植物油中內(nèi)源性成分的抗氧化作用

馬宇晨，王光宜，劉樂樂，李紅艷

（南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點實驗室，江西南昌 330047）

食用植物油中的微量成分對植物油的營養(yǎng)價值和儲存穩(wěn)定性具有重要作用。生育酚是一種具有較高抗氧化活性的微量成分，Wen 等[1]通過對多種植物油生育酚的種類和含量進行分析，發(fā)現(xiàn)植物油的種類對其生育酚的含量有很大影響。前期研究發(fā)現(xiàn)α-生育酚在高濃度時呈現(xiàn)出促氧化作用，但隨著濃度的降低，變成了抗氧化作用，且在不同的油樣中，存在著從促氧化作用到抗氧化作用的不同濃度拐點[2]。除生育酚外，多酚也具有很高的抗氧化活性，其中槲皮素和李子素是研究最廣泛的多酚，槲皮素清除高活性自由基的能力可能與其潛在的有益健康作用有關(guān)[3]。Moudden 等[4]使用多酚提取物作為天然抗氧化劑，明顯延長了葵花油和菜籽油的貯藏期限。此外，植物油中含有豐富的β-谷甾醇、豆甾醇和角鯊烯，對脂質(zhì)過氧化也有很強的抑制作用。Shi 等[5]的研究顯示玉米油和菜籽油的植物甾醇含量高于大豆油、葵花籽油和山茶油，其中山茶油的植物甾醇含量最低。在橄欖油的熱誘導(dǎo)氧化過程中觀察到角鯊烯的濃度依賴性抗氧化活性[6]。早期研究表明角鯊烯自由基氧化的主要產(chǎn)物為環(huán)狀二氫過氧化物[7]，近期研究顯示其主要產(chǎn)物為醇和環(huán)氧化物[8]。

目前對于植物油內(nèi)源性抗氧化成分的研究多集中在單一抗氧化成分的抗氧化作用或理想介質(zhì)中的抗氧化相互作用。Cheng 等[9]通過自由基清除能力和氧化穩(wěn)定指標(biāo)研究了多酚對亞麻籽油乳液氧化穩(wěn)定性的影響，結(jié)果表明多酚可以提高亞麻籽油納米乳液的穩(wěn)定性。張莉莎等[10]研究發(fā)現(xiàn)α-生育酚和γ-谷維素在乙酸乙酯介質(zhì)中存在拮抗作用。已有研究表明抗氧化成分在單純?nèi)軇┙橘|(zhì)和油脂介質(zhì)中的抗氧化相互作用及機理不盡相同[11]。因此油脂中抗氧化成分的相互作用不能完全通過單純?nèi)軇┙橘|(zhì)的結(jié)果來反映，有必要進一步研究植物油介質(zhì)中抗氧化成分的相互作用。

評估植物油的氧化程度的指標(biāo)包括氧化穩(wěn)定性指數(shù)、脂肪酸組成、酸價、過氧化值、茴香胺值、總氧化值等。通過Rancimat 法測得的氧化穩(wěn)定性指數(shù)被廣泛用于研究油脂的氧化穩(wěn)定性[12-13]。Li 等[14]證明了大豆油的氧化穩(wěn)定性指數(shù)與加熱溫度和時間無關(guān)。脂肪酸組成顯著影響植物油的自動氧化，Multari等[15]發(fā)現(xiàn)油酸含量高的植物油比油酸含量低的大豆油在短期油炸過程中的氧化穩(wěn)定性好。此外，根據(jù)過氧化值和茴香胺值計算的總氧化值也是表征油脂氧化程度的重要指標(biāo)。朱雪梅等[16]使用Schaal 烘箱氧化實驗，加速氧化期間定期測定植物油總氧化值的變化來評估油脂的氧化程度。

本實驗通過向預(yù)處理去除抗氧化成分的復(fù)配油樣中添加不同濃度和比例的生育酚、植物甾醇、多酚和角鯊烯，以氧化穩(wěn)定性指數(shù)和DPPH 自由基清除能力為指標(biāo)，并使用Bliss 模型來研究主要內(nèi)源性抗氧化成分在復(fù)配油脂介質(zhì)中的單獨抗氧化能力和相互作用類型，同時采用Schaal 烘箱加速實驗，通過脂肪酸組成、酸價、過氧化值、茴香胺值、總氧化值等氧化穩(wěn)定性指標(biāo)的變化，評價復(fù)配油的氧化穩(wěn)定性，從而找出有效的抗氧化成分組合，為植物油精煉過程中適度保留內(nèi)源性抗氧化成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棕櫚液油（天津聚龍）、玉米油（益海嘉里）、菜籽油（上海多力）、高油酸葵花籽油（上海日清）、芝麻油（河南三誠）、椰子油（海南冷榨） 江西南昌當(dāng)?shù)爻校粯?biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯（FAME，GLC-463） 美國NuChek-Prep 公司；福林酚試劑、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-生育酚、γ-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、角鯊烯、咖啡酸等標(biāo)準(zhǔn)品 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、正己烷、乙腈和異丙醇 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；其他溶劑為分析純。

OSI-24 型油脂氧化穩(wěn)定性測定儀 美國Omnion公司；6890N 型氣相色譜儀、Agilent 1100 型高效液相色譜儀、Agilent 6890N 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；DSY-Ⅲ型氮吹儀 北京金科精華苑科技有限公司；AR1140 電子分析天平 美國奧豪斯貿(mào)易公司；HH4 型恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TDL-5-A 高速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠；RE52-4旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮玻璃儀器廠；DHG-9035A鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；EXL800全自動酶標(biāo)儀 美國 Biotek Instruments 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 使用棕櫚液油、椰子油、高油酸葵花籽油、菜籽油、芝麻油、玉米油進行油脂的復(fù)配，以飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸2:3 的比例為條件，經(jīng)MATLAB 規(guī)劃求解，得到脂肪酸組成類似但內(nèi)源性抗氧化成分含量不同的復(fù)配油，用于研究抗氧化成分在復(fù)雜的油脂基質(zhì)中的作用，復(fù)配油的配制比例如表1 所示。按照Waraho 等[17]的方法預(yù)處理復(fù)配油，采用柱層析法去除抗氧化成分。層析柱內(nèi)徑3 cm，高35 cm，填料使用硅膠和活性炭（共三層，最底層是22.5 g 硅膠，中間層6 g 活性炭，最上層22.5 g硅膠）。

1.2.2 樣品準(zhǔn)備 參照Liu 等[18]的方法，將生育酚（α-生育酚:γ-生育酚=1:1）、植物甾醇（菜油甾醇:豆甾醇:β-谷甾醇=1.6:1:1.6）、角鯊烯和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品用乙酸乙酯制備成儲備液，最終濃度分別為2000、10000、1000 和200 mg/kg，按照表2 和表3 的組成和濃度回添進預(yù)處理去除抗氧化成分后的復(fù)配油中。

表2 抗氧化成分回添到預(yù)處理油樣中的濃度Table 2 Concentration of antioxidant components added back to the purified oil sample

表3 抗氧化成分以混合物形式回添到預(yù)處理油樣中的組成Table 3 Composition of antioxidant components added back to the purified oil sample in the form of a mixture

1.2.3 脂肪酸組成的測定 根據(jù)Zeng 等[19]的方法對油樣進行甲酯化，處理后的樣品使用配備FID 檢測器、CP-Sil 88 熔融石英毛細管柱（CP7489，100 m×0.25 mm×0.2 μm）的Agilent 6890N 氣相色譜分析，色譜條件與文獻[19]方法一致。

1.2.4 生育酚含量的測定 根據(jù)曾俊鵬[20]的方法稍作修改。稱取1.0 g 左右的植物油樣，正己烷定容到10 mL。通過0.22 μm 的有機相濾膜后，用Agilent 1100 高效液相色譜儀（帶有VWD 檢測器）進行檢測。HPLC 測定條件：進樣量10 μL，色譜柱Elite Hypersil ODS2（4.6 mm×150 mm×5 μm），流動相為甲醇/水（98:2，v/v），流速0.8 mL/min，柱溫室溫，檢測波長為292 nm。

1.2.5 總酚含量的測定 對Ahmed 等[21]的Folin-Ciocalteu 方法稍作調(diào)整測定。稱取2.0 g 油樣用1 mL正己烷和2 mL 80%的甲醇萃取三次，然后合并提取液。取1 mL 的提取液轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中，然后加入2 mL 去離子水和0.5 mL 福林酚試劑。3 min后，向反應(yīng)混合物中加入1.5 mL 的1%（w/v）碳酸鈉溶液。1 h 后，與空白對照，在765 nm 處測量吸光度。結(jié)果用mg GAE/kg 表示。

1.2.6 植物甾醇含量的測定 根據(jù)Zhang 等[22]和Shi 等[23]的方法對油樣進行預(yù)處理，取0.25 g 油樣進行皂化處理，提取不皂化物進行衍生化反應(yīng)1 h。處理后的樣品使用配備Agilent DB-5HT 毛細管柱（30 m×320 mm×0.10 μm）的Agilent 6890N 氣相色譜分析，色譜條件參考曾俊鵬[20]的方法。

1.2.7 角鯊烯含量的測定 參照馬力等[24]的方法，稍作修改。樣品采用硅膠柱提純處理，用Agilent 1100 高效液相色譜儀（帶有DAD 檢測器）進行檢測。HPLC 測定條件：進樣量10 μL，色譜柱Zorbax Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm×5 μm），流動相為乙腈/甲醇（40:60，v/v），流速1 mL/min，柱溫40 ℃，檢測波長為210 nm。

1.2.8 氧化穩(wěn)定性指數(shù)（Rancimat 法）測定 氧化穩(wěn)定性指數(shù)的測定根據(jù)Becker 等[25]和Liu 等[18]的方法稍作修改。氧化誘導(dǎo)期IP 是用美國OSI 型油脂氧化穩(wěn)定性測定儀在120 ℃和10 L/h 的氣流下進行測定。最終結(jié)果以額外誘導(dǎo)期aIP（h）表示：

aIP=IP(添加抗氧化劑)-IP(去除抗氧化劑)

根據(jù)對添加不同組合抗氧化劑的油樣的測量，可以確定可能的相互作用。

若出現(xiàn)以下情況，則呈現(xiàn)協(xié)同作用：

aIP組合抗氧化劑(1+2)＞aIP抗氧化劑(1)+aIP抗氧化劑(2)

當(dāng)相等時，表示存在相加效應(yīng)；當(dāng)小于時，表示存在拮抗效應(yīng)。上述評價方法中的理論值和實驗值在數(shù)學(xué)上需要有統(tǒng)計上的差異。

1.2.9 DPPH 自由基清除能力的測定

1.2.9.1 DPPH 自由基清除率測定 按照Liu 等[18]的方法測定，稍作修改。用乙酸乙酯制備0.2 mmol/L DPPH·溶液，取0.10 g 油樣，加入4 mL 乙酸乙酯制成樣品溶液。取2 mL 樣品溶液與2 mL DPPH·溶液混合，放置暗處反應(yīng)30 min 后于517 nm 處測定吸光度。實驗清除能力（ESC）由以下公式計算：

其中，A0、Ai、Aj分別為2 mL 乙酸乙酯+2 mL DPPH·溶液、2 mL 樣品溶液+2 mL DPPH·溶液以及2 mL 樣品溶液+2 mL 乙酸乙酯的吸光度值。

1.2.9.2 抗氧化劑混合物的協(xié)同效應(yīng)（SE）的計算理論清除能力（TSC）被定義為混合物中每種等摩爾物質(zhì)的單獨清除能力之和[26]，公式如下：

其中，ESCA和ESCB是混合物中各個化合物的ESC 值。二元混合物的協(xié)同效應(yīng)（SE）被定義為實驗值除以理論值，它可以在數(shù)學(xué)上表示為：

如果SE＞1，就意味著混合物呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；如果SE＜1，就是拮抗效應(yīng)；而SE=1 則顯示為加成效應(yīng)。根據(jù)實驗清除值和理論清除值之間的顯著差異（P＜0.01），來確定協(xié)同、拮抗或加成效應(yīng)。

1.2.10 植物油氧化指標(biāo)的測定 復(fù)配油的酸價和過氧化值分別采用GB 5009.229-2016（熱乙醇指示劑滴定法）和GB 5009.227-2016（滴定法）測定，茴香胺值采用GB/T 24304-2009 的方法測定。

1.2.11 Schaal 烘箱加速氧化實驗 植物油置于帶蓋玻璃瓶中，稍加蓋好，放入62±1 ℃恒溫烘箱中連續(xù)加熱氧化25 d，每12 h 搖勻一次，并隨即更換位置。每5 d 取適量氧化油分析測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

樣品平行測定三次，數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（mean±SD）表示。統(tǒng)計學(xué)差異采用單因素ANOVA分析中的Duncan 方法，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異，所有的數(shù)據(jù)通過SPSS 26.0 軟件進行分析比較，使用Origin 2019b 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理對樣品脂肪酸組成和內(nèi)源性抗氧化成分的影響

表4 為預(yù)處理前后復(fù)配油的脂肪酸組成。從表4中可以看出，TH 和TL 的飽和脂肪酸（SFA）和單不飽和脂肪酸（MUFA）含量之間無顯著性差異（P＞0.05），TH 的n-6 與n-3 多不飽和脂肪酸的比值（n-6/n-3PUFA）顯著低于TL（P＜0.05），預(yù)處理前后復(fù)配油的脂肪酸組成無顯著性差異（P＞0.05）。圖1 和圖2為樣品中生育酚、植物甾醇和角鯊烯色譜圖。表5為預(yù)處理前后復(fù)配油的主要內(nèi)源性抗氧化成分含量。圖1a 和圖1b 顯示預(yù)處理前復(fù)配油中含有一定含量的生育酚，預(yù)處理后復(fù)配油中則無法檢測到相應(yīng)的峰。從表5 中可以看出，預(yù)處理前TH 的α-生育酚、菜油甾醇、豆甾醇和總酚含量顯著高于TL（P＜0.05），γ-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯含量顯著低于TL（P＞0.05），預(yù)處理后α-生育酚、γ-生育酚和總酚含量均未檢測出，植物甾醇和角鯊烯含量在預(yù)處理前后有顯著性差異（P＜0.05）。說明使用柱層析法對脂肪酸組成影響不大，且可以有效去除油中的內(nèi)源性抗氧化成分。

圖1 預(yù)處理前后復(fù)配油生育酚的液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of tocopherol of compounded oils before and after the pretreatment

圖2 預(yù)處理前復(fù)配油植物甾醇和角鯊烯的色譜圖Fig.2 Chromatograms of phytosterols and squalene of compounded oils before the pretreatment

表4 預(yù)處理前后復(fù)配油的脂肪酸組成比較（總脂肪酸的百分比）Table 4 Comparison of fatty acid composition of compounded oils before and after the pretreatment (percentage of total fatty acids)

表5 預(yù)處理前后復(fù)配油的抗氧化成分含量比較Table 5 Comparison of antioxidant content of compounded oils before and after the pretreatment

2.2 樣品中主要抗氧化成分的抗氧化能力

通過Rancimat 試驗和DPPH 自由基清除率試驗測定了內(nèi)源性抗氧化成分的抗氧化能力。圖3 為通過Rancimat 試驗測定的單一抗氧化劑作用時的抗氧化效果，從圖中可以看出，在160～800 mg/kg 的濃度范圍內(nèi)，生育酚的最小氧化誘導(dǎo)期為4.43 h，最大氧化誘導(dǎo)期有4.93 h，預(yù)處理后復(fù)配油的氧化誘導(dǎo)期只有3.53 h。這說明生育酚在延長復(fù)配油的氧化穩(wěn)定性方面起著積極作用。當(dāng)生育酚濃度低于480 mg/kg時，增加生育酚濃度可以顯著提高復(fù)配油的氧化誘導(dǎo)期，濃度在480～800 mg/kg 的范圍內(nèi)時，繼續(xù)增加生育酚濃度對氧化誘導(dǎo)期的延長沒有起到顯著作用。這與Liu 等[18]研究α-生育酚在米糠油中的抗氧化性得到的結(jié)論一致。圖3c 表明，多酚在24～120 mg/kg的范圍內(nèi)可以顯著提高復(fù)配油的氧化誘導(dǎo)期，且氧化誘導(dǎo)期隨著濃度的增加而急劇增加，最大能達到5.72 h。潘東升等[27]研究表明多酚在植物油中的抗氧化效果隨添加量的增加而增強，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。圖3d 顯示，植物甾醇在1200～6000 mg/kg的濃度范圍內(nèi)時，氧化誘導(dǎo)期沒有得到顯著的提升（P＞0.05）。Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)植物甾醇在Rancimat 試驗條件下無明顯抗氧化活性，反而起到了促氧化劑的作用。

圖3 添加不同抗氧化成分的樣品在120 ℃下測定的氧化誘導(dǎo)時間Fig.3 Oxidation induction time measured at 120 ℃ for samples with different antioxidant components added

圖4 為通過DPPH 自由基清除率實驗測定的抗氧化效果，從圖4a 中可以看出，生育酚的DPPH 自由基清除能力隨濃度的增加而顯著增加（P＜0.05），當(dāng)生育酚含量達到800 mg/kg 時，DPPH 自由基清除能力最強，達到63.39%。生育酚的DPPH 自由基清除能力隨著濃度的增加而急劇增加，這是由于生育酚含有酚羥基，它能為DPPH 自由基貢獻H 原子，成為穩(wěn)定的生育酚醌自由基[18]。如圖4b 所示，除角鯊烯為80 mg/kg 時DPPH 自由基清除能力顯著降低（P＜0.05），其余濃度下均沒有顯著差異（P＞0.05）。這可能是由于在80 mg/kg 的濃度下，角鯊烯的氧化速度快，氧化產(chǎn)物快速積累，已有研究發(fā)現(xiàn)角鯊烯的二次氧化產(chǎn)物對橄欖油表現(xiàn)出促氧化作用[8]。圖4c 顯示，多酚的DPPH 自由基清除能力也隨濃度的增加而顯著增加（P＜0.05），最高可達到30.02%。圖4d 顯示，植物甾醇在1200～6000 mg/kg 的范圍內(nèi)時，DPPH自由基清除能力比不加抗氧化成分強（P＜0.05），最高達到了20.65%，甾醇濃度與清除能力之間沒有劑量效應(yīng)關(guān)系。在早期的研究中，Sims 等[28]發(fā)現(xiàn)只有結(jié)構(gòu)中有亞乙基側(cè)鏈的甾醇有抗氧化活性，沒有亞乙基側(cè)鏈的甾醇則沒有明顯的抗氧化效果。隨后Gordon等[29]得到了相似的結(jié)果，并提出假設(shè)，認(rèn)為具有亞乙基側(cè)鏈的甾醇可能通過側(cè)鏈上無阻礙的烯丙基質(zhì)子與油脂中的自由基發(fā)生反應(yīng)，生成相對更穩(wěn)定的三級自由基而發(fā)揮抗氧化劑的作用。除此之外，內(nèi)環(huán)雙鍵的位置和數(shù)量也會影響甾醇的抗氧化活性。近期的研究中，Liu 等[18]發(fā)現(xiàn)植物甾醇在Rancimat 試驗條件下無明顯抗氧化活性，反而起到了促氧化劑的作用，在DPPH 自由基清除試驗條件下，植物甾醇抗氧化活性很低。已經(jīng)有研究表明高溫會促進植物甾醇的氧化，形成氧化產(chǎn)物，降低植物甾醇的抗氧化活性[30-31]，且植物甾醇的醇羥基較低[32]，因此顯示出較差的抗氧化能力。

圖4 添加不同抗氧化成分的樣品DPPH 自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of samples with different antioxidant ingredients added

2.3 樣品中主要抗氧化成分的抗氧化相互作用

2.3.1 通過Rancimat 試驗測定的相互作用 圖5 顯示了不同組合的抗氧化成分的額外誘導(dǎo)期aIP 以及相互作用。從圖5a 中可以看出，多酚與角鯊烯的組合下M1（多酚24 mg/kg+角鯊烯40 mg/kg）、M3（多酚24 mg/kg+角鯊烯200 mg/kg）、M5（多酚72 mg/kg+角鯊烯120 mg/kg）和M7（多酚120 mg/kg+角鯊烯40 mg/kg）有顯著的拮抗作用，其余組表現(xiàn)為相加作用。這可能與多酚抑制角鯊烯自氧化有關(guān)[33]。

圖5 不同組合額外誘導(dǎo)期aIP 的理論值和實驗值及相互作用Fig.5 Theoretical and experimental values of aIP and interactions for different combinations of additional induction periods

圖5b 表明，不同濃度和比例的生育酚（160～800 mg/kg）和多酚（24～120 mg/kg）在復(fù)配油樣中呈現(xiàn)拮抗作用，多酚含量越高，拮抗作用越明顯，生育酚含量升高，拮抗作用存在減弱的趨勢。M7（生育酚800 mg/kg+多酚24 mg/kg）甚至呈現(xiàn)出相加作用。Becker 等[25]研究發(fā)現(xiàn)α-生育酚和槲皮素在乳液中顯示出強烈的協(xié)同作用，在脂質(zhì)體中協(xié)同作用減弱，在100 ℃的葵花籽油中則有明顯的拮抗作用，產(chǎn)生拮抗作用可能是由于兩者形成的中間產(chǎn)物在高溫油中容易被氧化。

圖5c 顯示，生育酚和植物甾醇的組合呈現(xiàn)拮抗作用的趨勢，當(dāng)生育酚濃度達到480 和800 mg/kg，植物甾醇濃度達到6000 mg/kg 時出現(xiàn)了拮抗作用。已有研究[18]發(fā)現(xiàn)α-生育酚（50～500 mg/kg）和植物甾醇（2000～12000 mg/kg）在米糠油中呈現(xiàn)拮抗作用，且隨著生育酚和甾醇濃度的升高，拮抗作用在逐漸減弱。

圖5d 表明植物甾醇與多酚有非常明顯的拮抗作用，拮抗作用的程度與兩者濃度沒有明顯相關(guān)性?？赡苁怯捎诙喾涌寡趸Ч@著，會抑制植物甾醇發(fā)生氧化反應(yīng)。

圖5e 中，當(dāng)生育酚和角鯊烯組合作用時，二者均處于低濃度下呈現(xiàn)出了拮抗作用，提高生育酚或角鯊烯的濃度都能使拮抗作用減弱，M6 組當(dāng)生育酚濃度達到480 mg/kg、角鯊烯濃度達到200 mg/kg 時，表現(xiàn)出較明顯的協(xié)同作用，提高生育酚的濃度使協(xié)同作用增強。這說明角鯊烯單獨作用時雖然沒有明顯抗氧化效果，但可以提高生育酚的抗氧化能力。植物甾醇與角鯊烯單獨作用時aIP 有負值出現(xiàn)，組合作用時也無明顯抗氧化效果，所測aIP 實驗值與理論值之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.3.2 通過DPPH 自由基清除試驗測定的相互作用

圖6a 可以看出，當(dāng)多酚和角鯊烯組合作用時，均比相同濃度的多酚單獨作用時的ESC 高，且隨著多酚和角鯊烯濃度的上升，多酚與角鯊烯之間的拮抗作用逐漸減弱。M6 組多酚濃度達到72 mg/kg、角鯊烯濃度達到120 mg/kg 時拮抗作用消失，呈現(xiàn)相加效應(yīng)。繼續(xù)增加多酚和角鯊烯的濃度，仍然呈現(xiàn)相加效應(yīng)。對于多酚與角鯊烯的組合，圖5a 和圖6a 顯示的相互作用略有不同，但兩種情況均表明，多酚濃度高的情況下拮抗作用會減弱甚至消失。

圖6 不同組合的DPPH 自由基實驗清除能力和理論清除能力及協(xié)同效應(yīng)Fig.6 Experimental and theoretical scavenging capacities and synergistic effects of DPPH free radicals of different combinations

圖6b 顯示不同濃度和比例的生育酚和多酚在復(fù)配油樣中均呈現(xiàn)拮抗作用，且同濃度的生育酚條件下，多酚含量越高，拮抗作用越明顯。這與圖5b 的結(jié)果一致。

圖6c 顯示生育酚與植物甾醇在不同組合下處于拮抗作用，生育酚濃度和植物甾醇濃度均達到最高時，呈現(xiàn)相加作用。這表明生育酚和植物甾醇之間拮抗作用的程度隨植物甾醇濃度的增加而減弱。早期研究[34]表明植物甾醇對α-生育酚再生有抑制作用，最近的研究[18]也證明了α-生育酚與植物甾醇在植物油基質(zhì)中呈現(xiàn)拮抗作用，這與本研究得到的結(jié)果一致。

圖6d 表明植物甾醇與多酚的組合M1（植物甾醇1200 mg/kg+多酚24 mg/kg）和M2（植物甾醇1200 mg/kg+多酚72 mg/kg）有明顯的拮抗作用，M3（植物甾醇1200 mg/kg+多酚120 mg/kg）和M4（植物甾醇3600+多酚24 mg/kg）有協(xié)同效應(yīng)，繼續(xù)增加兩者的濃度則顯現(xiàn)出相加作用。這與圖5d 的結(jié)果有一定的區(qū)別，可能是由于溫度對多酚的抗氧化活性產(chǎn)生影響[35]，從而使兩種方法測得的植物甾醇與多酚的相互作用類型存在差異。

圖6e 可以看出，當(dāng)生育酚和角鯊烯組合作用時，隨著生育酚和角鯊烯濃度的上升，生育酚與角鯊烯之間的拮抗作用逐漸減弱，生育酚濃度在達到800 mg/kg 時拮抗作用消失，呈現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。這和圖5e 的結(jié)果相同。目前關(guān)于角鯊烯和生育酚之間協(xié)同抗氧化作用的研究較少，機理尚不能明確。Psomiadou 等[36]認(rèn)為角鯊烯在光氧化研究中可以再生α-生育酚，這與Kohno 等[37]的假說一致。圖6f 表明植物甾醇和角鯊烯組合M1（植物甾醇1200 mg/kg+角鯊烯40 mg/kg）和M2（植物甾醇1200 mg/kg+角鯊烯120 mg/kg）有較為明顯的拮抗效應(yīng)，其余各組則接近于相加效應(yīng)。Finotti 等[38]用克羅欣漂白法測定了α-生育酚、β-谷甾醇和角鯊烯之間的抗氧化相互作用，結(jié)果顯示角鯊烯與α-生育酚和β-谷甾醇存在協(xié)同作用，這可能是由于角鯊烯可以作為一種競爭性的化合物在反應(yīng)中發(fā)揮作用，從而降低氧化的速度。

2.4 通過Schaal 法評價抗氧化成分不同的復(fù)配油氧化穩(wěn)定性

表6 為復(fù)配油初始抗氧化成分含量，如表所示，TH 的α-生育酚和多酚含量顯著高于TL，γ-生育酚含量顯著低于TL（P＜0.05）。TH0和TL0為TH 和TL組去除抗氧化成分后的復(fù)配油，TH1和TL1是在TH和TL 基礎(chǔ)上調(diào)整了生育酚和多酚的含量，使得最終α-生育酚和γ-生育酚分別達到400 mg/kg 左右，多酚含量達到120 mg/kg 左右。劉慧敏[39]通過研究植物油儲藏過程中微量成分和抗氧化能力的變化，分析了儲藏過程中不同植物油微量成分含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性，結(jié)果表明植物油中多酚的含量與極性部分的抗氧化能力呈顯著相關(guān)性，植物油中的多酚和生育酚與植物油的抗氧化性能密切有關(guān)。Yao等[40]通過測定不同植物油的微量成分含量和自由基清除活性，建立了微量成分與其抗氧化能力之間的關(guān)系，結(jié)果表明多酚和α-生育酚是影響植物油抗氧化能力的主要因素。

表6 復(fù)配油初始抗氧化成分含量（mg/kg）Table 6 Initial antioxidant content of compounded oils (mg/kg)

圖7 為烘箱加速氧化下復(fù)配油脂肪酸組成的變化，從圖中可以看出，復(fù)配油的PUFA 和MUFA 隨著氧化天數(shù)的增加而減少，SFA 隨著氧化天數(shù)的增加而增加。未經(jīng)過預(yù)處理的組TH、TL、TH1和TL1脂肪酸組成只有微小的變化，經(jīng)過預(yù)處理的組TH0和TL0脂肪酸組成變化范圍較大。在未經(jīng)過預(yù)處理的組中，SFA 含量增加最多的是TL 組，增加了3.33%。在經(jīng)過預(yù)處理的組中，SFA 含量增加最多的是TL0組，增加了17.51%。

圖7 烘箱加速過程中脂肪酸組成的變化Fig.7 Changes of fatty acid composition in oils during accelerated oxidation test

如圖8a 所示，預(yù)處理后的復(fù)配油初始酸價極低，均在0.05 mg KOH/g 以下。經(jīng)過25 d 的烘箱加速氧化，復(fù)配油的酸值都顯著增加（P＜0.05）。在氧化結(jié)束時，復(fù)配油酸價從高到低排列為TL0（1.45）、TH0（1.16）、TL1（0.61）、TH1（0.52）、TH（0.50）、TL（0.48）。TH0、TL0的酸價變化范圍較大，且氧化第20 d 到氧化結(jié)束期間，酸價增長最顯著。圖8b 表明，復(fù)配油的POV 隨著烘箱內(nèi)加速氧化時間的增加而增加，加速氧化結(jié)束時的POV 順序為TL0＞TH0＞TL＞TL1＞TH＞TH1。TL0、TH0的初始POV 值較低，均小于0.73 mmol/kg，但氧化第5 天開始的POV 值超過了初始POV 較高的未預(yù)處理的組。圖8c 中復(fù)配油的p-茴香胺值隨著氧化時間的增加而增加，其中TH1的初始p-茴香胺值最高，達到0.82。氧化結(jié)束時的p-茴香胺值的順序是TL0＞TH0＞TH＞TL＞TH1＞TL1。總氧化值為結(jié)合過氧化值和茴香胺值進行計算得到，圖8d 顯示氧化結(jié)束時總氧化值的順序是TL0＞TH0＞TL＞TL1＞TH＞TH1。n-6/n-3PUFA 值較低的TH 的氧化穩(wěn)定性比n-6/n-3PUFA 較高的TL 好，脂肪酸組成和抗氧化成分均類似的TH1和TL1相比，仍然是n-6/n-3PUFA 較低的TH1氧化穩(wěn)定性更好。這表明對于脂肪酸組成和抗氧化成分均類似但n-6/n-3PUFA 不同的復(fù)配油來說，n-6/n-3PUFA值越低，氧化穩(wěn)定性可能越好。曹君[41]通過對不同脂肪酸組成的調(diào)和油氧化穩(wěn)定性進行分析，發(fā)現(xiàn)n-6PUFA 較高的調(diào)和油過氧化值增長往往較明顯，但并不是所有油樣都適用，猜測可能因為較高含量的n-3PUFA 會增加亞麻酸氫過氧化物的產(chǎn)生。

圖8 烘箱加速過程中酸價（a）、過氧化值（b）、茴香胺值（c）及總氧化值（d）的變化Fig.8 Change of acid value (a), peroxide value (b), p-anisidine values (c) and total oxidation value (d) during accelerated oxidation test

本研究結(jié)果顯示，預(yù)處理去除抗氧化成分后，復(fù)配油的氧化穩(wěn)定性指數(shù)顯著降低，烘箱加速后的脂肪酸組成變化明顯，酸價、過氧化值、茴香胺值等急劇增加。這表明內(nèi)源性抗氧化成分含量雖少，但對延緩植物油氧化過程起到了至關(guān)重要的作用。

3 結(jié)論

本實驗以氧化穩(wěn)定性指數(shù)和DPPH 自由基清除能力為指標(biāo)，研究了生育酚、多酚、甾醇、角鯊烯等主要抗氧化成分在復(fù)配油脂介質(zhì)中的單獨抗氧化能力和相互作用類型，并采用Schaal 烘箱加速氧化試驗評估復(fù)配油的氧化穩(wěn)定性。結(jié)果表明，生育酚和多酚單獨作用時抗氧化效果明顯，植物甾醇和角鯊烯單獨作用時則未顯現(xiàn)出顯著抗氧化效果。生育酚與多酚組合時呈現(xiàn)明顯的拮抗作用，生育酚和角鯊烯組合作用時，隨著生育酚和角鯊烯濃度的上升，呈現(xiàn)先拮抗后協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)生育酚含量大于480 mg/kg，角鯊烯的存在會顯著提高生育酚的抗氧化能力，其余組合低濃度下呈現(xiàn)拮抗作用，高濃度下多為相加作用。預(yù)處理去除抗氧化成分的復(fù)配油氧化穩(wěn)定性非常差，在SFA、MUFA 和PUFA 比例和抗氧化成分含量都相似的情況下，n-6/n-3PUFA 的值低的復(fù)配油氧化穩(wěn)定性更好。

本研究結(jié)果為內(nèi)源性抗氧化成分提高植物油氧化穩(wěn)定性的應(yīng)用提供參考依據(jù)，也為天然抗氧化劑的復(fù)配研究提供一定的科學(xué)指導(dǎo)。但由于植物油成分的復(fù)雜性，且內(nèi)源性抗氧化成分的濃度和比例等都可能對相互作用的類型和程度產(chǎn)生影響，因此它們之間的多元相互作用還有待進一步研究。