耐硒海洋菌株的篩選、鑒定及其產(chǎn)納米硒的抗菌活性

徐孝楠，馬浩迪,2，續(xù) 炎，李 璇，覃 智，權(quán)春善,2,*，張麗影,2,*

（1.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連 116600；2.生物技術(shù)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連 116600）

納米硒是一種具有納米級尺寸的紅色單質(zhì)硒[1]，具有抗氧化、抗菌、抗病毒以及抗癌等作用[2]。納米硒合成方法主要有化學(xué)合成、生物合成以及物理合成?；瘜W(xué)合成法是以無機(jī)硒如：SeO2、Na2SeO3、H2SeO3等為硒源，利用還原劑將其還原成單質(zhì)硒[3]；物理法常利用機(jī)械作用，包括摩擦、擠壓、剪切、沖擊、超聲等處理固體原料制備納米硒，或通過升華冷凝法改變硒分子間作用力制備納米硒[4]；生物法制備納米硒，是利用微生物生長發(fā)育過程產(chǎn)生的有效物質(zhì)還原硒鹽（Na2SeO3、H2SeO3等），或利用植物提取物中的有效物質(zhì)將Na2SeO3還原成紅色納米硒。

由于化學(xué)合成法在制備過程中會使用到對人體和環(huán)境造成危害的有毒化學(xué)物質(zhì)，物理法存在能量消耗大，易污染樣品等問題，而生物合成法是在綠色環(huán)保理念下發(fā)展起來的一種簡單、安全、更為環(huán)保的合成方法[5]，因此備受人們關(guān)注，利用生物法合成納米硒已成為國內(nèi)外制備納米硒的新趨勢[6]。此外，生物合成的納米硒生物相容性好，細(xì)胞活性高，尺寸小，粒徑均勻，穩(wěn)定性強(qiáng)[7]，在食品包裝[8]、功能性保健品[9]、抗腫瘤[10]、抗癌[11-12]、藥物開發(fā)[13]等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

迄今為止，研究發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌、真菌等能夠?qū)⑽猁}或亞硒酸鹽還原為單質(zhì)硒，如枯草芽孢桿菌亞種Bacillus subtilissubspeciesstercorisXP、枯草芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensLxz41、鏈霉菌Streptomycessp.ES2-5 等[14-16]，但來自海洋的菌株目前僅有少量報道[17-20]。海洋環(huán)境的特殊性和海洋物種復(fù)雜的生態(tài)功能賦予了海洋微生物不同于陸地微生物的代謝途徑和適應(yīng)機(jī)制[21]。海洋已成為具有特殊功能細(xì)菌的重要來源[22]。為了尋找具有高耐硒能力和還原能力的新菌株，本研究以41 株來自北冰洋沉積物的菌株為研究對象，通過初篩和復(fù)篩，篩選出一株對Na2SeO3具有高耐受力和還原還原能力的菌株，并對其進(jìn)行了鑒定。此外，對利用該菌株還原制備的納米硒進(jìn)行了表征，并進(jìn)一步考察了其對兩種食源性病原菌的抑菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

41 株來自北冰洋深海沉積物的海洋菌株-80 ℃凍存于本實(shí)驗(yàn)；酵母粉 英國OXOID；蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；NaCl（＞99%）、瓊脂 上海生工有限公司；無水乙醇（AR）、丙酮（AR）、溴化鉀（SP）、蔗糖、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷鹽酸溶液 天津市科密歐試劑有限公司；亞硒酸鈉（Na2SeO3） 阿法埃莎（中國）化學(xué)有限公司。

AvantiJ-30 高速低溫冷凍離心機(jī) 美國Beckman 公司；JY92-ⅡN 超聲波細(xì)胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司；D2F-2060 真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FTIR 傅里葉紅外光譜儀北京北分瑞利分析儀器公司；XRD-6000 型X-射線衍射儀 日本島津公司；ZHWY-2102C 恒溫?fù)u床上海智城分析儀器公司；HORIBASZ-100 激光粒度分析儀 日本HORIBA 公司；ZWYD-2403 恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；ZXRD-A7080 全自動新型鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；BXM-30R 高溫滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；920-Ⅱ潔凈工作臺 上海智城分析儀器公司；Milli-Qacademic 超純水制備系統(tǒng) 美國Millipore 公司；JA50003N 型電子天平 上海靜科儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的篩選 將凍存于-80 ℃的41 株海洋菌株進(jìn)行活化，隨后用接種環(huán)挑取菌液于LB 固體培養(yǎng)基（10 g/L NaCl、10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母粉、1 L過膜海水、15 g/L 瓊脂粉）上劃線，33 ℃倒置培養(yǎng)48 h 得到單菌落。隨后從LB 固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)移到裝有10 mL LB 液體培養(yǎng)基的試管中，置于恒溫?fù)u床上180 r/min 培養(yǎng)24 h。按照3%（v/v）的接種量將各菌液分別加入到含有150 mmol/L亞硒酸鈉的LB 液體培養(yǎng)基中，33 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，觀察體系顏色變化，篩選出能夠還原Na2SeO3產(chǎn)納米硒的菌株。隨后，再次將能夠還原Na2SeO3的菌株按照3%（v/v）的接種量加入到含有150 mmol/L Na2SeO3的LB 液體培養(yǎng)基中，33 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h，測其OD 值，每個菌株平行測定三次。根據(jù)OD 值判斷菌株在Na2SeO3存在條件下的生長情況，挑選出耐硒能力強(qiáng)的菌株。將初篩出的各菌株菌液，按照3%（v/v）的接種量加入到含有10、20、40、60、80、100、200、300、400和500 mmol/L Na2SeO3的LB 液體培養(yǎng)基中，33 ℃，180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)24 h，根據(jù)各菌株對不同溶度Na2SeO3的還原情況，復(fù)篩出還原能力最強(qiáng)的菌株。

1.2.2 菌株對亞硒酸鈉還原能力的測定 將復(fù)篩得到的菌株進(jìn)行活化，按照3%（v/v）的接種量加入到LB 液體培養(yǎng)基中，再加入Na2SeO3溶液使體系中Na2SeO3的終濃度為5 mmol/L。將接好菌的LB 培養(yǎng)基置于恒溫?fù)u床中33 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)，每隔2 h 取1 mL 上層清液于試管中，加入1 mL 濃度為1 mol/L 的抗壞血酸溶液，再加入1 mL 濃度為4 mol/L 的HCl 溶液，在室溫條件下靜置10 min，在500 nm 條件下，利用紫外分光光度計(jì)測量吸光度，將其帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到體系中剩余Na2SeO3的量。

1.2.3 菌株鑒定 將凍存于-80 ℃的72 號菌株進(jìn)行活化，隨后用接種環(huán)挑取菌液于固體培養(yǎng)基劃線，最后倒置于33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察并記錄菌落形態(tài)特征。選擇長勢較好的單菌落，置于內(nèi)含10 μL 無菌水的離心管中，100 ℃煮沸10 min，12000 r/min 離心2 min，得到細(xì)菌DNA。以提取的DNA 為模板，采用細(xì)菌通用引物[23]正向引物8F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、反向引物1492R（5’-TACGGCTACCTTGTTAGGACT-3’），對菌株進(jìn)行16S rDNA 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系總體積為50 μL，包括：10 μmol/L 8F，10 μmol/L 1492R，10 ng/μL Template DNA，200 μmol/L dNTP Mixture，5 U/μL rTaq，4.0 μL 1×10 Loading Buffer，39.75 μL dd H2O。

PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火50 ℃ 30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)以上條件32 次；72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測序。

1.2.4 納米硒的制備與分離 將72 號菌株以3%（v/v）的接種量加入到裝有LB 液體培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中，33 ℃，180 r/min 培養(yǎng)24 h，10000 r/min離心10 min，然后倒出上清液，以同樣的條件對上清液再次離心。合并兩次離心的沉淀轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水清洗3 次，每次洗完均以12000 r/min 離心10 min 去上清，沉淀用3 mL 無菌水重懸，在冰浴條件下超聲破壁30 min。破壁完成后用Tris-HCl 和SDS（pH=8.3）溶液洗滌兩次，12000 r/min 條件離心10 min，再用無菌水洗滌一次，然后用無菌水重懸，按V（重懸液）:V（正辛醇）為2:1 的比例加入正辛醇，混勻后12000 r/min 離心10 min，沉淀即為納米硒顆粒，分別用氯仿、乙醇和無菌水各洗滌一次，12000 r/min 離心10 min，沉淀用冷凍干燥儀干燥。

1.2.5 納米硒的表征 采用傅里葉紅外光譜儀測定樣品的結(jié)構(gòu)，將SeNPs 粉末與溴化鉀混合壓片，室溫下在400～4000 cm-1范圍內(nèi)測量其吸收光譜，掃描速度為5 kHz。采用X-射線衍射儀對制得的樣品結(jié)晶狀態(tài)進(jìn)行分析，將SeNPs 粉末置于載玻片的樣品槽中，進(jìn)行表面壓片，隨后將其置于X 射線衍射儀中進(jìn)行測試，掃描角度為10～80°，掃描速度為5°/min。采用掃描電子顯微鏡觀察SeNPs 的形態(tài)及組成，用乙醇分散制樣。利用SZ-100 納米粒度儀測定SeNPs的粒徑大小、分布以及Zeta 電位。

1.2.6 納米硒的抑菌活性 稱取菌株還原得到的納米硒0.2 g 溶解于100 mL 超純無菌水，得到2 mg/mL的納米硒母液，超聲振蕩混勻，過膜除菌。隨后將納米硒母液分別稀釋至20、50、100、150、200 μg/mL的濃度梯度。將OD600=0.5 的大腸桿菌和李斯特菌各100 μL 分別加入96 孔板中，再將不同濃度的納米硒溶液接至各孔，37 ℃恒溫培養(yǎng)4 h（三組平行實(shí)驗(yàn)及一組空白對照實(shí)驗(yàn)）。將實(shí)驗(yàn)組和空白組中的細(xì)菌懸濁液用無菌水稀釋至原液的10-1、10-2、10-3和10-4，隨后分別取2.5 μL 稀釋后的菌懸液滴至LB 固體培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，觀察并計(jì)數(shù)菌落形成單位（Colony Forming Unit，CFU）。根據(jù)空白組和不同濃度實(shí)驗(yàn)組的菌落數(shù)，依據(jù)式（1）計(jì)算SeNPs 對兩種細(xì)菌的抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用單樣本T檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒海洋菌株的篩選

將實(shí)驗(yàn)室保存的41 株分離自北冰洋沉積物的菌株加入到含有150 mmol/L Na2SeO3的LB 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h 后發(fā)現(xiàn)有30 株能夠還原Na2SeO3產(chǎn)生磚紅色的納米硒。隨后檢測了這30株菌在150 mmol/L Na2SeO3存在條件下48 h 后的生長情況，結(jié)果如表1 所示。27 號和58 號菌株的生長明顯受到抑制，培養(yǎng)48 h 后其OD 值明顯小于其它菌株，亦小于這兩株菌株正常生長48 h 后的OD 值。6 株菌株的OD 值較高，分別為8 號、37號、45 號、53 號、72 號、76 號，因此選擇這6 株菌株進(jìn)行復(fù)篩。

表1 初篩出的30 株菌株在LB 培養(yǎng)基和含有Na2SeO3 LB 培養(yǎng)基中生長48 h 后的OD 值Table 1 OD values of 30 strains initially screened after 48 hours of growth in LB medium and LB medium containing Na2SeO3

圖1 為8 號、53 號、72 號、45 號、76 號、37 號菌株分別在含有10、20、40、60、80、100、200、300、400 和500 mmol/LNa2SeO3的LB 液體培養(yǎng)基中的生長情況，由圖可見，72 號菌株對Na2SeO3的還原能力最強(qiáng)。當(dāng)Na2SeO3濃度為300 mmol/L 時，體系顏色依然較紅，說明該菌株能夠在較高濃度的Na2SeO3存在下生長且將其還原為磚紅色納米硒。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了72 號菌株作為生物合成納米硒的菌株。

圖1 耐硒海洋菌株的復(fù)篩Fig.1 Re screening of Selenium-tolerant strains

2.2 72 號菌株還原 Na2SeO3 的能力

通過監(jiān)測還原過程中體系Na2SeO3濃度的變化，定量研究了72 號菌株對的Na2SeO3的還原能力，結(jié)果如圖2 所示。由圖2 可知，培養(yǎng)2 h 后，體系已開始顯示出紅色，表明有納米硒的生成，4 h 后，體系中Na2SeO3的濃度已低于原始濃度的50%。72號菌對Na2SeO3的還原主要在其對數(shù)生長期進(jìn)行。

圖2 72 號菌株在Na2SeO3 存在下的生長曲線對及其還原Na2SeO3 情況Fig.2 Growth curve of strain 72 in the presence of Na2SeO3 and its reduction of Na2SeO3

2.3 菌株的鑒定

圖3 為72 號菌株的聚落形態(tài)圖和系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3（a）可知菌落呈乳白色、不透明，菌落邊緣出現(xiàn)褶皺和收縮并向中間膨脹，采摘細(xì)菌時存在粘液分泌物。將72 號菌株的16S rDNA 序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA 序列做相似性比對，隨后利用MEGA（5.0）中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[24]，結(jié)果如圖3（b）所示。72 號菌株的16SrDNA 序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）相關(guān)菌株的16SrDNA 序列相似性較高，聚集為一簇，由此確定72 號菌株為芽孢桿菌，將其命名為Bacillussp.Q72。

圖3 72 號菌株的菌落形態(tài)（a）和系統(tǒng)發(fā)育樹（b）Fig.3 Colony morphology (a) and phylogenetic tree (b) of strain 72

2.4 納米硒表征

2.4.1 紅外光譜分析 利用傅里葉紅外光譜檢測納米硒的表面官能團(tuán)種類，結(jié)果如圖4 所示。在2940，1654，1538，1429，1077，748 cm-1，位置出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，其中在2940 cm-1的特征峰是由脂肪族中C-H 伸縮振動產(chǎn)生；1654 cm-1處的峰由酰胺基中的C=O（酰胺Ⅰ帶）伸縮振動產(chǎn)生；在1538 cm-1處的吸收峰是由苯環(huán)骨架的雙鍵伸縮振動產(chǎn)生；1429 cm-1處的吸收峰是C-H 變形振動造成的；1077 cm-1吸收峰可能是由胺中的C-N 伸縮振動造成的；748 cm-1處具有特征吸收峰，屬于取代苯環(huán)的彎曲振動吸收[25-27]。傅里葉紅外光譜結(jié)果表明，由72 號菌株還原Na2SeO3所得到的納米硒表面存在著氨基和羥基等基團(tuán)，說明在納米硒合成過程中，含有這些官能團(tuán)的生物分子，如脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物等發(fā)揮著重要作用。

圖4 Bacillus sp.Q72 生物合成納米硒的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of SeNPs biosynthetized by Bacillus sp.Q72

2.4.2 掃描電鏡分析 圖5 為Bacillussp.Q72 及其產(chǎn)納米硒的掃描電鏡結(jié)果。由圖5 可見，72 號菌株呈短棒狀，長度約為1.0 μm 左右（圖5a），其產(chǎn)生的納米硒為規(guī)則的球形顆粒（圖5b）。圖5c 能譜分析結(jié)果顯示，圖5b 黃色圓圈處的元素組成中包含35.13%的Se 元素，證明菌體附近白色球狀顆粒為納米硒顆粒。

圖5 Bacillus sp.Q72 及其生物合成納米硒的形態(tài)與組成Fig.5 Morphology and composition of Bacillus sp.Q72 and SeNPs biosynthesized by it

2.4.3 XRD 分析 納米硒的XRD 光譜如圖6 所示，由圖6 可知由Bacillussp.Q72 還原的納米硒在20～30°之間具有較強(qiáng)的射峰，2θ值處顯示出23.4°（100）和29.6°（101）處的尖峰，顯示納米顆粒結(jié)構(gòu)中存在結(jié)晶硒[28]。此外，與納米硒的六方形標(biāo)準(zhǔn)卡（JCPDS No.06-0362）對比可知，在41.2°、43.6°、45.4°、51.7°、55.9°、61.5°和65.4°處都有明顯的衍射峰，這與六方晶形結(jié)構(gòu)的（110）、（102）、（111）、（201）和（202）晶面一一對應(yīng)[29]。由XRD 圖可以看出與（101）面對應(yīng)的29.6°處的衍射峰強(qiáng)度最大，72 號菌株合成的納米硒晶體顆粒是以（101）面為主導(dǎo)。之間；Lampis 等[35]利用Bacillus mycoidesSeITE01 菌株合成的SeNPs 粒徑分布在50～400 nm。Bacillussp.Q72 菌株生物合成的納米硒的平均粒徑為169.3 nm，電位為-48.1±0.5 mV，其粒徑分布較窄，具有良好的穩(wěn)定性，可作為生物材料進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用。

圖6 Bacillus sp.Q72 生物合成納米硒的XRD 圖Fig.6 XRD spectrogramof SeNPs biosynthetized by Bacillus sp.Q72

2.4.4 粒度和電位分析 納米硒的粒徑、粒徑分布及Zeta 電位如圖7 所示。研究表明5～200 nm 的納米硒具有更加明顯的生物效應(yīng)[30-32]，Zeta 電位越小，其生物活性越好[33]。到目前為止，已報道多種芽孢桿菌在有氧或厭氧條件下能夠?qū)單猁}還原成SeNPs，如Ullah 等[26]利用Bacillus subtilisBSN313生物合成的SeNPs 平均粒徑為590 nm，電位為-26.9 mV；Bao 等[34]報道Bacillus oryziterraeZYKT菌株生物合成SeNPs 的粒徑主要分布在100～500 nm

圖7 Bacillus sp.Q72 生物合成納米硒的粒徑、粒徑分布和電位Fig.7 Particle size, distribution, and potential of SeNPs biosynthetized by Bacillus sp.Q72

2.5 抑菌活性

圖8 為Bacillussp.Q72 生物合成的納米硒對大腸桿菌和李斯特菌的抑菌活性圖。大腸桿菌是一種重要的人畜共患致病菌，屬于兼性厭氧型的革蘭氏陰性桿菌[36-37]，李斯特菌是我國主要的食源性致病菌之一，是一種兼性厭氧型的革蘭氏陽性菌[38-39]。圖8a～圖8b 用20～200 μg/mL 不同濃度的納米硒處理后，大腸桿菌和李斯特菌的菌落形成情況。從中可見，隨著納米硒濃度的增加，相同稀釋倍數(shù)下，各菌液中的菌落數(shù)明顯減小，納米硒對兩種致病菌的生長均表現(xiàn)出明顯的抑制。圖8c 是納米硒對大腸桿菌和李斯特菌的抑制率隨濃度變化圖，與對照組相比（0 μg/mL），Bacillussp.Q72 還原產(chǎn)生的納米硒對兩種致病菌的抑制率隨濃度的增加而提高。納米硒對大腸桿菌表現(xiàn)出更加明顯的抑制活性，在20～150 μg/mL 的濃度范圍中對大腸桿菌的抑制率表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01），在50～100 μg/mL 濃度范圍內(nèi)對李斯特菌的抑制率表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）。納米硒濃度為200 μg/mL 時，其對大腸桿菌的抑制率可達(dá)到92.1%。

圖8 Bacillus sp.Q72 生物合成納米硒的抑菌活性Fig.8 Antibacterial activity of SeNPs biosynthesisd by Bacillus sp.Q72

3 結(jié)論

本研究通過初篩和復(fù)篩，從41 株來自北冰洋深海沉積物的海洋菌株中，篩選出了一株對Na2SeO3還原能力較強(qiáng)的菌株。經(jīng)鑒定，該菌株為芽孢桿菌，將其命名為Bacillussp.Q72，其還原Na2SeO3產(chǎn)生的納米硒為球形顆粒，平均粒徑為169.3 nm，電位為-48.1±0.5Mv，具有較好的穩(wěn)定性。Bacillussp.Q72菌株合成的納米硒對大腸桿菌和李斯特菌的生長均有明顯抑制作用，對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的抑制效果更為明顯。傅里葉紅外光譜測定表明，納米硒顆粒表面存在著氨基和羥基等基團(tuán)，說明在納米硒合成過程中，含有這些官能團(tuán)的生物分子，如脂類、蛋白質(zhì)、碳水化合物等發(fā)揮著重要作用。有關(guān)介導(dǎo)Bacillussp.Q72 合成納米硒的的生物活性分子及其對亞硒酸鹽的合成機(jī)制，將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步深入探究。