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    雞肝臟中能量代謝相關(guān)膜蛋白基因及其上游轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定

    2022-02-10 13:30:50皮勁松龔炎長(zhǎng)潘愛(ài)鑾梁振華
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年24期
    關(guān)鍵詞:熒光素酶引物肝臟

    申 杰,李 剛,黃 濤,皮勁松,龔炎長(zhǎng),潘愛(ài)鑾,吳 艷,張 昊,付 明,梁振華

    (1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/動(dòng)物胚胎與分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064;2.湖北農(nóng)墾對(duì)外經(jīng)濟(jì)交流中心,武漢 430064;3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430064)

    雞肝臟在能量代謝、消化和免疫方面發(fā)揮著多種作用,易受到氧化應(yīng)激,如急性熱應(yīng)激和空腹應(yīng)激[1-4],直接影響其生產(chǎn)性能??缰|(zhì)分子層膜蛋白(Tran membrane protein,TMEMs)代表一類(lèi)橫跨脂質(zhì)雙分子層的膜蛋白[5],可以在各種細(xì)胞膜上擴(kuò)散,包括線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和高爾基體膜,并控制特定物質(zhì)在生物膜上的運(yùn)輸。因此,TMEMs參與細(xì)胞的生理生化過(guò)程,對(duì)細(xì)胞功能的維持具有重要作用。

    近年來(lái),研究發(fā)現(xiàn)TMEMs可作為癌癥生物標(biāo) 志 物(如TMEM45A、TMEM116、TMEM207和TMEM213)[6],也可作為抑癌基因(如TMEM25和TMEM7)[7,8],還可作為促癌基因(如TMEM158和TMEM14A)[9,10]。TMEMs在 腫瘤 研 究領(lǐng) 域 相對(duì) 較多,且具有重要功能。本研究利用前期雞肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[11],挑選了8個(gè)TMEMs基因,檢測(cè)其在肝臟中的表達(dá)變化,預(yù)測(cè)及鑒定其上游轉(zhuǎn)錄因子。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

    將海蘭褐隨機(jī)分為限飼組(n=10)和自由采食組(n=10)。對(duì)于限飼組,每只雞每天投料量40~50 g,而對(duì)于自由采食組,料槽不斷料。飼養(yǎng)的肉仔雞和蛋仔雞在6周齡時(shí)處死,采集肝臟組織保存。

    1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

    使用TRIzol試 劑(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)提取總RNA。通過(guò)ND-2000型分光光度計(jì)(Nano-Drop公司)和1%瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估RNA濃度和純度。使用Prime Script RTReagent Kit(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)反轉(zhuǎn)錄,1μg總RNA與1.0μL gDNA Eraser和2μL 5×gDNA Eraser緩沖液混合,42℃孵育2 min,以消除基因組DNA。將1μL Prime Script RT酶混合物、4μL 5×Prime Script緩沖液、1μL RT引物混合物和4μL Raze-free水加到混合物中,37℃保溫15 min,85℃保溫5 s,然后4℃終止反應(yīng)。cDNA產(chǎn)物保存于-20℃。

    1.3 RT-qPCR

    在Bio-Rad CFX96系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)上使用SuperReal PreMix(SYBR Green)(天根生化科技(北京)有限公司)分析基因的表達(dá)水平,所設(shè)計(jì)引物見(jiàn)表1。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù),以雞GAPDH基因?yàn)閰⒄眨褂?-ΔΔCT方法計(jì)算表達(dá)量。

    表1 RT-qPCR檢測(cè)的引物序列

    1.4 細(xì)胞的培養(yǎng)

    雞胚原代肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[12,13]。孵育15 d的雞胚30個(gè),取出肝臟并切碎,用1×PBS溶液洗滌,然后用膠原酶IV(BIOFROX公司)在37℃消化20 min。100目和500目篩過(guò)濾細(xì)胞,室溫下800 r/min離心5 min,每次過(guò)濾后用1×PBS溶液洗滌3次。在細(xì)胞中添加10%胎牛血清(FBS)(AusGeneX公司)和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL,細(xì)胞鋪板后,37℃下5%CO2培養(yǎng)。

    DF1細(xì)胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM中培養(yǎng),在37℃下5%CO2孵育。

    1.5 質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

    利用Q5高保真DNA聚合酶擴(kuò)增TMEM86A啟動(dòng)子區(qū)(NC_006092.4)不同長(zhǎng)度DNA片段(P1-P5),分別插入熒光素酶報(bào)告載體pGL3-BasicNheⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。將ARNT(NM_204200.1)、CREB1(NM_204450.2)和SP1(NM_204604.1)基因的編碼序列分別克隆到pcDNA3.1載體中,重組載體引物見(jiàn)表2。使用LipofectamineTM3000(Invitrogen公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。對(duì)于24孔板(2.5×105個(gè)/孔)培養(yǎng)的細(xì)胞,在LipofectamineTM3000中,加入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒500 ng、pcDNA3.1重組質(zhì)粒500 ng和pRLTK質(zhì)粒50 ng轉(zhuǎn)染細(xì)胞。處理48 h后,使用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)熒光比值。所有結(jié)果均來(lái)自至少3次獨(dú)立試驗(yàn)。

    表2 用于重組載體構(gòu)建的引物序列

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TMEMs基因在肝臟中的表達(dá)

    選取8個(gè)TMEMs基因,分別檢測(cè)在蛋雞和肉雞肝臟中的表達(dá)水平。由圖1可知,TMEM45A、TMEM51、TMEM86A、TMEM97和TMEM154基因在肉雞中的表達(dá)量顯著(P<0.05)高于蛋雞,表明2種類(lèi)型雞的肝臟內(nèi)細(xì)胞代謝狀態(tài)存在差異。此外,為比較相同品種的不同采食方式對(duì)TMEMs基因的表達(dá)影響,設(shè)置了自由采食組和限飼組,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。與自由采食組相比,限飼組肝臟TMEM135、TMEM199和TMEM214表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。與自由采食組相比,限飼組只有TMEM86A基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),提示饑餓狀態(tài)可能是導(dǎo)致TMEM86A基因上調(diào)表達(dá)的原因。

    圖1 TMEMs基因在蛋雞和肉雞肝臟中表達(dá)水平

    圖2 TMEMs基因在自由采食組和限飼組肝臟中的表達(dá)水平

    2.2 TMEM86A基因啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控區(qū)域的鑒定

    將雞TMEM86A基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)作為+1,將其5′側(cè)啟動(dòng)子序列作為調(diào)控區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并截短為5個(gè)片段構(gòu)建pGL3重組載體。在雞胚肝臟細(xì)胞中,熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)結(jié)果顯示pGL3-P5到pGL3-P3的熒光素酶活性相對(duì)穩(wěn)定,當(dāng)截短到pGL3-P2時(shí),其熒光素酶活性明顯下降,表明-906 bp至-615 bp之間的序列中存在重要轉(zhuǎn)錄因子;當(dāng)再次截短后pGL3-P1的熒光素酶活性上升,表明在-615 bp至-296 bp之間的序列中存在抑制性的轉(zhuǎn)錄因子。推測(cè)TMEM86A基因的啟動(dòng)子受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(圖3)。

    圖3 熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)檢測(cè)TMEM86A基因啟動(dòng)子活性

    2.3 靶向TMEM86A基因轉(zhuǎn)錄因子的篩選與驗(yàn)證

    根據(jù)Jaspar和TRANSFAC軟件的結(jié)果,預(yù)測(cè)7個(gè)靶向TMEM86A啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子,分別為SP1、CREB1、E2H4、EGR1、ASCL1、HIF1A和ARNT。通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在自由采食組和限飼組之間的表達(dá)水平,表明SP1、CREB1和ARNT在兩組中表達(dá)存在差異(圖4)。限飼處理促進(jìn)了SP1和ARNT的表達(dá),抑制了CREB1 mRNA的表達(dá)。在DF1細(xì)胞中利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)錄因子對(duì)TMEM86A基因表達(dá)活性的影響,結(jié)合超表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子和共轉(zhuǎn)染pGL3-P5試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)SP1顯著促進(jìn)pGL3-P5熒光素酶活性(圖5a),CREB1顯著促進(jìn)pGL3-P5的相對(duì)熒光素酶活性(圖5b),但ARNT對(duì)pGL3-P5熒光素酶活性變化不顯著(圖5c)。

    圖4 預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子在限飼組與自由采食組間的mRNA表達(dá)

    圖5 超表達(dá)SP1、CREB1和ARNT檢測(cè)p GL3-P5片段的熒光活性

    3 小結(jié)與討論

    本研究從TMEMs基因在雞肝臟中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中,發(fā)現(xiàn)限飼處理會(huì)促進(jìn)TMEM86A基因上調(diào)表達(dá),提示該基因可能參與饑餓應(yīng)激。給小鼠喂食高脂肪食物可以降低脂肪組織溶酶漿原水平,并增加跨膜蛋白TMEM86A含量,當(dāng)TMEM86A基因被敲除以后,線(xiàn)粒體氧化代謝增強(qiáng),能量消耗提高,表明其是參與能量代謝的重要基因[14]。蛋雞在日常生產(chǎn)過(guò)程中,經(jīng)常因?yàn)槲沽喜痪?、過(guò)少造成能量攝入不足,從而導(dǎo)致長(zhǎng)時(shí)間停產(chǎn)或減產(chǎn),因此探究TMEM86A基因的生物功能具有重要意義。

    根據(jù)TMEM86A基因上游序列,使用Jaspar網(wǎng)站和TRANSFAC網(wǎng)站預(yù)測(cè)了7個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子,在自由采食組和限飼組中RT-qPCR結(jié)果顯示,ARNT、SP1和CREB1 3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子存在差異表達(dá)。CREB通過(guò)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中的糖原和脂質(zhì)代謝,在脂肪組織和肝臟中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[15]。與生長(zhǎng)緩慢的雞相比,生長(zhǎng)迅速的雞肝臟中CREB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著(P<0.05)升高[16],高脂肪飼料喂養(yǎng)的雄性大鼠肝臟中CREB1表達(dá)上調(diào)[17]。限飼組肝臟中CREB1的表達(dá)下調(diào),CREB1通過(guò)靶向TMEM86A基因的啟動(dòng)子,調(diào)控TMEM86AmRNA的表達(dá)水平。除了CREB1,發(fā)現(xiàn)SP1能影響TMEM86A的啟動(dòng)子活性,轉(zhuǎn)錄因子SP1在多種組織中廣泛表達(dá),在細(xì)胞黏附、侵襲、遷移和血管生成中發(fā)揮重要作用[18]。本研究表明在肝臟細(xì)胞中SP1和CREB1通過(guò)靶向TMEM86A基因,共同參與雞肝臟的能量代謝過(guò)程。

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