興安升麻醇提物成分分析及基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討其促進皮膚傷口愈合的作用機制

李艷娜，張富源，程偉峰，桑亞新，王向紅,*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，河北保定 071000；2.河北雅果食品有限公司，河北保定 071000）

升麻屬植物為毛茛科多年生草本植物，約有10 余種主產(chǎn)于我國各地[1]。升麻在我國是一種常用中藥，也是藥食同源目錄中的一種食物，為大三葉升麻、興安升麻和升麻的干燥根莖。由于其具備成本較低、毒副作用較小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，三個升麻品種均被收錄于2015 年版《中國藥典》[2]。其中，興安升麻又名為苦老芽、窟窿牙，在我國廣泛分布于內(nèi)蒙古、山西、河北、遼寧和黑龍江等地[3]。作為一種藥用植物，興安升麻具有清熱解毒、發(fā)表透疹等功效，常被用于治療咽喉腫痛、風熱頭痛、子宮脫垂等病癥[2]。它又是一種純天然的山野菜，將剛生長出的嫩芽制作后食用，入口微苦、先苦后甜，有良好清熱敗火、抗菌消炎功效，食療效果較好[4-7]，具有較高研究價值。

研究發(fā)現(xiàn)，升麻屬植物中富含多種活性成分，具有重要的藥理活性功能，如抗病毒、抗炎、抗骨質(zhì)疏松、治療婦女更年期綜合癥等[8-10]，在維護人體健康及防治相關(guān)疾病方面具有較高的研究價值。升麻屬植物中酚酸類、萜類等化合物是較好的抗炎活性成分，如阿魏酸、異阿魏酸等。我國每年約有超過1000 萬人遭受皮膚創(chuàng)傷，當皮膚受損后，皮膚的完整性及功能性會受到破壞，迫使血管破裂、引發(fā)炎癥反應(yīng)、造成機體的感染，甚至危及生命[11-12]。因此，作為連接機體與外界環(huán)境的第一關(guān)，快速修復(fù)皮膚創(chuàng)傷至關(guān)重要[13]。但是傷口愈合的速度及愈合質(zhì)量會受到諸多因素的影響，其中，傷口炎癥、細菌感染是影響傷口愈合的重要因素之一。前期研究發(fā)現(xiàn)，具有良好抗菌消炎作用的興安升麻能夠有效促進傷口愈合，嚴格防止細菌感染[14]，但是由于其成分復(fù)雜，對于發(fā)揮藥效活性成分群及作用機制尚不清晰。

網(wǎng)絡(luò)藥理學是一門多學科技術(shù)和內(nèi)容相結(jié)合的交叉學科，通過分析生物網(wǎng)絡(luò)解釋藥物成分與疾病靶點之間的復(fù)雜關(guān)系，并揭示其作用機制[15-16]。Deng等[15]探索了桔梗治療肺癌的潛在作用機制，表明桔梗可能是通過MAPK 和P13K-AKT 等潛在信號通路來治療肺癌?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學研究發(fā)現(xiàn)桃紅四物湯主要通過抑菌作用及改善血液流變學等途徑，治療關(guān)節(jié)置換后假體周圍感染[17]。因此，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學方法分析藥物與機體之間的關(guān)系已經(jīng)受到研究者的廣泛關(guān)注，逐漸成為研究熱點，但尚未見與基于網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測興安升麻作用機制的相關(guān)研究。

由于興安升麻發(fā)揮促進皮膚傷口愈合功效的活性成分及作用機制尚不明確，本研究以興安升麻為原料，采用醇提法提取生物活性物質(zhì)，并通過HPLCMS 技術(shù)分析鑒定興安升麻醇提物的活性化學成分。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學進一步分析預(yù)測其促愈作用機制，以期為興安升麻的開發(fā)與應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

興安升麻（Cimicifuga dahurica(Turcz.) Maxim.） 購于河北省張家口市，多年生草本植物；無水乙醇 純度≥95.0%，天津市富宇精細化工有限公司；乙腈 純度≥99.9%，上海拜力生物科技有限公司；甲酸 色譜純，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲酸銨 純度≥99.9%，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。

RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；FD5-2.5 型真空冷凍干燥機 SIM 儀器有限公司；H1850-R 型冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；U3000 型液相色譜儀、QE Focus 高分辨質(zhì)譜儀 賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 興安升麻活性物質(zhì)的提取 將興安升麻凍干，粉碎，過60 目篩。稱取5 g 粉末，加入60 mL 78%乙醇混合均勻，在室溫條件下醇提3 次，每次靜置提取12 h。將醇提液合并、過濾，8000 r/min 離心5 min，收集上清液于37 ℃下旋蒸除去乙醇，再經(jīng)冷凍干燥，最終獲得醇提物干粉。

1.2.2 化學成分的鑒定 通過HPLC-MS 檢測，根據(jù)精確分子量及數(shù)據(jù)庫篩選分析興安升麻醇提物的化學成分，并應(yīng)用面積歸一法進行定量[18]。

1.2.2.1 色譜條件 采用ACQUITY UPLC? HSS T3（2.1 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，自動進樣器溫度設(shè)為8 ℃，以0.25 mL/min 的流速，40 ℃的柱溫，進樣2 μL 進行梯度洗脫，流動相為正離子0.1%甲酸水（C）-0.1%甲酸乙腈（D）；負離子5 mmol/L 甲酸銨水（A）-乙腈（B）。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件 儀器使用電噴霧離子源（ESI），正負離子電離模式，正離子噴霧電壓為3.50 kV，負離子噴霧電壓為2.50 kV，鞘氣30 arb，輔助氣10 arb。毛細管溫度325 ℃，以分辨率70000 進行全掃描，掃描范圍81～1000 aum。

1.2.3 靶點的篩選及預(yù)測 利用Pubchem 數(shù)據(jù)庫獲取興安升麻化學成分的結(jié)構(gòu)，將其導入SwissADME數(shù)據(jù)庫，以“胃腸道吸收為高且類藥性滿足兩個條件”為標準，并結(jié)合文獻篩選出有效成分，并根據(jù)靶點可能性通過SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫篩選及預(yù)測有效成分的潛在靶點，再利用UniProt 蛋白數(shù)據(jù)庫篩選出具有相應(yīng)基因的有效靶點。以“皮膚傷口（skin wound）”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards、OMIM及DrugBank 數(shù)據(jù)庫搜索與此相關(guān)的疾病靶點。將其與興安升麻的有效靶點進行匹配，得到興安升麻促進皮膚傷口愈合的相關(guān)靶點。

1.2.4 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 采用Cytoscape3.9.0 軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并進行可視化分析。其中，節(jié)點分別代表藥物、有效成分、皮膚傷口及靶點，邊代表節(jié)點之間的相互關(guān)系。

1.2.5 蛋白互相作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將交集靶點導入String 數(shù)據(jù)庫，進行蛋白互相作用分析，以得分≥0.7 為標準篩選相互作用關(guān)系，并根據(jù)degree 值篩選出前20 個靶點作為核心靶點；將其導入Cytoscape軟件，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.6 生物功能的分析 利用DAVID 數(shù)據(jù)庫對核心靶點進行GO 和KEGG 富集分析，得到興安升麻促進皮膚傷口愈合的主要作用通路；并將結(jié)果導入微生信平臺構(gòu)建富集分析結(jié)果圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行分析，通過Proteowizard 軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML 格式，利用XCMS 程序包進行峰識別、峰過濾、峰對齊。根據(jù)精確分子量（分子量誤差為≤30 ppm）、保留時間等進行物質(zhì)鑒定，后續(xù)根據(jù)MS/MS 碎片模式對HMDB、METLIN、Massbank、LipidMaps、mzClound、以及帕諾米克自建標準品數(shù)據(jù)庫確認注釋獲得活性物質(zhì)，并采用面積歸一化法測定各成分的相對含量。通過數(shù)據(jù)庫篩選并預(yù)測成分、疾病靶點相關(guān)信息，利用Cytoscape3.9.0 軟件、微生信平臺分析篩選結(jié)果并繪圖。SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫（http://swisstargetprediction.ch/）；SwissADME 數(shù) 據(jù) 庫（http://www.swissadme.ch/）；PubChem 數(shù)據(jù)庫（http://pubmed.cn/）；UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）；GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫（ https://www.genecards.org/） ；OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）；DrugBank數(shù) 據(jù) 庫（https://go.drugbank.com/）；String 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.omim.org/）；DAVID 數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）；Cytoscape3.9.0 軟件；微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/en）。

2 結(jié)果與分析

2.1 醇提物化學成分結(jié)果分析

本研究從興安升麻中共鑒定出125 種化學成分（表1），其中萜類（24.05%）、苯丙素類（23.23%）和酮類（20.61%）化合物占比較高，另外還鑒定到酚類（6.69%）、生物堿類（5.16%）、糖類（3.03%）、醌類（1.98%）、香豆素類（1.60%）和木脂素類（1.01%）等化合物。共有21 種化學成分相對含量大于1%，主要包括隱綠原酸（10.52%）、綠原酸（10.27%）、白術(shù)內(nèi)脂III（8.46%）、莪術(shù)二酮（5.10%）、5-羥甲基糠醛（4.77%）、高車前素（4.73%）等，其中隱綠原酸、綠原酸為苯丙素類化合物，白術(shù)內(nèi)脂III 與莪術(shù)二酮為萜類化合物；升麻屬植物主要生物活性成分為苯丙素類化合物、三萜皂苷或其苷元，以及色酮類、生物堿類、糖類、含氮化合物等[19-21]。多酚類、酮類、生物堿類等部分化合物具有顯著的抗炎功效，能夠在傷口愈合過程中發(fā)揮作用[22-23]。

表1 興安升麻醇提物化學成分Table 1 Chemical compositions of alcohol extracts from Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.

2.2 靶點篩選結(jié)果分析

對興安升麻活性成分的定性定量分析并不能確切證明其療效，也難以確定發(fā)揮治療功效的有效成分及作用機制，因此基于網(wǎng)絡(luò)藥理學進行靶點篩選及預(yù)測，進而分析其促愈作用機制。

2.2.1 化學成分靶點篩選及預(yù)測結(jié)果 對興安升麻的125 種化學成分進行類藥性篩選，并查閱文獻[24-25]，保留可能與“促進皮膚傷口愈合”相關(guān)性較高的化學成分，最終篩選共得到99 種有效成分，并篩選及預(yù)測到860 個目標靶點。

2.2.2 疾病靶點篩選及預(yù)測結(jié)果 以“skin wound”為關(guān)鍵詞，利用GeneCards、OMIM 和DrugBank 數(shù)據(jù)庫分別篩選出622、215 和44 個疾病靶點，經(jīng)整理去重后獲得804 個相關(guān)靶點。

2.2.3 成分-疾病交集靶點篩選結(jié)果 由圖1 可知，興安升麻有效成分靶點與皮膚傷口靶點取交集后共得到159 個交集靶點，其為興安升麻促進皮膚傷口愈合的相關(guān)靶點。

圖1 “成分-疾病”靶點Veen 圖Fig.1 Veen diagram of "component-disease" targets

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建結(jié)果分析

對興安升麻有效成分進行編碼（表2），將藥物、成分、疾病及靶點關(guān)系導入Cytoscape3.9.0 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。如圖2 所示，去除相互作用較弱的游離點，圖中共有256 個節(jié)點，粉色箭頭狀節(jié)點代表興安升麻，紫色圓形節(jié)點代表95 種有效成分，綠色箭頭狀節(jié)點代表皮膚傷口，藍色圓形節(jié)點代表159 個靶點；1049條邊代表節(jié)點之間的相互關(guān)系。分析發(fā)現(xiàn)，興安升麻中不同的有效成分可作用于一個或多個靶點，說明興安升麻的多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性。以Degree 值為判斷標準（Degree 值≥25），前20 種與靶點相關(guān)性較強的興安升麻莖葉有效成分包括：橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素、高車前素、甘草查爾酮B、內(nèi)華達素、甜橙黃酮、艾黃素、金腰乙素、異澤蘭黃素、異鼠李素、柳穿魚素、大黃素-甲醚、芥子酸、蔓荊子黃素、美迪紫檀素、紫膠桐酸、二氫白藜蘆醇、木蘭花堿、木香內(nèi)酯，這些物質(zhì)大多數(shù)為酮類化合物，還有少量的苯丙素類、生物堿類及酚類化合物。以Degree 值為判斷標準（Degree 值≥18），前20 個與興安升麻莖葉有效成分相關(guān)性較強的靶點包括：CYP19A1、EGFR、MMP13、MMP2、ABCB1、 MMP12、 PTGS2、 MMP9、 TYR、 MET、ALOX5、CYP1B1、ESR1、MMP1、TERT、KDR、SRC、MMP8、F2、AR。其中，EGFR、KDR、F2 靶點可能在此過程中發(fā)揮重要作用。

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果分析

根據(jù)興安升麻促進皮膚傷口愈合的作用靶點，結(jié)合他們之間的蛋白相互作用，利用Cytoscape3.9.0構(gòu)建交集靶點的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。如圖3a 所示，圖中共有150 個節(jié)點代表不同靶點，1300 條邊代表靶點間的相互關(guān)系，圖中節(jié)點由大到小、顏色由紫到黃代表節(jié)點degree 值逐漸減小。如圖3b 所示，排名前20 的PPI 核心靶點依次為：SRC、STAT3、EGFR、HRAS、TP53、AKT1、MAPK3、CTNNB1、PIK3R1、VEGFA、TNF、PIK3CA、MAPK1、JUN、IL1B、NRAS、MAPK8、RELA、MMP9、PTK2，這些靶點可能在興安升麻促進皮膚傷口愈合靶標網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。

圖3 “成分-疾病”PPI 分析網(wǎng)絡(luò)圖（a）和核心靶點網(wǎng)絡(luò)圖（b）Fig.3 Network diagram (a) and core target network diagram (b) of the PPI analysis of ''component-disease''

2.5 GO 和KEGG 富集結(jié)果分析

如圖4 所示，對核心靶點進行GO 富集分析，選取顯著性較強的前15 條相關(guān)聯(lián)術(shù)語做可視化分析，從左到右P值逐漸增大、顯著性逐漸減弱；柱狀圖的長度越長，富集的差異基因數(shù)量越多。

圖4 核心靶點GO 富集分析圖Fig.4 GO enrichment analysis of core targets

結(jié)果表明，在生物過程方面，共有221 條相關(guān)聯(lián)術(shù)語，主要參與蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）、ERBB2 信號通路（ERBB2 signaling pathway）、Fc-ε受體信號通路（Fc-epsilon receptor signaling pathway）、凋亡過程的負調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）、表皮生長因子受體信號通路（epidermal growth factor receptor signaling pathway）等過程；在細胞組件方面，共有29 條相關(guān)聯(lián)術(shù)語，主要存在于胞漿（cytosol）、細胞核（nucleus）、粘著斑（focal adhesion）、蛋白質(zhì)復(fù)合物（protein complex）、細胞膜（caveola）等組件中；在分子功能方面，共有44 條相關(guān)聯(lián)術(shù)語，主要涉及相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、蛋白磷酸酶結(jié)合（protein phosphatase binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）等分子功能。

將核心靶點進行KEGG 通路富集分析，共富集到106 條相關(guān)聯(lián)通路，如圖5 所示，選取顯著性較強的前20 條通路做可視化分析，顏色由粉到藍代表P值逐漸增大、顯著性逐漸減弱；圓形圖越大，富集的差異基因個數(shù)越多。結(jié)果顯示，富集到的相關(guān)信號通路主要包括癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（Hepatitis B）、癌癥的途徑（Pathways in cancer）、ErbB 信號通路（ErbB signaling pathway）、丙型肝炎（Hepatitis C）、胰腺癌（Pancreatic cancer）、催乳素信號通路（Prolactin signaling pathway）、子宮內(nèi)膜癌（Endometrial cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、VEGF 信號通路（VEGF signaling pathway）、粘著斑（Focal adhesion）、雌激素信號通路（Estrogen signaling pathway）、TNF 信號通路（TNF signaling pathway）等。認為經(jīng)興安升麻介導后，VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調(diào)控相關(guān)因子和蛋白的表達，在促進皮膚傷口愈合方面發(fā)揮重要作用。

圖5 核心靶點KEGG 富集分析圖Fig.5 KEGG enrichment analysis of core targets

3 討論與結(jié)論

興安升麻在我國資源豐富，種植廣泛，作為一種藥食同源植物在河北地區(qū)深受人們喜愛。前期研究發(fā)現(xiàn)，興安升麻能夠有效促進皮膚傷口愈合[14]。皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一項復(fù)雜而精密的動態(tài)過程，利用信號網(wǎng)絡(luò)進行精準的執(zhí)行和調(diào)控；而網(wǎng)絡(luò)藥理學是一個基于信息檢索、數(shù)據(jù)分析及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的領(lǐng)域。因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學進一步分析了興安升麻對皮膚傷口的促愈機制，發(fā)現(xiàn)興安升麻的多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性；其中橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素等成分可能在促進皮膚傷口愈合過程中發(fā)揮重要作用。已有研究證實以橘皮素為主要多酚物質(zhì)的小花山奈具有抗氧化和抗炎活性，能夠抗皮膚炎癥[26]；山姜素能夠有效減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥，并改善小鼠腸上皮屏障功能[27]；5-去甲川陳皮素也具有抗炎活性，能夠抑制小鼠耳部炎癥的形成及損傷[28]?！八幬?成分-疾病-靶點”分析發(fā)現(xiàn)EGFR、KDR、F2 靶點也在此過程中發(fā)揮重要作用。EGFR 基因提供了制造表皮生長因子受體的受體蛋白的指令，能夠促進細胞的生長繁殖[29]；KDR 基因所編碼的蛋白VEGFR-2，是血管生長因子重要信號轉(zhuǎn)導的重要受體，具有調(diào)控血管內(nèi)皮細胞增生、趨化內(nèi)皮細胞和增加血管通透性等功能[30]；F2 基因提供了制造凝血酶原的蛋白質(zhì)的指令，對細胞生長和分裂、組織修復(fù)和新血管形成、血液凝固具有重要作用[31]。通過靶點與疾病的相關(guān)分析，認為VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調(diào)控相關(guān)因子和蛋白的表達，在促進皮膚傷口愈合方面發(fā)揮重要作用。VEGF信號通路是調(diào)控心血管生成的重要信號通路，調(diào)控與新血管生成相關(guān)的下游基因，促進血管內(nèi)皮細胞的增殖、遷移、存活，控制心血管的生成，促進皮膚傷口愈合[32-33]。EGFR 信號通路可以促進表皮細胞、成纖維細胞的增殖和其他生長因子的合成，進而加速皮膚傷口表皮的愈合與再生[34-35]。TNF 信號通路通過調(diào)控炎癥因子和相關(guān)蛋白的表達，進而實現(xiàn)傷口清創(chuàng)及愈合[36]。

本研究通過HPLC-MS 檢測興安升麻醇提物的化學成分，從中共鑒定出125 種化學成分，其中包括大量萜類、苯丙素類、酮類、酚類化合物，以及生物堿類、糖類、醌類、香豆素類和木脂素類等化合物，且隱綠原酸、綠原酸、白術(shù)內(nèi)脂III 為含量最高的三種活性成分。進一步基于網(wǎng)絡(luò)藥理學預(yù)測其促愈保護作用，結(jié)果表明興安升麻中的活性成分可作用于一個或多個靶點，EGFR、KDR、F2 等重要靶點及橘皮素、山姜素、5-去甲川陳皮素等活性成分可能在此過程中發(fā)揮重要作用，說明興安升麻多成分、多靶點作用于促進皮膚傷口愈合的特性；經(jīng)興安升麻介導后，VEGF、EGFR 和TNF 信號通路可能通過調(diào)控相關(guān)因子和蛋白的表達，發(fā)揮對皮膚傷口的促愈作用。本研究結(jié)果明確了興安升麻的活性成分，并基于網(wǎng)絡(luò)藥理學分析了其對皮膚傷口的促愈作用機制，為后續(xù)對興安升麻的開發(fā)與應(yīng)用提供理論支撐。