCl3）[16]、磷酸及其酸酐[17]、磷酸鹽[18]等。三氯氧磷法反應時間短、操作步驟簡單的優(yōu)點，但是氯化氧磷的使用可能會導致目標分子降解，反應過程中氫離子濃度增加，需要在反應過程中加入堿性試劑，如吡啶和三乙胺來中和，防止多糖降解[19-21]；磷酸及其酸酐或二者混合物是最早使用的磷酸化試劑，磷酸基團活性大，但是磷酸及其酸酐主要的缺點是在反應過程中容易導致糖樣降解[22]，產(chǎn)物收率不高，取代度也不理想[23-24]；磷酸鹽法是一種溫和的多糖磷酸化反應[25]，常用于多糖磷酸化修飾的磷酸鹽試劑主要有多聚磷酸鈉[26]、磷酸氫二鈉、三偏磷酸鈉[27]、磷酸二氫鈉及這些鹽的混合物[28]，磷酸鹽法制備工藝簡便、安全、經(jīng)濟效益高[29]，產(chǎn)生的副產(chǎn)物和有毒有害物較少，在工業(yè)生產(chǎn)中應用最為普及。本文選擇三聚磷酸鈉作為磷酸化試劑，反應無有機試劑參與，方便后續(xù)處理。

多糖本身具有多種生物活性，理論上磷酸化修飾能夠提高多糖抗氧化活性，隨著結(jié)構(gòu)分析方法的日漸完善，磷酸化修飾多糖有更廣泛的應用前景。截至目前，結(jié)球菊苣多糖的磷酸化尚未見報道，因此，本文以結(jié)球菊苣為原料，用復合酶法水解浸提結(jié)球菊苣多糖，通過單因素實驗確定反應時間、反應溫度、多糖與磷酸化試劑摩爾比、反應pH，從而設(shè)計響應面試驗優(yōu)化磷酸化修飾工藝條件，并且通過測定其對DPPH 自由基清除能力，來確定磷酸化結(jié)球菊苣多糖的抗氧化活性，為結(jié)球菊苣多糖及其磷酸化衍生物的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

結(jié)球菊苣 上海金山區(qū)銀龍蔬菜配送有限公司；果膠酶、纖維素酶（酶活大于15000 U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；AB-8 大孔樹脂、DEAE-52 纖維素、葡聚糖G-200/G-15 北京索萊寶公司；半水酒石酸銻鉀、鉬酸銨、濃鹽酸、氫氧化鈉、硫酸、抗壞血酸、硫酸鈉、三聚磷酸鈉等 均為分析純，天津大茂公司；DPPH 色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

UV1100 型紫外分光光度計 上海天美公司；Synergy2 多功能酶標儀 美國伯騰公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城公司；MRS 微波消解儀 美國CEM 公司；RE-6000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮公司；GT2 型凍干機 德國SRK 公司；Vector22 型傅立葉變換紅外光譜 美國尼高力公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結(jié)球菊苣多糖的制備 采用復合酶法對結(jié)球菊苣多糖進行水解浸提。取50 g 干燥后的結(jié)球菊苣粉末，加入復合酶（纖維素酶0.1 g，果膠酶0.025 g），按料液比1:30 于55 ℃條件下，搖床振蕩2 h，85 ℃滅酶10 min，將滅酶后反應液抽濾除去沉淀，收集上清液。Sevage 法脫蛋白、AB-8 大孔樹脂脫色后，以蒸餾水為洗脫溶劑用纖維素DEAE-52、葡聚糖G-200 除雜，經(jīng)冷凍干燥后得結(jié)球菊苣多糖。

1.2.2 磷含量測定 有關(guān)磷含量測定參考《水質(zhì)總磷的測定鉬酸銨分光光度法》（GB 11893-1989）中的方法來進行，并按照該實驗略微修改。

磷標準曲線的制作：分別取25 mL 的去離子水以及等梯度濃度的磷標準液（0.24、0.48、0.72、0.96、1.2 mg/L）在150 ℃下微波消解15 min，待冷卻后用50 mL 容量瓶加水定容，將全部的定容液放入50 mL錐形瓶中依次加入10%的抗壞血酸溶液1 mL，半分鐘后加入鉬酸鹽溶液2 mL 混勻之后室溫放置15 min后，測定在700 nm 的吸光值。以吸光度為縱坐標，磷酸根濃度為橫坐標，得到磷含量標準曲線。y=0.0035+0.07112x，R2=0.9981。

0.2 g 的結(jié)球菊苣多糖跟13 mL 的去離子水，加入50 mg 硫酸鈉混勻，再加入2 mL 的0.1 g/mL 的三聚磷酸鈉，用1 mol/L 的HCl 或者1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 到7，80 ℃反應3 h 之后，用預處理后的SepHadex G-15 凝膠柱以蒸餾水為洗脫溶劑除鹽，冷凍干燥。

總磷含量的測定：取冷凍干燥的磷酸化多糖樣品1 mg 加去離子水定容至10 mL，從中取出1 mL的稀釋液，用去離子水定容到25 mL，在150 ℃下微波消解15 min，冷卻后加水定容到50 mL，加入10%的抗壞血酸溶液1 mL，30 s 后加入鉬酸鹽溶液2 mL混勻室溫放置15 min，測定在700 nm 處的吸光值。

游離磷含量的測定：取冷凍干燥的磷酸化多糖樣品1 mg 加水定容至50 mL，依次加入10%的抗壞血酸溶液1 mL，30 s 后加入鉬酸鹽溶液2 mL 混勻之后室溫放置15 min 后，測定在700 nm 處的吸光值。

采用上述測定方法，對冷凍干燥的磷酸化多糖樣品磷含量進行測量和計算，以樣品中的磷含量作為反應結(jié)果的衡量標準，計算公式如下：

1.2.3 結(jié)球菊苣多糖磷酸化單因素實驗

1.2.3.1 反應時間對磷酸化修飾效果的影響 取5 個錐形瓶分別加0.2 g 的結(jié)球菊苣多糖跟13 mL的去離子水，加入50 mg 硫酸鈉混勻，再加入2 mL 0.1 g/mL 的三聚磷酸鈉水溶液（結(jié)球菊苣多糖與三聚磷酸鈉的摩爾比為1:10），調(diào)pH 到7，在80 ℃反應2、3、4、5、6 h 后取出冷卻，用預處理后的Sep-Hadex G-15 凝膠柱以蒸餾水為洗脫溶劑除鹽，冷凍干燥，測定樣品總磷和游離磷含量。

1.2.3.2 反應溫度對磷酸化的影響 取5 個錐形瓶分別加0.2 g 的結(jié)球菊苣多糖跟13 mL 的去離子水，加入50 mg 硫酸鈉混勻，再加入2 mL 0.1 g/mL 的三聚磷酸鈉水溶液，調(diào)pH 到7，分別在60、70、80、90、95 ℃條件下反應3 h 后取出冷卻，用預處理后的SepHadex G-15 凝膠柱以蒸餾水為洗脫溶劑除鹽，冷凍干燥，測定樣品總磷和游離磷含量。

1.2.3.3 pH 對磷酸化的影響 取5 個錐形瓶分別加0.2 g 的結(jié)球菊苣多糖跟13 mL 的去離子水，加入50 mg 硫酸鈉混勻，再加入2 mL 0.1 g/mL 的三聚磷酸鈉水溶液，分別調(diào)pH 到4、6、7、8、9，在80 ℃條件下反應3 h 后取出冷卻，用預處理后的Sep-Hadex G-15 凝膠柱以蒸餾水為洗脫溶劑除鹽，冷凍干燥，測定樣品總磷和游離磷含量。

1.2.3.4 多糖與磷酸化試劑摩爾比對磷酸化的影響

取5 個錐形瓶分別加0.2 g 的結(jié)球菊苣多糖及13 mL 的去離子水，加入50 mg 硫酸鈉混勻，分別加入1.2、1.6、2、2.4、2.8 mL 的0.1 g/mL 三聚磷酸鈉水溶液（獲得多糖與磷酸化試劑摩爾比1:6、1:8、1:10、1:12、1:14），調(diào)pH 到7，在80 ℃條件下反應3 h 后取出冷卻，用預處理后的SepHadex G-15 凝膠柱以蒸餾水為洗脫溶劑除鹽，冷凍干燥，測量樣品總磷和游離磷含量。

1.2.4 結(jié)球菊苣多糖磷酸化響應面法優(yōu)化工藝條件

在單因素實驗基礎(chǔ)上，以磷酸化結(jié)球菊苣多糖磷含量為考察指標，對反應時間（A）、反應溫度（B）、反應pH（C）、多糖與磷酸化試劑摩爾比（D）進行響應面優(yōu)化。采用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計響應面試驗（見表1），選用Box-Behnken design（BBD）模型，以磷酸化產(chǎn)物中磷含量為響應值，做4 因素3 水平二次回歸正交組合試驗。

表1 響應面因素與水平表Table 1 Response Surface Factors and Levels

1.2.5 磷酸化結(jié)球菊苣多糖的傅里葉紅外光譜的測定 將冷凍干燥的磷酸化結(jié)球菊苣多糖與KBr 混合均勻、壓片，在波數(shù)400～4000 cm-1進行紅外光譜掃描，將磷酸化反應前后的紅外光譜變化進行比較。

1.2.6 DPPH 自由基清除能力試驗 用無水乙醇在100 mL 容量瓶中配制濃度為0.5 mmol/l 的DPPH-乙醇溶液，放冰箱保存?zhèn)溆谩⒖箟难崤c純化后的磷酸化前后結(jié)球菊苣多糖溶液用水分別稀釋到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/mL，取1 ml 的DPPH 乙醇溶液，分別向其中加入1 mL 不同質(zhì)量濃度的抗壞血酸與磷酸化前后結(jié)球菊苣多糖溶液，在室溫下避光靜置30 min，在波長517 nm 處測定吸光度（A樣品）。再用乙醇代替DPPH-乙醇溶液作為對照組測定吸光度（A對照）；用蒸餾水代替待測樣品做空白組，測定吸光度（A空白）。DPPH 自由基清除率計算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗所有實驗數(shù)據(jù)均重復測定三次，結(jié)果取平均值。采用SPSS Statistics 26 和Origin 2021 軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖及顯著性分析（P＜0.05），采用Design-Expert 8.0 軟件設(shè)計響應面實驗并對數(shù)據(jù)進行回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 反應時間對磷酸化的影響 以結(jié)球菊苣多糖磷含量作為指標，來確定磷酸化修飾程度，磷含量越高表示磷酸根基團的接枝率越高，即磷酸化修飾程度越高[29]。反應時間對磷含量的影響見圖1，由圖1 可以看出，隨著反應時間的進行磷含量呈先增大后減少的變化趨勢，在2～3 h 范圍內(nèi)時，多糖修飾樣品中的磷含量隨著時間的延長而逐漸增加，當反應3 h 時，磷含量達到最大值（4.57%），在3～6 h 范圍內(nèi)，隨著時間的增加磷含量呈下降趨勢。在對多糖進行磷酸化反應時，時間太短磷酸化反應不完全，磷的取代度較低，但是長時間的高溫反應又會使多糖結(jié)構(gòu)破壞，降低磷酸化多糖的取代度，所以多糖修飾樣品中的磷含量會一開始隨著時間的增加而增加，在到達一定時間后又會隨著時間的增加而降低[30]。

圖1 反應時間對磷含量的影響Fig.1 Effect of reaction time on phosphorus content

2.1.2 反應溫度對磷酸化的影響 反應溫度對磷含量的影響見圖2，由圖2 可以看出在60～80 ℃時，隨著溫度的提高多糖修飾樣品中的磷含量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，當溫度為80 ℃到達最大值（4.58%），在80～95 ℃時，磷含量隨溫度的提高呈減少的趨勢。在對多糖磷酸化修飾時，溫度較低磷酸化的反應緩慢，磷的取代度較低，隨著溫度的升高，接枝量提高?？赡苁且驗闇囟壬撸苟嗵欠肿拥姆磻钚栽鰪姡姿狨セ某潭纫搽S之增加，當溫度進一步升高時，由于過高的溫度導致多糖結(jié)構(gòu)的破壞，從而磷含量降低[30]。

圖2 反應溫度對磷含量的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on phosphorus content

2.1.3 pH 對磷酸化的影響 pH 對磷含量的影響見圖3，由圖3 可以看出在pH 為4～7 時，隨pH 的增加多糖修飾樣品中的磷含量呈上升的趨勢，當pH為7 時到達最大值（4.56%），在pH 為7～9 時，隨pH的增加多糖修飾樣品中的磷含量呈下降的趨勢。在磷酸化多糖時過酸或者過堿都會造成接枝率降低，原因可能是三聚磷酸鈉在較低的pH 下不穩(wěn)定，會分解成活性較低的焦磷酸鈉和正磷酸鈉，而pH 過高會導致磷酸酯化的逆反應增強，使磷酸根水解降低接枝率。只有在合適的pH 下，才有比較高的磷酸根取代度[30]。

圖3 pH 對磷含量的影響Fig.3 Effect of pH on phosphorus content

2.1.4 多糖與磷酸化試劑摩爾比對磷酸化的影響多糖與磷酸化試劑摩爾比對磷含量的影響見圖4，由圖4 可以看出在摩爾比1:6～1:10 時，隨著磷酸鹽的增加樣品中的磷含量呈上升趨勢，當多糖與磷酸化試劑摩爾比為1:10 時到達最大值（4.48%），進一步增加摩爾比磷含量趨于穩(wěn)定不再增加。在一定范圍內(nèi)，反應所需磷酸根未達到飽和，菊苣多糖結(jié)合磷的含量隨磷酸鹽的量增加而增加，而當摩爾比達到1:10 時，磷酸根維持平衡，這可能是因為磷酸鹽多于反應所需，多糖結(jié)合的磷酸根已達到飽和[30]。

圖4 多糖與磷酸化試劑摩爾比對磷含量的影響Fig.4 Effect of polysaccharides and phosphorylation reagents molar ratio on phosphorus content

2.2 結(jié)球菊苣多糖磷酸化工藝優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，對結(jié)球菊苣多糖磷酸化工藝條件進行優(yōu)化，用Design Expert 8.0 軟件設(shè)計4 因素3 水平的二次回歸響應面，得到試驗數(shù)據(jù)，磷酸化結(jié)球菊苣多糖響應面試驗設(shè)計及響應值見表2，并作回歸模型方差和顯著性分析，結(jié)果見表3。

表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

對試驗結(jié)果進行二次回歸分析，計算得到回歸方程：Y=4.57+0.16A+0.1B+0.19C+0.13D+0.018AB-0.015AC+0.3AD-0.012BC+0.05BD+0.1CD-0.3A2-0.9B2-0.82C2-0.86D2。由表3 可以得出，總決定系數(shù)R2=0.9538，表明此模型擬合良好，實驗值與預測值之間的差異很小，校正系數(shù)R2Adj=0.9077，表明此模型可以解釋90.77%的響應值；此模型的P＜0.0001，失擬項P=0.7180，說明回歸方程理想，模型顯著。綜上所述，該模型可用于分析和預測磷酸化修飾結(jié)球菊苣多糖的工藝優(yōu)化。

2.2.2 響應面試驗的交互作用分析 根據(jù)表3 的數(shù)據(jù)可以得到，分別將模型中的兩個因素固定在中間水平，得到另外兩個因素交互作用對磷含量的子模型并根據(jù)模型繪制三維曲面圖，見圖5。

圖5 時間與摩爾比的交互作用對磷含量的影響Fig.5 Effect of time and molar ratio interaction on phosphate content

由圖5 可知，響應面交互圖呈降落傘狀，響應面交互圖坡度越大表明磷含量的變化越快，即更為顯著。這說明多糖與磷酸化試劑的摩爾比、反應時間之間的交互性對磷含量有明顯的影響。

2.2.3 模型的優(yōu)化及驗證實驗 通過Design Expert軟件對試驗進行優(yōu)化，按照回歸模型預測可得到結(jié)球菊苣多糖磷酸化的最佳工藝條件為：反應時間3.34 h，反應溫度80.62 ℃，多糖與磷酸化試劑的摩爾比1:10.29 和反應pH7.12，在此反應條件下結(jié)球菊苣多糖磷含量為4.62%。為驗證此結(jié)果的可靠性，進行三次平行試驗，根據(jù)實際情況修正工藝條件為：反應時間3.3 h，反應溫度81 ℃，多糖與磷酸化試劑摩爾比1:10，調(diào)整反應pH 為7.1，測得多糖磷含量平均值為4.75%，該值與模型預測值接近，驗證了該模型的可靠性。

2.3 磷酸化前后結(jié)球菊苣多糖的紅外光譜分析

由圖6 可以看出該吸收峰為典型的多糖吸收峰，并且磷酸化前后峰型未發(fā)生較大變化，說明多糖的主體結(jié)構(gòu)沒有變化。磷酸化結(jié)球菊苣多糖和結(jié)球菊苣多糖在3409 cm-1附近處的吸收峰為-OH 的伸縮振動吸收峰，表明磷酸化結(jié)球菊苣多糖和結(jié)球菊苣多糖中含有分子內(nèi)氫鍵；2925、1435 cm-1附近處為C-H 的伸縮振動吸收峰，為糖類的特征吸收峰；其中1651 cm-1附近處的吸收峰是羰基C=O 鍵的吸收峰。除此之外，磷酸化結(jié)球菊苣多糖在1235 cm-1處的吸收峰為P=O 鍵的伸縮振動吸收峰，973 cm-1處的吸收峰為P-O-C 鍵的吸收峰，這兩個峰的出現(xiàn)表明有磷酸基團接入[15]。綜上，磷酸化修飾結(jié)球菊苣多糖成功，所得產(chǎn)物為磷酸化結(jié)球菊苣多糖。

圖6 結(jié)球菊苣多糖與磷酸化結(jié)球菊苣多糖的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum absorption diagram of chicory polysaccharides and phosphorylated red chicory polysaccharides

2.4 磷酸化結(jié)球菊苣多糖DPPH 自由基清除能力分析

由圖7 可知，磷酸化結(jié)球菊苣多糖在一定濃度范圍內(nèi)，濃度與清除率呈現(xiàn)量效關(guān)系，并且濃度越高，多糖對DPPH 自由基的清除率越高。在濃度為4 mg/mL 時，磷酸化結(jié)球菊苣多糖和結(jié)球菊苣多糖的清除率分別為56.36%、45.08%，磷酸化結(jié)球菊苣多糖較結(jié)球菊苣多糖的清除率提高了11.28%，說明磷酸化修飾提高了結(jié)球菊苣多糖清除DPPH 自由基的能力[26]。多糖的抗氧化活性是因其含有羥基等還原性基團，結(jié)球菊苣多糖經(jīng)過磷酸化修飾后其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，從而影響了結(jié)球菊苣多糖的抗氧化活性。但目前磷酸化結(jié)球菊苣多糖的抗氧化作用機理還不明確，仍需進一步探討研究。

圖7 磷酸化結(jié)球菊苣多糖的DPPH 自由基清除率Fig.7 DPPH radical scavenging rate of phosphorylated chicory polysaccharide

3 結(jié)論

通過單因素與響應面試驗優(yōu)化后，得到磷酸化修飾結(jié)球菊苣多糖的最優(yōu)工藝參數(shù)，在最優(yōu)工藝參數(shù)下制備的磷酸化結(jié)球菊苣多糖中磷含量為4.75%±0.04%，與模型預期值4.62%接近。紅外光譜顯示結(jié)球菊苣多糖成功引入了磷酸根基團，說明磷酸化修飾成功。抗氧化活性試驗結(jié)果表明，磷酸化結(jié)球菊苣多糖較結(jié)球菊苣多糖具有更強的抗氧化活性，在磷酸化結(jié)球菊苣多糖濃度為4 mg/mL 時，對DPPH 自由基的清除率為56.36%，說明通過磷酸化修飾的方法能夠提高結(jié)球菊苣多糖的抗氧化活性，磷酸化結(jié)球菊苣多糖在食品工業(yè)中具有作為新型食品添加劑和抗氧化劑的潛力。后續(xù)可進一步考察磷酸化結(jié)球菊苣多糖的抗腫瘤活性、抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性等更多生物活性，擴展磷酸化結(jié)球菊苣多糖在食品藥品領(lǐng)域的開發(fā)與利用。