應(yīng)用多成分定量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析評(píng)價(jià)不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮質(zhì)量

張慧靜，陸勝民，朱衛(wèi)東，王佳俊，王陽(yáng)光,*

（1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所，浙江杭州 310021；3.衢州市農(nóng)業(yè)林業(yè)科學(xué)研究院，浙江衢州 324000）

柑橘為世界第一大栽培水果作物，在世界各地均有種植，目前全球年產(chǎn)量超億噸[1]，其中約有30%可通過加工成果汁、果凍、果醬等形式進(jìn)入消費(fèi)者視野[2]。但在柑橘果實(shí)的消費(fèi)和加工過程中易產(chǎn)生大量廢棄物，如果皮、果渣、籽等，其中果皮廢棄物占鮮果質(zhì)量比重最大，部分可作為動(dòng)物飼料處理，而大部分情況下被直接丟棄，對(duì)環(huán)境質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了一定程度的損失。

我國(guó)是柑橘的原產(chǎn)地之一，品種豐富，歷史悠久，栽培規(guī)模龐大。大量柑橘果皮中含有豐富的活性物質(zhì)，如黃酮類、生物堿類、檸檬苦素類、精油、膳食纖維[3]等，具有具有抗氧化[4-6]、抗癌[7]、抗病毒[8]、抗炎[9]，治療心血管疾病[10-11]、脾虛[12]、調(diào)節(jié)胃腸道疾病[13]等生物或藥理活性，在生物醫(yī)藥、食品保鮮和功能產(chǎn)品開發(fā)利用等領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，采收新鮮成熟的柑橘并將果皮經(jīng)過干燥加工后可制成陳皮，其具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，但質(zhì)量受到品種、加工條件、貯藏方法等條件的影響[14-15]。世人多認(rèn)為陳皮有“陳久者良”的特性，現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯藏時(shí)間的變化，陳皮中含有的活性物質(zhì)，如黃酮類、揮發(fā)性油類等成分表現(xiàn)出一定差異[16-20]，是導(dǎo)致該特性發(fā)生的內(nèi)因。

椪柑（Citrus reticulataBlanco cv，Ponkan）是我國(guó)長(zhǎng)期主栽的寬皮柑橘品種之一，主要分布在廣東、浙江、福建等地[21]。目前有學(xué)者對(duì)椪柑陳皮中黃酮類成分進(jìn)行了含量測(cè)定[15]，優(yōu)化了果膠提取工藝[22]，對(duì)其揮發(fā)性油成分進(jìn)行了含量測(cè)定和分析[23-24]，但未見有椪柑陳皮指紋圖譜的建立及多成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方面的報(bào)道。本研究以椪柑為研究對(duì)象，通過模擬加速陳化試驗(yàn)對(duì)新鮮成熟的椪柑果皮進(jìn)行加速陳化，以探究其中橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮（3,5,6,7,8,3',4'-heptamethoxyflavone，HMF）、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮（5-hydroxy-6,7,8,3',4'-pentamethoxyflavone，5-HPMF）、桔皮素、川陳皮素等8 種黃酮類成分含量變化情況，通過構(gòu)建指紋圖譜及多成分含量測(cè)定，結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析為椪柑陳皮質(zhì)量控制提供有力的支撐，研究黃酮類成分隨陳化時(shí)間變化的規(guī)律，以期為椪柑陳皮的質(zhì)量控制及造成不同陳化時(shí)長(zhǎng)陳皮質(zhì)量差異性的主要標(biāo)志物分析提供參考方法，為促進(jìn)椪柑果皮的高值化利用提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成熟椪柑鮮果 于2022 年12 月采自浙江省衢州市；3,5,6,7,8,3',4'-七甲氧基黃酮（HMF）、5-羥基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黃酮（5-HPMF）、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、桔皮素、川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸 均為色譜純，德國(guó)默克公司。

LC-2030C 3D Plus 高效液相色譜儀 日本SHIMADZU 公司；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；FA2204 型萬(wàn)分之一分析天平 常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；YD-150 型多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 選擇顏色均勻、大小相近、果形完整的新鮮椪柑果實(shí)，清洗外表皮，用白色毛巾擦干。利用四分法將果皮剖成大小一致的四片，取出果肉，將新鮮果皮放入熱風(fēng)干燥箱中，以模擬日曬時(shí)的溫度（30 ℃）干燥至水分含量低于13%。取出后粉碎并過60 目篩，取100 g 粉末置于溫度40 ℃、相對(duì)濕度80%的恒溫培養(yǎng)箱中加速陳化[25]，取加速0 d 時(shí)的樣品記為S1，之后每隔14 d 取樣一次，共進(jìn)行126 d，按取樣前后順序依次記為S2～S10。

1.2.2 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測(cè)定8 種成分含量

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取8 種標(biāo)準(zhǔn)品（HMF、5-HPMF、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、桔皮素、川陳皮素），用甲醇溶解并定容，分別得到對(duì)應(yīng)濃度為1.020、0.425、4.100、2.000、1.200、2.080、1.040、3.260 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液備用。

1.2.2.2 供試品溶液的制備 參考文獻(xiàn)[14]，精密稱取各樣品粉末0.2 g，加入20 mL 甲醇溶液并在室溫下超聲（350 W，40 kHz）處理30 min，靜置5～10 min后用甲醇補(bǔ)足缺失的重量，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相微孔濾膜過濾，濾液即為供試品溶液，置于4 ℃保存，待上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2.3 HPLC 色譜條件 HPLC 色譜條件[26]：色譜柱：SunFire C18柱（250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A 相）-0.1%磷酸水溶液（B 相）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為：283 nm（橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷）、310 nm（指紋圖譜）、330 nm（川陳皮素、HMF、桔皮素、5-HPMF）；梯度洗脫條件：0～15 min，20%A；15～35 min，20%～60% A；35～40 min，60%～100% A；40～42 min，100% A；42～45 min，100～20% A；45～50 min，20% A。

1.2.2.4 方法學(xué)考察 線性關(guān)系考察：精密吸取“1.2.2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液，使用甲醇稀釋成6 個(gè)濃度梯度，按“1.2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，其中檢測(cè)限和定量限分別為信噪比3:1 和10:1 時(shí)化合物的濃度。

精密度試驗(yàn)：取三個(gè)不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液按“1.2.2.3”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣3 次。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密稱取同一份椪柑陳皮樣品粉末，按“1.2.2.2”項(xiàng)下條件制備同一份供試品溶液，按“1.2.2.3”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2.5、5、10、15、25 h重復(fù)進(jìn)樣3 次。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一椪柑陳皮樣品粉末6 份，按“1.2.2.2”項(xiàng)下條件制備得到6 份供試品溶液，按“1.2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。

加樣回收率試驗(yàn)：精密稱取同一椪柑陳皮樣品粉末9 份，其中6 份分別加入一定體積的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，另外3 份加入相同體積的甲醇溶液作為空白參照，按“1.2.2.2”項(xiàng)下條件制備得到供試品溶液，按“1.2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。

1.2.3 HPLC 指紋圖譜的建立 將得到的色譜圖數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）》中，以出峰較好的S7 號(hào)樣品圖譜為參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度設(shè)為 0.1 min，采用多點(diǎn)校正法和色譜峰Mark 峰匹配分析法建立疊加指紋圖譜，使用平均數(shù)法得到對(duì)照指紋圖譜。

1.3 數(shù)據(jù)處理

Origin 2023 軟件（美國(guó)OriginLab 公司）繪制色譜圖；IBM SPSS Statistics 22（美國(guó)International Business Machines Corporation 公司）進(jìn)行方差分析、聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）；SIMCA 14.1（瑞典Umetrics 公司）軟件繪制主成分分析可視化圖，并進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），計(jì)算預(yù)測(cè)變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）；以VIP≥1 為條件篩選區(qū)分不同陳化時(shí)長(zhǎng)的差異標(biāo)志物。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系考察 以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），各組分峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），得到8 種成分的回歸方程和線性范圍，線性關(guān)系考察結(jié)果見表1，決定系數(shù)（R2）均＞0.9998，8 種化合物檢測(cè)限和定量限濃度均小于線性范圍，表明建立的方法在線性范圍內(nèi)準(zhǔn)確、可靠。

表1 線性關(guān)系考察Table 1 Investigation of linear relationship

2.1.2 精密度試驗(yàn) 以峰型對(duì)稱且響應(yīng)值較大的川陳皮素色譜峰為參照峰，測(cè)得8 種成分的相對(duì)保留（出峰）時(shí)間的RSD 值均分別小于0.380%、0.129%、0.288%，相對(duì)峰面積的RSD 值均分別小于0.138%、0.121%、0.173%，表明實(shí)驗(yàn)所用儀器精密度良好，具體見表2。

表2 精密度試驗(yàn)Table 2 Precision of the developed method

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以川陳皮素色譜峰為參照峰，測(cè)得8 種成分在4 ℃儲(chǔ)藏條件下25 h 內(nèi)的相對(duì)保留（出峰）時(shí)間RSD 值均小于0.905%，相對(duì)峰面積RSD 值均小于2.790%，表明供試品溶液在25 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，具體見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 Stability of the developed method

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 以川陳皮素色譜峰為參照峰，測(cè)得8 種成分在六份供試品溶液中相對(duì)保留（出峰）時(shí)間RSD 值均小于0.180%，相對(duì)峰面積RSD 值均小于0.976%，表明該分析方法重復(fù)性良好，具體見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 Repeatability of the developed method

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 對(duì)供試品溶液中8 種成分含量進(jìn)行計(jì)算，得到8 種成分的平均加樣回收率為99.901%～102.229%，RSD 值為0.472%～2.627%，表明該分析方法準(zhǔn)確度高，具體見表5。

表5 加樣回收率試驗(yàn)Table 5 Recovery data of the developed method

2.2 指紋圖譜的建立及相似度分析

2.2.1 指紋圖譜的建立及共有峰的指認(rèn) 將得到的10 批次椪柑陳皮數(shù)據(jù)文件以CDF 文件格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 年版）》中，按“1.2.2”項(xiàng)下條件得到10 批次椪柑陳皮疊加指紋圖譜以及對(duì)照指紋圖譜（R），見圖1。

圖1 10 批次加速陳化椪柑陳皮疊加指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜（R）Fig.1 HPLC fingerprint chromatograms of 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging and reference fingerprint chromatogram (R)

結(jié)果顯示，10 批椪柑陳皮的色譜圖中共匹配出32 個(gè)共有峰。通過與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液圖譜（圖2）對(duì)比，指認(rèn)出其中8 個(gè)具有重要藥理作用和研究意義的共有峰，依次為蕓香柚皮苷（11 號(hào)峰）、柚皮苷（13 號(hào)峰）、橙皮苷（14 號(hào)峰）、新橙皮苷（15 號(hào)峰）、川陳皮素（26 號(hào)峰）、HMF（30 號(hào)峰）、桔皮素（31 號(hào)峰）、5-HPMF（32 號(hào)峰）。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of mixed standard

2.2.2 相似度分析 以生成的對(duì)照指紋圖譜（R）為參照，對(duì)10 批次椪柑陳皮的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，分析結(jié)果見表6。10 批次樣品相似度均大于0.995，表現(xiàn)出較強(qiáng)的相似性，表明了不同陳化時(shí)長(zhǎng)得到的椪柑陳皮之間成分組成差異較小，椪柑陳皮整體質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定，建立的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，可用于監(jiān)測(cè)和綜合評(píng)價(jià)椪柑陳皮質(zhì)量。

2.3 8 種成分含量測(cè)定結(jié)果

精密稱取10 批次椪柑陳皮樣品粉末，按條件制備成供試樣品溶液并進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算8 種成分在樣品中的含量，結(jié)果以百分計(jì)（表7）。8 種黃酮類成分含量之間表現(xiàn)出一定的差異性，整體上可按含量大小排序依次為橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、5-HPMF、蕓香柚皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、HMF，其中橙皮苷含量最高，在7.0469%～5.5445%之間波動(dòng)變化，均大于《中國(guó)藥典》2020 年版一部中規(guī)定的陳皮標(biāo)準(zhǔn)（橙皮苷含量≥3.5%）；HMF 含量最低，在0.0132%～0.0171%之間波動(dòng)變化。

表7 10 批次椪柑陳皮中8 種成分含量（%）Table 7 Content determination of eight components in 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging (%)

從表7 可知，8 種黃酮類成分含量變化并非呈線性上升或下降趨勢(shì)，而是呈波動(dòng)變化，不同的加速陳化時(shí)長(zhǎng)對(duì)不同成分造成的動(dòng)態(tài)變化情況各不相同。

蕓香柚皮苷含量在S1～S5 號(hào)樣品中呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，并在S5 號(hào)樣品（即加速陳化56 d）中最大，在S6～S10 號(hào)等5 個(gè)樣品之間變化不顯著，但與S5 號(hào)相比呈極顯著降低（P＜0.01），與S1～S4 號(hào)樣品相比呈顯著上升，這與張?chǎng)蔚萚25]研究結(jié)果一致。HMF 含量在S7 號(hào)樣品（即加速陳化84 d）中最大，且與其他樣品差異顯著（P＜0.05）。與S1 號(hào)樣品相比，蕓香柚皮苷含量在其余樣品（除S3 號(hào)）中呈顯著上升（P＜0.05）；HMF 含量在S4、S5、S7、S8、S10 號(hào)等5 個(gè)樣品中含量呈顯著上升（P＜0.05），在S3、S6 號(hào)樣品中呈不顯著上升（P＞0.05）。因此蕓香柚皮苷、HMF含量在加速陳化的126 d 內(nèi)總體呈上升趨勢(shì)，分別在加速陳化的56 d 和84 d 達(dá)到最大。

新橙皮苷含量在S6 號(hào)樣品（即加速陳化70 d）中最大，且與其他樣品差異顯著（P＜0.05），在S1～S5號(hào)樣品等5 個(gè)樣品中呈波動(dòng)上升趨勢(shì)，在S7～S10 號(hào)等4 個(gè)樣品中呈波動(dòng)下降趨勢(shì)。因此新橙皮苷含量在加速陳化的126 d 內(nèi)總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在加速陳化的70 d 達(dá)到最大。

柚皮苷含量在10 個(gè)樣品間呈波動(dòng)下降趨勢(shì)，與S1 號(hào)樣品相比，其余9 個(gè)樣品均呈極顯著性差異（P＜0.01），在S9 號(hào)樣品（即加速陳化112 d）中最??；橙皮苷含量在S4 號(hào)樣品（即加速陳化42 d）中最小，且與S1、S6 號(hào)2 個(gè)樣品差異極顯著（P＜0.01）。與S1 號(hào)樣品相比，橙皮苷含量在S5、S6 號(hào)2 個(gè)樣品中呈不顯著下降趨勢(shì)（P＞0.05），在其余樣品中呈顯著下降（P＜0.05）。因此柚皮苷、橙皮苷含量在加速陳化的126 d 內(nèi)總體呈下降趨勢(shì)，分別在加速陳化的112和42 d 達(dá)到最小。

川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 含量均在S2 號(hào)樣品（即加速陳化14 d）中最小，且與其余樣品（除S9 號(hào)）差異顯著（P＜0.05）。與S1 號(hào)樣品相比，川陳皮素含量在S4、S6 號(hào)2 個(gè)樣品中呈不顯著降低趨勢(shì)（P＞0.05），在其余樣品中呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01）；桔皮素含量在S4 號(hào)樣品中呈不顯著降低（P＞0.05），在其余樣品（除S6 號(hào)）中呈極顯著降低（P＜0.01）；5-HPMF 含量在S6 號(hào)樣品中呈不顯著升高（P＞0.05），在S4、S7 號(hào)2 個(gè)樣品中呈不顯著降低（P＞0.05），在其余樣品中呈極顯著下降趨勢(shì)（P＜0.01）。因此川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 等三種化合物含量在加速陳化的126 d 內(nèi)總體呈下降趨勢(shì)，在加速陳化的14 d達(dá)到最小。

綜上，在加速陳化的126 d 內(nèi)，蕓香柚皮苷和HMF 兩種成分含量總體呈上升趨勢(shì)，分別在加速陳化的56、84 d 達(dá)到最大；新橙皮苷含量呈先上升后下降趨勢(shì)，在加速陳化的70 d 達(dá)到最大；柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 等五種成分呈下降趨勢(shì)，其中柚皮苷、橙皮苷含量分別在加速陳化的112、42 d 達(dá)到最小，川陳皮素、桔皮素、5-HPMF等三種化合物含量均在加速陳化的14 d 達(dá)到最小。

2.4 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.4.1 HCA 分析 以10 批次椪柑陳皮樣品中8 種成分含量為變量，采用離差平方和法（Ward 法）聯(lián)結(jié)、平方歐式距離為度量標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)10 批次椪柑陳皮樣品進(jìn)行聚類，得到分析樹狀圖（圖3）。由圖3 可知，當(dāng)判別距離為10 時(shí)，10 批次椪柑陳皮樣品可分為兩類，其中S1、S5、S6 號(hào)聚為一類，其他樣品聚為另一類。這說(shuō)明不同陳化時(shí)間對(duì)椪柑陳皮類黃酮成分變化有一定的影響，其中加速陳化56 d、70 d 與陳化0 d 椪柑陳皮成分的變化較為接近，其他陳化時(shí)長(zhǎng)的椪柑陳皮成分變化較為接近。

圖3 10 批次加速陳化椪柑陳皮聚類分析樹狀圖Fig.3 Hierarchical cluster analysis of 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging

2.4.2 PCA 分析 將10 批次批椪柑陳皮8 種成分含量導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中，得到PCA 分析結(jié)果圖（圖4）。共得到3 個(gè)主成分，累計(jì)Rx2=0.857，表明建立的主成分分析模型擬合度較好。由得分矩陣圖可知，所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，不同加速陳化時(shí)長(zhǎng)的椪柑陳皮樣品區(qū)分明顯，其中S1、S5、S6 號(hào)樣品與聚集中心的偏離程度較高，這與聚類分析的結(jié)果一致。

圖4 10 批次加速陳化椪柑陳皮主成分得分圖Fig.4 Principal component scores of 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging

將8 種成分含量導(dǎo)入至IBM SPSS Statistics 22 軟件中，結(jié)果提取得到3 個(gè)特征值大于1 的主成分，主成分的特征值及其方差貢獻(xiàn)率見表8。前3 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為85.740%（＞85%），說(shuō)明提取的3 個(gè)主成分可代表10 批次椪柑陳皮的大部分信息。其中5-HPMF、桔皮素、川陳皮素、柚皮苷和橙皮苷在主成分1 上有較高的載荷；新橙皮苷、蕓香柚皮苷在主成分2 上有較高的載荷，而HMF 在主成分3 上有較高的載荷，具體見表9。載荷的絕對(duì)值越大，表明因子對(duì)主成分的貢獻(xiàn)越明顯，對(duì)區(qū)分樣品的影響越大，這表明以上成分是造成不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮成分含量變化差異性的主要成分。

表8 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 8 Eigenvalues and variance contribution

表9 因子載荷矩陣Table 9 Component matrix

2.4.3 OPLS-DA 分析 為更好地體現(xiàn)不同陳化時(shí)長(zhǎng)的10 批次椪柑陳皮樣品間差異性，進(jìn)一步做了有監(jiān)督模式的正交偏最小二乘判別分析識(shí)別[27]，并篩選出對(duì)組間差異貢獻(xiàn)率較大的成分。以10 批次椪柑陳皮8 種主要成分含量為變量將其導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，進(jìn)行OPLS-DA 建模分析，通過自動(dòng)擬合建立模型，得分圖如圖5 所示。從圖5 可以看出，S1、S5、S6 號(hào)樣品與其他樣品之間區(qū)分明顯。本次分析匯總的自變量擬合指數(shù)（Rx2）為0.674，因變量擬合指數(shù)（Ry2）為0.922、模型預(yù)測(cè)指數(shù)（Q2）為0.508，R2和Q2均大于0.5，表明本次模型擬合結(jié)果可接受。

圖5 10 批次加速陳化椪柑陳皮OPLS-DA 得分圖Fig.5 OPLS-DA scores of 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging

變量重要性投影（Variable Importance in Projection，VIP）值是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，其數(shù)值越大，對(duì)組間差異的影響越大。通過對(duì)VIP 值進(jìn)行分析，得到差異性標(biāo)志物的VIP 得分圖（圖6）。以VIP 值≥1 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到4 個(gè)差異性化合物并根據(jù)VIP 值大小依次排序?yàn)槌绕ぼ铡⑿鲁绕ぼ铡?-HPMF、桔皮素，表明這4 種成分對(duì)不同陳化時(shí)長(zhǎng)的椪柑陳皮質(zhì)量產(chǎn)生的影響最大，是區(qū)分不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮差異性的主要標(biāo)志物。

圖6 10 批次加速陳化椪柑陳皮8 種成分VIP 得分圖Fig.6 VIP scores for 8 components of 10 batches of Ponkan Chenpi during accelerated aging

3 討論與結(jié)論

在陳皮貯藏陳化的過程中，黃酮類等成分含量發(fā)生了相應(yīng)的變化，部分學(xué)者認(rèn)為橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、HMF、5-HPMF 五種成分通常隨陳化時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)[28]，但研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)橙皮苷含量下降時(shí)，桔皮素含量反而升高[29]，同時(shí)有研究表明部分成分含量隨陳化時(shí)長(zhǎng)的變化呈波動(dòng)變化[30]。本研究中，8 種黃酮類成分中柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 等五種成分含量在陳化階段呈下降趨勢(shì)，而蕓香柚皮苷、HMF 兩種成分含量在呈上升趨勢(shì)，新橙皮苷含量呈先上升后下降的趨勢(shì)，這與部分學(xué)者的研究結(jié)果一致。研究表明能夠有效水解橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷等黃酮類化合物的α-L-鼠李糖苷酶在30～60 ℃具有較高的酶活[31]，該酶可通過柚皮苷[32]、橙皮苷[33]等物質(zhì)誘導(dǎo)微生物產(chǎn)生。本研究設(shè)置的加速陳化溫度為40 ℃，因此推測(cè)在長(zhǎng)期陳化的過程中，α-L-鼠李糖苷酶誘導(dǎo)產(chǎn)生的微生物、酶自身活性和含量發(fā)生變化等因素導(dǎo)致了橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷含量降低。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)通過接種從陳皮中分離純化得到的黑曲霉能夠使陳皮中川陳皮素、桔皮素等成分含量上升[34-35]，而川陳皮素、桔皮素、5-HPMF、HMF 均屬于多甲氧基黃酮[36]。在本研究中HMF 含量升高，川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 含量下降，推測(cè)在陳化過程中濕度、溫度等環(huán)境因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶種類及活性也產(chǎn)生了一定影響，從而使得HMF 含量升高，而川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 含量下降，但具體是何種條件通過何種途徑對(duì)何種酶產(chǎn)生的影響尚不明確。香石竹中含有的糖基轉(zhuǎn)移酶可以利用活化的UDP-葡萄糖使柚皮素向蕓香柚皮苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化[37]，柑橘類植物中同樣含有黃烷酮-7-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，可促進(jìn)黃烷酮-7-O-葡萄糖苷類化合物生物合成[38-39]，據(jù)此可推測(cè)在椪柑陳皮中可能含有糖基轉(zhuǎn)移酶，能夠促進(jìn)柚皮素等其他黃酮類成分向蕓香柚皮苷進(jìn)行轉(zhuǎn)化，從而使得蕓香柚皮苷含量升高。

通過聚類分析將10 批次椪柑陳皮樣品分為兩類，其中加速陳化56 d、70 d 與陳化0 d 的樣品聚為一類，其他加速時(shí)長(zhǎng)的樣品聚為另一類，聚類結(jié)果并非按照陳化時(shí)長(zhǎng)依次進(jìn)行聚類。這與李曉芳等[40]對(duì)貯藏1～10 年的廣陳皮聚類分析結(jié)果一致，無(wú)論是廣陳皮或是椪柑陳皮，陳化時(shí)長(zhǎng)是造成陳皮成分及質(zhì)量發(fā)生變化的影響因素之一。現(xiàn)有研究表明在陳化過程中，微生物群落的代謝轉(zhuǎn)化使得陳皮中含有的化學(xué)成分發(fā)生一定的變化[41]，而不同陳化時(shí)長(zhǎng)、條件導(dǎo)致了陳皮樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬表現(xiàn)出差異性[42-44]，由此可推測(cè)不同品種陳皮優(yōu)勢(shì)菌同樣是造成陳皮成分及質(zhì)量發(fā)生變化的因素之一。通過主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，對(duì)區(qū)分10 批次椪柑陳皮陳化時(shí)長(zhǎng)差異性的主要標(biāo)志物進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)橙皮苷、新橙皮苷、5-HPMF 和桔皮素等4 種成分是區(qū)分不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮的主要標(biāo)志物。

本研究對(duì)不同陳化時(shí)長(zhǎng)的椪柑陳皮進(jìn)行指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析，建立了椪柑陳皮指紋圖譜，10 批次椪柑陳皮共標(biāo)定出32 個(gè)共有峰，指紋圖譜相似度大于0.995，表明不同陳化時(shí)長(zhǎng)下的椪柑陳皮質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定；建立了準(zhǔn)確度性高、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好的柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、5-HPMF、蕓香柚皮苷、HMF 等8 種黃酮類成分含量測(cè)定方法，結(jié)果顯示不同黃酮類成分含量在加速陳化的126 d 內(nèi)呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)，蕓香柚皮苷和HMF 兩種成分含量呈上升趨勢(shì)，新橙皮苷呈先上升后下降趨勢(shì)，柚皮苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素、5-HPMF 等五種成分呈下降趨勢(shì)。

通過HCA 分析可將10 批次椪柑陳皮樣品分為兩類，加速陳化0、56、70 d 的三批次樣品聚為一類，其他批次樣品聚為一類；PCA 分析共提取出三個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為85.740%，可解釋10 批次椪柑陳皮樣品大部分信息；OPLS-DA 分析確定了橙皮苷、新橙皮苷、5-HPMF 及桔皮素等四種成分是區(qū)分不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮的差異性標(biāo)志物。另外分析結(jié)果表明多成分定量結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析方法適用于不同陳化時(shí)長(zhǎng)椪柑陳皮的指紋圖譜研究和多成分含量測(cè)定，可為椪柑陳皮的陳化時(shí)長(zhǎng)、貯藏條件等研究提供參考，為椪柑果皮資源的開發(fā)與利用提供理論參考。此外，本實(shí)驗(yàn)在陳化時(shí)長(zhǎng)設(shè)置、樣品基源批次以及檢測(cè)手段方面具有一定的局限，8 種黃酮類成分含量變化結(jié)果并不能得出“陳久者良”的結(jié)論，而且部分成分未得到有效指認(rèn)，因此上述成分的變化情況與“陳久者良”之間的相關(guān)性需要結(jié)合其他檢測(cè)手段對(duì)陳皮中揮發(fā)性油成分和含量變化、微生物群落分布情況等作進(jìn)一步分析驗(yàn)證。