岳子堯,董力源,李 戀,2,滿都拉,孫子羽,陳忠軍,*
(1.內蒙古農業(yè)大學食品科學與工程學院,內蒙古呼和浩特 010018;2.內蒙古醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院,內蒙古呼和浩特 010107)
乳酸菌是日常生活中人們較為熟悉的菌種,不論是酸奶、泡菜還是各類飲品都有其參與發(fā)酵,并且在自然界中分布廣泛。乳酸菌在幫助腸道蠕動、促進消化的同時,可以降低膽固醇吸收,調節(jié)免疫系統(tǒng),使乳糖不耐受的癥狀得到緩解[1-3]。目前已被證實某些乳酸菌能夠產生抗菌肽,除抑制細菌、真菌外,還能對癌細胞產生滅殺作用[4-5]。乳酸菌抗菌肽因其生物安全性及抑菌活性在食品加工保藏、飼料生產、及醫(yī)藥領域已有較成功應用[6]。自乳鏈球菌素Nisin 和片球菌素Pediocins PA1 被批準作為食品防腐劑以來[4],新型乳酸菌抗菌肽已成為最主要研究熱點和重要資源。因此,新型乳酸菌抗菌肽資源的開發(fā)挖掘勢在必行。
真菌污染是食品、飼料、醫(yī)療及環(huán)境領域最廣泛的污染類別,不僅給生產帶來明顯經濟損失,而且真菌毒素直接危害人類健康[7]?,F有化學防霉劑的大量使用導致致腐霉菌和酵母耐藥性增加,采用天然生物防霉劑代替化學防腐劑勢在必行[8-9]。由于抗真菌肽提取成本過高,目前商業(yè)化乳酸菌防霉產品幾乎全部采用了活菌劑型或無細胞提取物。
乳酸菌抗菌肽的生物合成發(fā)生在對數生長期,一般分泌到細胞外,但在特殊條件下會留在細胞內,導致抑菌活性降低。有研究表明,乳酸菌的培養(yǎng)基內主要營養(yǎng)物質改變后,其產生抗菌肽抑菌活性就會發(fā)生改變[10-12]。影響乳酸菌抑菌活性的主要因素除了培養(yǎng)基外還有菌株生長的環(huán)境與營養(yǎng)條件。封成玲等[13]采用單因素與正交試驗對產酶溶桿菌L-43 的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,使抗菌肽產量進一步得到了提高。江晨等[14]采用單因素實驗和響應面試驗對花生抗菌肽復合物的工藝進行了優(yōu)化,研究發(fā)現制備的花生抗菌肽復合物可以提高對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和米曲霉的抑菌效果。秦楠等[15]采用單因素實驗和響應面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌HRH317 菌株產抗菌肽的發(fā)酵條件。Amiri 等[16]對嗜酸乳桿菌LA-5、乳酸芽孢桿菌BB-12 生物生產抗菌肽及其混合培養(yǎng)物的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等進行優(yōu)化,從而增強了對單核細胞增生李斯特菌的抑制活性。目前雖對于乳酸菌產抗菌肽的發(fā)酵條件做了大量研究,但是大多針對具有抑制細菌作用的抗菌肽,而對于抑真菌肽研究很少。
本課題組前期從內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離出副干酪乳桿菌ALAC,發(fā)現其分泌的抗真菌肽對常見食品致腐霉菌和酵母具有強烈抑制活性,且安全無毒[17-18]。本研究將菌株ALAC 在前期優(yōu)化的乳清培養(yǎng)基中發(fā)酵,通過單因素實驗與響應面分析探究接種量、培養(yǎng)基初始pH、發(fā)酵時間及發(fā)酵溫度對其產抗真菌肽的影響,并確定最佳發(fā)酵工藝,為后期制備無細胞提取物生產抗真菌肽粉奠定基礎。
副干酪乳桿菌ALAC 本實驗室保存;指示菌白假絲酵母(Candida albicans) 編號為32819,來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;乳清粉 浙江一諾生物科技有限公司;牛肉膏、酵母膏、細菌學蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取粉 廣東環(huán)凱維生物科技有限公司;氯化鈉、檸檬酸氫二胺、磷酸氫二鉀、硫酸錳、瓊脂粉、硫酸銨、TWEEN80、硫酸鎂、蔗糖、磷酸氫二鉀 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙酸鈉、葡萄糖 天津市大茂化學試劑廠;酶水解酪蛋白 北京酷來博科技有限公司;所用試劑均為分析純。
HZQ-F100 型全溫震蕩培養(yǎng)箱 蘇州培英實驗設備有限公司;H3018DR 型高速冷凍離心機 上海知信實驗儀器技術有限公司;DHG-9053A 型電熱鼓風干燥箱、HZQ-311C 型落地振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;JM-A6002 型電子天平 諸暨市超澤衡器設備有限公司;SW-CJ-2FD 型雙人單面垂直凈化工作臺 哈爾濱市東聯(lián)公司;XH-C 型漩渦混勻器 常州未來儀器制造有限公司;IKARV10digital型旋轉蒸發(fā)儀 廣州儀科實驗室技術有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;P0-1000 型單道移液器 梅特勒-托利多儀器有限公司;LDZX-75KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠;SYNERGY H1 型酶標儀雷康恒泰商貿有限公司;MCCWS 乳成分分析儀Milkotronic 有限公司。
1.2.1 培養(yǎng)基的配制 MRS 培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、Tween 80 1 mL/L、酵母提取粉5 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸錳0.25 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、硫酸鎂0.58 g/L、無水乙酸鈉5 g/L、磷酸氫二氨2 g/L、檸檬酸氫二銨2 g/L、牛肉浸膏10 g /L、細菌學蛋白胨10 g/L,調節(jié)pH 至6.5,121 °C 滅菌20 min。
YEPD 液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L,調節(jié)pH 至6.0,121 ℃滅菌20 min。
YEPD 固體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L、大豆蛋白胨20 g/L、酵母提取粉10 g/L,瓊脂粉15 g/L,調節(jié)pH 至6.0,121 ℃滅菌20 min。
水瓊脂固體培養(yǎng)基:瓊脂粉15 g/L,121 °C 滅菌20 min。
乳清培養(yǎng)基:乳清液100 g/L、酶水解酪素5 g/L、葡萄糖1 g/L、酵母提取粉2 g/L。
1.2.2 乳桿菌ALAC 的活化 將斜面保存的乳桿菌ALAC 按4%接種量接種于MRS 液體培養(yǎng)基中,180 r/min,37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,活化至三代后備用。
1.2.3 指示菌(白假絲酵母)的活化 將斜面保存的白假絲酵母菌按4%接種量接種于YEPD 液體培養(yǎng)基中,180 r/min,30 ℃條件下48 h,活化至三代后備用。
1.2.4 指示菌菌懸液制備 將活化三代的白假絲酵母稀釋,將0.1 mL 菌液吸入0.9 mL 生理鹽水的無菌EP 管中,混合均勻,重復操作,稀釋至10-6倍備用。
1.2.5 乳清培養(yǎng)基中乳清液的制備 將100 g 乳清粉加入1 L、90 ℃蒸餾水中(先加熱水,再加乳清粉以防糊狀)。用0.1 mol/L 鹽酸溶液把以上溶液pH調成4.5,90 ℃恒溫水浴30 min,使酪蛋白凝結沉淀成塊。用脫脂棉、紗布過濾,然后用1 mol/L 氫氧化鈉溶液將濾后乳清液的pH 調成6.5,煮沸后進行抽濾,115 ℃滅菌20 min 后4 ℃冷藏備用。
1.2.6 乳桿菌抗真菌肽發(fā)酵液的處理 將活化至三代的乳酸菌ALAC 按4%接種量分別接種到乳清培養(yǎng)基中,在180 r/min 條件下培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液離心分離去除菌體及沉淀(8000 r/min,20 min,4 ℃),取上清液在50 ℃、0.075 MPa 條件下濃縮至10%。
1.2.7 單因素實驗
1.2.7.1 菌株接種量對乳酸菌產抑菌活性物質的影響 將乳桿菌ALAC 分別按1%、2%、3%、4%、5%的接種量接入乳清培養(yǎng)基,37 ℃下培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液離心分離濃縮后進行抑菌試驗。
1.2.7.2 發(fā)酵時間對乳酸菌產抑菌活性物質的影響
將乳桿菌ALAC 按4%的接種量接入培養(yǎng)基,37 ℃下分別培養(yǎng)18、24、30、32、36、42 h,同上處理后進行抑菌試驗。
1.2.7.3 發(fā)酵溫度對乳酸菌產抑菌活性物質的影響
將乳桿菌ALAC 按4%接種量接入乳清培養(yǎng)基,分別在27、32、37、42、47 ℃下培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液同上處理后進行抑菌試驗。
1.2.7.4 培養(yǎng)基初始pH 對乳酸菌產抑菌活性物質的影響 將乳桿菌ALAC 按4%接種量接入乳清培養(yǎng)基,分別調節(jié)pH 到6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,37 ℃下培養(yǎng)24 h,發(fā)酵液同上處理后進行抑菌試驗。
1.2.8 響應面試驗 由單因素實驗得出最佳發(fā)酵條件后,結合試驗結果,選取對抑菌圈影響較大的3 個因素,培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度,利用響應面分析法進行優(yōu)化設計。以各因最優(yōu)取值為中心,上下區(qū)域各取1 個水平值作為響應面試驗設計水平見表1。通過發(fā)酵濃縮液的抑菌圈大小作為評價指標,設計三因素三水平17 個試驗點的響應面試驗,其中零點實驗重復5 次,采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件對實驗結果進行響應面回歸分析。
表1 Box-Behnken 試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken
1.2.9 牛津杯法檢測抑菌性 配制水瓊脂及YEPD培養(yǎng)基,滅菌備用。將水瓊脂加熱融化,取15 mL 倒入培養(yǎng)皿中,凝固后在固體瓊脂上放置三只牛津杯(呈正三角形形狀)。將稀釋后的白假絲酵母按4%比例接入35 ℃左右25 ml YEPD 培養(yǎng)基中,將其倒入已凝固的瓊脂培養(yǎng)基待凝固。凝固后培養(yǎng)皿呈明顯兩層狀態(tài),遂取出牛津杯,在孔洞中加入200 μL 發(fā)酵濃縮液,37 ℃培養(yǎng)24 h 觀察結果。每組試驗進行三次,計算平均值??梢酝ㄟ^比較抑菌圈大?。ò=虮闹睆? mm)來反應其抑菌性強弱。
1.2.10 抗菌肽粗提粉的品質分析 抗菌肽發(fā)酵液粗提粉制備,將濃縮至10%的發(fā)酵粗提液進行冷凍干燥,36 h 后取出研磨成均勻粉末4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
理化指標測定:將抗菌肽粗提粉添加10 倍的蒸餾水溶解均勻,通過乳成分分析儀進行蛋白質、乳糖、脂肪理化指標測定。水分含量測定根據GB 5009.3-2016 中的直接干燥法測定??咕拇痔岱畚⑸镏笜藱z測,菌落總數測定方法參考GB 4789.2-2016。大腸菌群數測定方法參考GB 4789.3-2016。致病菌(志賀氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌)測定方法參考GB 4789.10-2016。
所有實驗進行3 次重復,采用SPSS 19.0 軟件統(tǒng)計處理數據,采用Design-Expert 8.0.6 統(tǒng)計軟件進行響應面分析,采用Originpro 2019,excle 2016 軟件作圖。
2.1.1 接種量對菌株產抗菌肽的影響 通過前期研究結果發(fā)現試驗菌株對大多數霉菌和酵母具有抑菌性,尤其對白假絲酵母具有極強抑菌性,且白假絲酵母為食品中常見的致病致腐酵母,故將其作為指示菌來測定乳桿菌產抑菌活性物質的抑菌效果。通過研究不同接種量對乳桿菌產抑菌活性物質的影響(圖1),發(fā)現接種量對菌株抑菌效果有顯著影響(P<0.05),隨著接種量的增加,抑菌圈直徑迅速增大,在接種量為4%條件下發(fā)酵液的抑菌圈直徑達到峰值16.47 mm,再繼續(xù)增大接種量抑菌圈直徑減小。據研究表明,細菌素合成在對數期,一定程度加大接種量會加速菌種生長,快速到達對數期,從而加速合成細菌素,使抑菌活性增強[19]。從圖1 中可以看出當接種量高于4%時抑菌圈直徑有明顯的下降趨勢,可能是由于乳酸菌發(fā)酵過程中,一定的空間內微生物數量增加會引起生存空間和營養(yǎng)物質的爭奪,因而造成菌株生長情況下降,抗菌物質合成受阻,抑菌圈直徑變小。也可能是接種量過大,縮短合成時間,產量有很大程度的下降,抗菌肽的活性也會降低,這可能也與細菌素吸附到產生菌菌體表面有關[20]。
圖1 接種量對抑菌效果的影響Fig.1 Effect of inoculum on antibacterial efficacy
2.1.2 發(fā)酵時間對菌株產抗菌肽的影響 由圖2 所示,發(fā)酵時間對抑菌效果有顯著影響(P<0.05),抑菌圈直徑隨發(fā)酵時間的延長先迅速增高,在24 h 達到峰值16.78 mm,后隨著發(fā)酵時間增長發(fā)酵液抑菌活性呈逐漸下降趨勢。通常來說,抗菌肽在對數生長前期開始合成,在指數生長末期或穩(wěn)定前期達到最大量[21]。副干酪乳桿菌ALAC 的對數生長期為18~30 h[22],生長24 h 時乳桿菌正處于對數生長期中期,產生的抑菌物質活性最強,菌株抑菌活性與生長曲線變化基本一致,這與王瑤等[23]研究發(fā)現相符,即植物乳桿菌LPL-1 菌株的細菌素產量與生長曲線有一致性。隨著發(fā)酵時間延長但抑菌活性逐漸降低,這可能是菌體進入衰亡期,合成抗菌肽能力減弱導致抗菌活性下降。
圖2 發(fā)酵時間對抑菌效果的影響Fig.2 Effect of fermentation time on antibacterial efficacy
2.1.3 發(fā)酵溫度對菌株產抗菌肽的影響 研究不同的發(fā)酵溫度對菌株合成抗菌肽的影響,結果發(fā)現(圖3)隨著發(fā)酵溫度的增長,抑菌圈直徑呈現先增大后減小的趨勢,在37 ℃達到峰值16.93 mm,超過37 ℃后抑菌圈直徑大幅降低。Ogunbanwo 等[24]研究發(fā)現30 ℃時最有利于植物乳桿菌產細菌素,這與本研究結果不同,說明不同菌株產抗菌肽的最適發(fā)酵溫度不同,這與抗菌肽的合成機制有關[25],也有可能該菌株抗菌物質代謝途徑受到阻礙導致抑菌活性下降。
圖3 發(fā)酵溫度對抑菌效果的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on antibacterial efficacy
2.1.4 初始pH 對菌株產抗菌肽的影響 培養(yǎng)基初始pH 在5.5~7.0 范圍內時(圖4),抑菌圈直徑不斷增加,在pH 為7 時抑菌圈直徑達到峰值17.1 mm,隨后抑菌圈直徑下降。研究表明乳酸菌的最適生長pH 與細菌素合成的最適pH 可能不相同[26]。乳桿菌最適生長pH 在5.5~6.0 左右,但在酸性條件下抗菌肽的轉錄翻譯過程受阻,導致抑菌活性低;也可能是菌體細胞在不同pH 條件下對抗菌肽的吸附能力不同[27],不利于代謝生成抑菌物質。在培養(yǎng)基初始pH為7.0 時盡管菌體生長未處于最佳狀態(tài),但此時生成的抑菌物質活性最強。
圖4 初始pH 對抑菌效果的影響Fig.4 Effect of initial pH on antibacterial efficacy
2.2.1 響應面試驗設計及結果 在單因素實驗的基礎上,選取A 接種量、B 發(fā)酵時間、C 初始pH 3 個因素,采用三因素三水平的響應面分析試驗對乳桿菌ALAC 培養(yǎng)基發(fā)酵條件優(yōu)化。利用Design-Expert8.0.6 軟件進行試驗設計、數據處理及模型的建立。試驗結果與分析見表2。
表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken
將得到的實驗結果用Design-Expert10.0.7 軟件對所得試驗數據進行二次多項式回歸擬合,得到抑菌圈直徑與各因素變量的二次回歸方程如下:Y=17.10-0.31A-0.075B-0.44C+0.22AB-0.25AC+0.075BC-1.80A2-1.88B2-1.85C2,此方程試驗方差分析見表3。
表3 Box-Behnken 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for Box-Behnken regression model
由表3 可知,模型決定系數R2為0.9688,說明抑菌圈直徑的實際值與預測值擬合較好,96.88%的抑菌圈直徑大小變化可用此回歸方程模型來解釋,可以較好的反映出抑菌圈直徑與接種量、發(fā)酵時間和初始pH 之間的關系。調整決定系數R2Adj為0.9287,說明92.87%實驗數據的變異性可用該方程解釋且抑菌圈大小由92.87%受實驗因素影響。該模型的P值<0.01,具有顯著性,失擬項P值0.9674>0.05,表明失擬項不顯著,模型擬合度好,能較好的反映響應面的變化,描述本實驗結果。綜上所述,以抑菌圈直徑為響應值建立的乳酸菌最佳發(fā)酵工藝模型,可對不同發(fā)酵條件下乳酸菌抑菌能力進行分析和預測。對回歸模型進行顯著性檢驗可知,A2、B2、C2抑菌圈直徑大小的影響極顯著(P<0.01),C 對抑菌圈直徑大小的影響顯著(P<0.05)。根據表中F值可知,各因素對抑菌圈大小影響程度為C>A>B,即:初始pH>接種量>發(fā)酵時間。
2.2.2 響應面交互效應分析 圖5 是接種量和發(fā)酵時間影響抑菌活性的響應面圖。從圖中可以看出當初始pH 不變,發(fā)酵時間處于最值時,隨著接種量的增加,抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢;接種量處于最值時,隨著發(fā)酵時間增加,抑菌圈大小呈現出相同趨勢。發(fā)酵時間與接種量的曲面較陡,對抑菌活性影響顯著。
圖5 接種量和發(fā)酵時間對抑菌活性影響的響應面圖Fig.5 Response surface diagram of the effect of inoculation amount and fermentation time on antibacterial activity
從圖6 可以看出,當發(fā)酵時間不變,接種量處于最值時,隨著初始pH 的增加,抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢;初始pH 處于最值,隨著接種量的增加,抑菌圈大小呈相同趨勢。接種量與初始pH 的曲面較陡,對抑菌活性影響顯著。
圖6 接種量和初始pH 對抑菌活性影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of inoculation amount and initial pH on antibacterial activity
圖7 是發(fā)酵時間和初始pH 影響抑菌活性的響應面圖。當接種量固定,發(fā)酵時間處于最值時,隨著初始pH 的增加,抑菌圈直徑呈先增加后下降趨勢;初始pH 處于最值時,隨著發(fā)酵時間增加,抑菌圈大小呈相同趨勢。代表初始pH 的響應曲面坡度較陡,說明初始pH 的變化對抑菌活性的影響比發(fā)酵時間對其影響大。
圖7 發(fā)酵時間和初始pH 對抑菌活性影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the effect of fermentation time and initial pH on antibacterial activity
2.2.3 工藝條件驗證實驗 根據抑菌圈直徑大小模型的二次回歸方程,利用 Design-Expert 8.0.6 軟件對乳酸菌發(fā)酵條件工藝參數進行優(yōu)化,得到最優(yōu)參數為接種量3.907%、發(fā)酵時間23.706 h、初始pH 為6.946,在此條件下抑菌圈直徑為17.143 mm。為驗證響應面優(yōu)化的可行性,在此最佳條件下進行乳酸菌最優(yōu)發(fā)酵條件的驗證試驗,同時考慮實際操作可行性,調整參數為接種量4%、發(fā)酵時間24 h、初始pH 為7.0,進行3 次平行試驗,得到抑菌圈直徑平均值為17.33±0.17 mm,與理論值較為接近。說明采用響應面法對乳酸菌發(fā)酵工藝參數優(yōu)化得出的結果可靠,具有實用價值。
采用本實驗優(yōu)化的最佳發(fā)酵工藝制得發(fā)酵粗提液,經過濃縮蒸發(fā),冷凍干燥制得抗菌肽粗提粉??咕拇痔岱塾休^好的組織狀態(tài),滋味氣味正常,色澤均一。組織狀態(tài)整體均勻、松散,粉質干燥且無結塊,具有良好的流動性;滋氣味有較濃的乳香味及乳酸菌發(fā)酵后特有的淡香味;色澤呈均勻一致的乳黃色、有光澤。
抗菌肽粗提粉的理化指標如表4 所示,由表4可知,抗菌粗提粉的脂肪含量為0.53 g/100 g,蛋白質含量為34 g/100 g,含水量為3.4%(w/w),乳糖含量77 g/100 g,溶水后溶液pH 為4.5。
表4 抗菌肽粗提粉理化指標Table 4 Physical and chemical indexes of crude powder of antimicrobial peptides
抗菌肽粗提粉的根據微生物檢測結果見表5,抗菌肽粗提粉中菌落總數<3000 cfu/g,大腸菌群數<90 MPN/100 g。沙門氏菌、志賀氏菌及金黃色葡萄球菌這三種食品中常見致病菌沒有被檢測出。考慮后期可以安全應用于食品中延長食品保質期。
表5 抗菌肽粗提粉微生物指標Table 5 Test results of microbial indexes of crude powder of antimicrobial peptides
安全高效的天然抑菌產品有望代替化學防腐劑用于食品、飼料等行業(yè)[28-29]。當下發(fā)酵乳酸菌抗菌肽的培養(yǎng)基以MRS、M17 培養(yǎng)基居多,采用農業(yè)、工業(yè)副產物為培養(yǎng)基主要成分發(fā)酵乳酸菌抗菌肽成為研究熱點[30]。本研究選用乳清發(fā)酵培養(yǎng)基,以自主分離的具有抑真菌特性的副干酪乳桿菌ALAC 生產抗菌肽粉。采用響應面分析對副干酪乳桿菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化,確定了最佳發(fā)酵工藝條件為培養(yǎng)基初始pH 為7.0、接種量4%、發(fā)酵時間24 h,此條件下乳桿菌產抗菌肽的抑菌圈達到17.33±0.17 mm。最佳發(fā)酵條件制得的抗菌肽粗提粉感官狀態(tài)良好,理化指標和微生物指標符合要求。研究結果表明副干酪乳桿菌ALAC 發(fā)酵生產的抗菌肽具有較強的抑菌特性,為后期進一步優(yōu)化后處理工藝,從而生產抗菌肽粉奠定了基礎。