外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉膜脂過氧化水平的影響

盧紹浩，劉崇盛，許利平，謝永恒，許高燕，吳兆明，張麗娜，高陽

浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州 310000

雪茄是一種用煙葉卷制成的特殊煙草制品，優(yōu)質(zhì)的雪茄煙葉具有顏色均勻、油分足、香味濃厚、勁頭較大的特點，是卷制高端雪茄的基礎(chǔ)[1]。煙草調(diào)制是煙葉品質(zhì)形成的重要環(huán)節(jié)，在調(diào)制過程中，煙葉內(nèi)部發(fā)生生理變化，會產(chǎn)生吡嗪、吡啶等對煙草品質(zhì)起重要作用的雜環(huán)化合物[2]。同時，在調(diào)制階段由于水分散失對煙葉內(nèi)部造成了逆境脅迫，導(dǎo)致了細胞膜的逐漸氧化，最終產(chǎn)生了對煙葉有毒害作用的丙二醛（MDA）[3]。MDA 作為膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，常將其含量作為衡量煙葉膜脂過氧化水平的重要指標(biāo)[4]。一般認(rèn)為煙葉發(fā)生黃化褐變是由于膜脂過氧化水平的加劇，煙葉細胞衰老死亡，細胞膜間的分隔作用被打破導(dǎo)致酶和底物結(jié)合受抑制[5]。范寧波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，晾制期間雪茄煙葉膜脂過氧化水平過高，將加快膜脂代謝和色素降解，導(dǎo)致煙葉衰老進程加快，內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化不充分，雜色煙比例升高。宮長榮等[7]研究發(fā)現(xiàn)，煙葉內(nèi)在品質(zhì)與膜脂過氧化水平呈負(fù)相關(guān)。楊虹琦等[8]研究表明，煙草在調(diào)制階段膜脂過氧化反應(yīng)發(fā)生的越早或越劇烈都不利于煙葉品質(zhì)的形成。因此合理調(diào)控調(diào)制階段煙葉膜脂過氧化水平，有利于延緩晾制期間雪茄煙葉衰老進程，促進煙葉內(nèi)含物質(zhì)轉(zhuǎn)化，對提高煙葉品質(zhì)具有重要意義。

褪黑素是植物生命活動所必要的色氨酸吲哚衍生物，被認(rèn)為是一類新的植物生長調(diào)節(jié)劑，具有維持細胞活性氧代謝平衡的作用，能提高植物抗氧化酶基因的表達，降低超氧陰離子及過氧化氫的含量，是植物體內(nèi)重要的抗氧化劑[9]。前人研究了赤霉素、水楊酸、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯及褪黑素等外源激素對植物抗氧化系統(tǒng)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同種類的非生物脅迫中，施加外源褪黑素處理的植物膜脂過氧化水平最低，抗氧化能力最好[10-11]。因此，選用外源褪黑素作為處理，對提高植物抗氧化能力效果較為顯著。辛丹丹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可降低采后黃瓜MDA 含量、活性氧含量和乙烯釋放量，提高抗氧化酶活性，延緩采后黃瓜的衰老。賀嘉豪等[13]研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可顯著增強煙草幼苗在干旱脅迫下的光合作用以及抗氧化能力。目前，褪黑素對提高植物抗脅迫能力的相關(guān)研究主要集中在果蔬方面[14-15]，而對雪茄煙這類特殊的煙草研究較缺乏。本研究通過探究不同濃度外源褪黑素對雪茄煙葉晾制過程中抗氧化系統(tǒng)的影響，旨在明確外源褪黑素處理與雪茄煙葉晾制期間衰老機制的關(guān)系，為外源褪黑素在雪茄煙葉晾制時期的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2021 年在四川省什邡市雪茄煙葉種植基地（東經(jīng)104°12′，北緯31°12′，海拔545 m）進行，試驗地土壤為水稻土，肥力均勻，地勢平坦，土壤pH 6.56，有機質(zhì)含量35.02 g/kg，速效鉀含量84.20 mg/kg，速效磷含量42.85 mg/kg，速效氮含量117.02 mg/kg。種植的雪茄煙葉為當(dāng)?shù)刂髟云贩N德雪1 號。試驗所用的褪黑素為索萊寶生物有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計

煙苗于2021 年4 月30 日進行移栽，行距1.2 m，株距0.4 m，煙田施氮量為180 kg/hm2（煙草專用復(fù)合肥）。采收時選取葉片成熟度及長勢相一致的煙株，以10～12 葉位的中部葉為試驗材料，將采后煙葉編桿掛入規(guī)格為30 m×10 m×8 m 的晾房，煙竿長2 m，每竿掛煙葉45 片，每個處理標(biāo)記30 竿，其它生產(chǎn)管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)雪茄煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范統(tǒng)一進行。試驗設(shè)置4 個處理，分別為：CK，葉面噴施蒸餾水；T1，葉面噴施濃度為60 μg/mL 的褪黑素溶液；T2，葉面噴施濃度為120 μg/mL 的褪黑素溶液；T3，葉面噴施濃度為180 μg/mL 的褪黑素溶液；每個處理重復(fù)3 次。晾制開始時向各處理雪茄煙葉的葉面上先噴施pH 5.50～6.35 的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液調(diào)節(jié)酸堿度（防止外源褪黑素的噴施破壞了原有的酸堿平衡，導(dǎo)致煙葉細胞活性降低[16]），之后再將配置好的各濃度褪黑素溶液均勻地噴施在雪茄煙葉上，噴施量以葉重的25%為準(zhǔn)。分別在晾制的鮮煙葉期S1（晾制0 d）、凋萎期S2（晾制5 d）、變黃后期S3（晾制10 d，此時雪茄煙葉表面顏色為黃色和褐色共存，主要以黃色為主，故將S3 設(shè)定為變黃后期。）、定色期S4（晾制15 d，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雪茄煙葉變褐過程在變黃期就已經(jīng)啟動，在晾制13 d 左右煙葉基本完成變褐過程[17]，因此，將S4 設(shè)定為定色期。）、干筋期S5（晾制20 d）進行煙葉的取樣（本研究設(shè)定的5 個時期并未完全契合雪茄煙葉的晾制時期，主要是因為各時期的分界點未能有效界定，同時本研究的取樣時間跨度略大，導(dǎo)致了個別晾制時期被忽略），各處理每次選取30 片煙葉，將其分為3 份：一份用紗布和錫箔紙包裹后置于液氮中用于酶活性、MDA 含量和脯氨酸含量的測定；一份用于含水率的測定；一份去除主脈和葉尖，殺青后烘干磨碎過孔徑250 μm 篩用于多酚類物質(zhì)含量的測定。當(dāng)煙葉晾制結(jié)束時，各處理選取30 片煙葉烘干磨碎過孔徑250 μm 篩用于化學(xué)成分含量的測定。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 含水率測定方法

將整片煙葉葉尖1/3 處和葉基1/3 處去除后，采用加熱烘干法測定煙葉含水率[18]。

1.3.2 丙二醛和脯氨酸含量測定方法

丙二醛（MDA）和脯氨酸含量利用氨基酸含量測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）采用可見分光光度法測定。

1.3.3 酶活性測定方法

過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）過氧化氫酶（catalase，CAT）活性利用POD、PPO、SOD 及CAT 活性測定試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）采用可見分光光度法測定。

1.3.4 多酚類物質(zhì)含量測定方法

采用YC/T 202—2006[19]方法測定雪茄煙葉中多酚類物質(zhì)含量。

1.3.5 化學(xué)成分含量測定方法

總糖、還原糖、淀粉、總氮、煙堿、蛋白質(zhì)含量采用流動分析法測定[20]。

1.3.6 感官質(zhì)量評價方法依據(jù)《YC/T415—2011 煙草在制品感官評價方法》進行感官評吸鑒定[21]。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

采用Microsoft Excel 2007 進行數(shù)據(jù)整理及作圖，運用SPSS 21.0 分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉含水率的影響

由表1 可知，隨著晾制時期的推移，各處理雪茄煙葉含水率均呈下降趨勢。處理間相比較，煙葉含水率整體表現(xiàn)為T2＞T3＞T1＞CK，且整個晾制時期T2 與CK 處理均達到了顯著差異水平，表明了噴施一定量的外源褪黑素溶液對調(diào)控晾制過程中雪茄煙葉水分散失有一定影響。在晾制前期各處理煙葉含水率降幅稍平緩，而變黃后期至定色階段各處理雪茄煙葉含水率下降較快，其中以T1 處理降幅最大，T3 處理降幅最小，各處理降幅分別為56.13%（CK）、58.15%（T1）、48.43%（T2）和47.46%（T3），之后各處理失水速率又趨于平緩。因此整個晾制時期，雪茄煙葉的失水速率呈現(xiàn)出“慢-快-慢”的變化，表明了變黃后期至定色期是煙葉水分散失的關(guān)鍵階段。

表1 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉含水率的影響Tab.1 Effects of exogenous melatonin on moisture content of cigar tobacco leaves during air-curing stage

2.2 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉MDA 和脯氨酸含量的影響

由圖1A 可知，晾制期間各處理雪茄煙葉MDA 含量隨著晾制時期的推移總體呈上升趨勢。處理間相比，隨著褪黑素濃度的增加MDA 含量而呈先下降后上升的變化，凋萎期（S2）后，4 個處理MDA 含量差異逐漸增大，相同時期內(nèi)MDA 含量以T2 處理最低，CK 處理最高，T1 與T3 處理居中，至干筋期（S5）時，各處理MDA 含量相較晾制初期（S1）分別升高2.81（CK）、2.20（T1）、2.02（T2）和2.17（T4）倍，以T2 處理含量最低，這說明T2 處理外源褪黑素溶液濃度更利于降低晾制期間膜脂過氧化程度。

圖1 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉MDA(A)和脯氨酸(B)含量的影響Fig.1 Effects of exogenous melatonin on MDA(A) and proline(B) contents of cigar tobacco leaves during air-curing stage

晾制期間各處理雪茄煙葉脯氨酸含量變化相一致，均呈先升高后降低的變化趨勢（圖1B）。在S1時期，各處理脯氨酸含量均處于較低水平，且均未達到顯著差異；之后脯氨酸含量迅速增加，至S3 時期各處理脯氨酸含量達到峰值，CK、T1、T2 和T3 處理分別為0.43 μg/mg、0.56 μg/mg、0.62 μg/mg 和0.51 μg/mg，且處理間均達到了差異顯著；之后含量略有下降，至S5 時期含量趨于穩(wěn)定。整個晾制期間，T2處理脯氨酸含量均最高，CK 處理最低，并且二者始終達到顯著差異水平。因此，噴施合適濃度褪黑素溶液對雪茄煙葉脯氨酸含量的積累具有促進作用。

2.3 雪茄煙葉含水率與膜脂過氧化水平的相關(guān)性

對晾制過程中雪茄煙葉含水率與煙葉膜脂過氧化水平進行相關(guān)分析，由表2 可知，不同處理雪茄煙葉含水率與膜脂過氧化水平呈極顯著負(fù)相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)均較高，表明雪茄煙葉含水率的降低與膜脂過氧化水平升高緊密相關(guān)。

表2 晾制過程中煙葉水分與膜脂過氧化水平的相關(guān)分析Tab.2 Correlation analysis between leaf moisture and lipid peroxidation level during air-curing stage

2.4 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉抗氧化酶活性的影響

POD、CAT、SOD 和PPO 是植物體內(nèi)的主要抗氧化酶，其活性的高低對植物抗氧化能力有重要影響。不同處理雪茄煙葉POD 和CAT 活性變化相同（圖2A和圖2B），呈單峰變化趨勢，均在S3（變黃后期）達到峰值。其中4 個處理POD 活性在變黃后期分別比晾制初期升高了1.92（CK）、2.19（T1）、2.18（T2）和1.81（T3）倍，之后POD 活性開始降低，凋萎期（S2）后T2 處理POD 活性始終大于其它處理，除S5 時期外均達到了顯著差異；T1 與T3 處理活性居中，二者無顯著差異，但均與CK 處理達到了顯著差異。各處理CAT 活性也在S3 時期達到峰值，此時CK、T1、T2 和T3 處理CAT 活性分別為904.18 U/g、1032.83 U/g、1183.89 U/g 和1065.33 U/g；處理間相比，煙葉從凋萎期（S2）至定色期（S4），T2 處理CAT 活性一直保持較高水平，與CK、T1 和T3 達到了差異顯著，而T1 與T3 二者之間未達到顯著差異，但均顯著高于CK 處理。

圖2 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉POD(A)、CAT(B)、SOD(C)、PPO(D)活性的影響Fig.2 Effects of exogenous melatonin on the activities of POD(A), CAT(B), SOD(C) and PPO(D) in cigar tobacco leaves during air-curing stage

圖2C 顯示，不同處理SOD 活性均呈下降趨勢，至干筋期（S5）活性最低。整個晾制期間各處理SOD活性降幅分別為88.63%（CK）、75.09%（T1）、65.82%（T2）和73.74%（T3），其中以CK 處理降幅最大，T2 處理降幅最小。整個晾制期間，SOD 活性以CK 處理最低，與其它3 個處理均達到差異顯著，T2 處理SOD 活性高于T1 和T3 處理，除S4 時期外均達到顯著差異水平。由圖2D 可知，各處理PPO 活性在晾制過程中呈先升高后降低的變化趨勢，于凋萎期（S2）活性最高，此時CK、T1、T2 和T3 處理相較S1 時期分別升高了4.46%、29.99%、35.89%和17.60%。晾制期間PPO 活性始終以T2 處理最高，T1 和T3 處理次之，CK 處理最低；T2 處理除S4 時期與T1 未達顯著外，其余時期均與T1 和T3 處理達到差異顯著水平?？傮w而言，在不同處理下4 種抗氧化酶活性總體以T2處理活性最高，T1 和T3 處理活性居中，CK 處理活性最低，表明了噴施不同濃度的外源褪黑素對雪茄煙葉抗氧化能力影響顯著。

2.5 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉多酚類物質(zhì)含量的影響

晾制期間雪茄煙葉主要多酚類物質(zhì)有綠原酸和蕓香苷，在噴施不同濃度外源褪黑素溶液的影響下其含量如圖3 所示。由圖3A 可知，綠原酸含量隨著晾制時期的推移呈先上升后下降的變化，在凋萎期（S2）達到最高，此時各處理綠原酸含量分別為3.13 mg/g（CK）、3.95 mg/g（T1）、3.55 mg/g（T2）和3.75 mg/g（T3）。晾制初期4 個處理綠原酸含量并無差異，S2至S4 時期含量迅速降低，此階段4 個處理綠原酸含量整體表現(xiàn)為T3＞T1＞T2＞CK，且CK、T2 和T3 均達到差異顯著；至S5 時各處理綠原酸含量最低，此時T1、T2 和T3 處理之間差異不顯著，但均顯著高于CK 處理。由圖3B 可知，晾制過程中蕓香苷含量也呈現(xiàn)先升高后下降的變化，其中CK 處理蕓香苷含量在S2 時期最高，為1.19 mg/g，而T1、T2 和T3 處理蕓香苷含量均在S3 時期最高，分別為1.47 mg/g、1.36 mg/g和1.54 mg/g。在晾制過程中T1、T2 和T3 處理蕓香苷含量除S3 時期外差異均不顯著，但3 個處理均與CK 達到顯著差異，表明了噴施外源褪黑素可減緩蕓香苷含量的降解，但外源褪黑素溶液的濃度對蕓香苷含量的影響較小。

圖3 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉綠原酸(A)和蕓香苷(B)含量的影響Fig.3 Effects of exogenous melatonin on chlorogenic acid(A) and rutin(B) content in cigar tobacco leaves during air-curing stage

2.6 外源褪黑素對晾制后雪茄煙葉化學(xué)成分的影響

由表3 可知，隨著外源褪黑素濃度的增加總糖和還原糖含量呈先升高后降低的變化，總糖含量變化范圍在0.84%～1.60%，還原糖含量變化范圍在0.61%～0.84%，處理間除T1 與T3 處理無顯著差異外，其它處理均達到顯著差異。與總糖和還原糖含量變化相反，淀粉含量呈先下降后上升的變化，T2 處理含量最低，CK 含量最高，且CK 與其它處理均達到差異顯著，表明適宜濃度的外源褪黑素能促進雪茄煙葉淀粉的降解，有利于糖含量的積累。蛋白質(zhì)含量表現(xiàn)為CK＞T1＞T3＞T2，處理間差異較顯著，這可能是因為膜脂過氧化水平不同影響了氮代謝相關(guān)酶活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在晾制期間降解程度不同[22]；總氮和煙堿含量處理間差異不顯著。氮堿比作為煙葉感官質(zhì)量的重要指標(biāo)，比值越接近1 煙葉質(zhì)量越優(yōu)。本研究中，氮堿比的變化范圍為1.11～1.28，其中CK 處理顯著高于其它3個處理。糖堿比表現(xiàn)為T2＞CK＞T1＞T3，表明噴施合適濃度的外源褪黑素，有利于改善晾制期間雪茄煙葉碳氮代謝，促進內(nèi)在化學(xué)成分更為協(xié)調(diào)地轉(zhuǎn)化。

2.7 外源褪黑素對雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響

由表4 可知，噴施外源褪黑素處理的雪茄煙葉感官質(zhì)量均好于CK 處理，不同濃度外源褪黑素處理的雪茄煙葉香氣質(zhì)、香氣量、刺激性、甜度和總分呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。表明晾制期間噴施濃度為120 μg/mL 的褪黑素溶液（T2）有利于提升雪茄煙葉的感官質(zhì)量，主要特征表現(xiàn)為香氣質(zhì)好、香氣量足、刺激性小及甜度好。

表4 外源褪黑素對雪茄煙葉感官質(zhì)量的影響Tab.4 Effects of exogenous melatonin on sensory quality of cigar tobacco leaves

3 討論

3.1 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉膜脂過氧化水平的影響

雪茄煙葉的晾制是利用光、水、熱等自然資源，使煙葉內(nèi)部緩慢脫水，進行生理生化反應(yīng)的過程[23]。晾制期間，雪茄煙葉的自身衰老使葉肉細胞中活性氧自由基的產(chǎn)生與清除失衡，自由基的積累將導(dǎo)致膜脂過氧化反應(yīng)的啟動，膜的透性增加，膜結(jié)構(gòu)被破壞[24]。丙二醛（MDA）作為植物膜脂過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其含量可反映植物膜脂過氧化程度[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，晾制期間各處理雪茄煙葉MDA 含量均呈上升趨勢，是因為隨著晾制時間的推移，煙葉凋亡逐漸加深，導(dǎo)致膜脂過氧化程度加大，MDA 含量逐步積累。處理間相比，CK 處理MDA 含量顯著高于噴施外源褪黑素處理，過高或過低濃度的外源褪黑素緩解膜脂過氧化效果下降，MDA 含量高于適宜濃度的T2 處理。這是因為外源褪黑素在煙葉體內(nèi)具有較好的抗氧化作用，對緩解煙葉在逆境條件下的傷害具有重要作用[26]，但褪黑素濃度過低對提高植物抗脅迫能力較弱，而褪黑素濃度過高可改變其它蛋白的氧化性，對植物的正常生命活動同樣有抑制作用[27]。雪茄煙葉在晾制期間，由于煙葉內(nèi)部水分的散失，導(dǎo)致細胞膜發(fā)生皺縮、破裂，最終被完全氧化，因此煙葉含水量與細胞膜脂過氧化程度關(guān)系密切[3]。黃山等[28]研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)制期間烤煙K326和紅花大金元的含水率大幅下降與MDA含量大幅度升高同時發(fā)生。本研究結(jié)果表明，各處理雪茄煙葉在變色至定色階段含水率降速加快，此時MDA含量增速加快，處理間相比，當(dāng)煙葉MDA 含量較高時，其含水量較低。相關(guān)性分析表明，不同處理條件下煙葉含水率與MDA 含量均呈極顯著負(fù)相關(guān)，且整體相關(guān)系數(shù)較高，說明隨著晾制的進行，雪茄煙葉含水率逐漸降低，伴隨著MDA 含量的逐步升高，該結(jié)果進一步證明了二者之間的相關(guān)性，且本結(jié)果與趙松超等[29]的研究結(jié)果基本一致，說明了晾制期間煙葉水分的散失程度是導(dǎo)致MDA 含量升高的重要原因[30]。

3.2 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

脯氨酸作為植物的重要滲透物質(zhì)，在穩(wěn)定大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)以及清除細胞內(nèi)活性氧自由基等方面都發(fā)揮著重要作用[31-32]。謝良文等[33]研究發(fā)現(xiàn)，烤煙在烘烤過程中脯氨酸含量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。本研究結(jié)果呈現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，在變黃后期達到峰值。這是由于晾制開始時煙葉水分缺失造成生理狀態(tài)失衡，此時通過合成更多的脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可維持煙葉內(nèi)部的代謝平衡[34]。而在煙葉變色階段，脯氨酸作為美拉德產(chǎn)物的重要前體物參與棕色化反應(yīng)，造成了其含量的相對降低[35]。與CK 處理相比，晾制期間施加不同濃度外源褪黑素處理的雪茄煙葉脯氨酸含量均顯著提高，且隨著褪黑素濃度的增加脯氨酸含量先升高后降低。說明晾制期間噴施外源褪黑素能增強脯氨酸合成相關(guān)酶類的活性[36]，但褪黑素濃度超過閾值時，將會對煙葉內(nèi)部脯氨酸的合成產(chǎn)生一定抑制作用。

3.3 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉多酚類物質(zhì)的影響

多酚類物質(zhì)是雪茄煙葉中重要的次生代謝物，其含量對雪茄煙葉的色澤、抗氧化能力以及香吃味都有重要影響[37]。前人研究發(fā)現(xiàn)，晾制期間雪茄煙葉多酚類物質(zhì)被降解，其含量整體呈下降趨勢[38]。本研究表明，多酚類物質(zhì)含量在晾制期間表現(xiàn)出先升高后降低的變化。其含量在晾制前中期的升高可能是由木質(zhì)素發(fā)生熱解反應(yīng)所導(dǎo)致[39]，晾制后期由于膜脂過氧化程度的加劇，活性氧自由基含量的增多，并且PPO 還保持著一定活性，因此多酚類物質(zhì)在PPO 以及活性氧分子的雙重作用下含量持續(xù)降低[40]。其中綠原酸含量在凋萎期后迅速降低，這與PPO 活性在凋萎期達到峰值有關(guān)。晾制期間蕓香苷含量變化與綠原酸略有差異，雖然其含量也呈先升高后降低的變化趨勢，但由于棕色化反應(yīng)主要以綠原酸為底物[41]，因此蕓香苷含量的峰值相較綠原酸后移。處理間相比，CK 處理多酚類物質(zhì)含量均低于其它處理，并且該處理蕓香苷含量的峰值也早于其它處理，這主要是因為褪黑素能誘導(dǎo)煙葉體內(nèi)抗氧化酶活性增強，有效清除活性氧，保持了煙葉內(nèi)在穩(wěn)定性，緩解了部分多酚類物質(zhì)與自由基作用[42]。不同濃度褪黑素處理下的綠原酸與蕓香苷含量以T2 處理最低，主要是因為該濃度下煙葉內(nèi)部環(huán)境最為穩(wěn)定，PPO 活性最高，促進了多酚類物質(zhì)的氧化。同時，綠原酸與蕓香苷的氧化也是雪茄煙葉褐變的主要原因，但由于煙葉褐變過多或褐變不充分均不利于煙葉的定色，也不利于提升煙葉品質(zhì)；因此，噴施適宜濃度的外源褪黑素能減少多酚類物質(zhì)被活性氧氧化，促進多酚類物質(zhì)充分轉(zhuǎn)化，對提高雪茄煙葉的品質(zhì)有重要意義。

3.4 外源褪黑素對晾制期間雪茄煙葉抗氧化酶活性的影響

PPO 存在于煙葉葉綠體中，是煙草抗病機制中一種重要的防護酶，同時也直接參與煙葉酶促棕色化反應(yīng)，晾制期間適當(dāng)提高PPO 活性不僅能提高雪茄煙葉的抗病性，也對雪茄煙葉品質(zhì)提升起到關(guān)鍵作用[43]。本研究結(jié)果表明，晾制期間各處理PPO 活性均呈先升高后降低的變化。這可能是由于PPO 活性與煙葉含水率緊密相關(guān)[44]，晾制初期煙葉水分散失，致使活性氧自由基積累，細胞膜被破壞[43]，導(dǎo)致細胞中的自由水向葉綠體內(nèi)流動，PPO 所在環(huán)境的水分相對升高，促進PPO 活性升高，晾制后期由于煙葉水分迅速散失，使其活性快速降低。處理間，由于煙葉含水率的差異，導(dǎo)致PPO 活性主要表現(xiàn)為T2 處理最高，T1 和T3 處理居中，CK 處理最低。

POD、CAT、SOD 普遍存在于植物中，是植物體內(nèi)活性氧自由基清除機制的關(guān)鍵酶，對提高植物的抗逆能力發(fā)揮著重要作用[45]。本研究發(fā)現(xiàn)，晾制過程中POD 和CAT 活性呈先升高后降低的變化，而SOD 活性呈下降趨勢，這可能是由于晾制期間煙葉內(nèi)活性氧自由基逐漸積累，膜脂過氧化水平逐漸加強，煙葉酶促防御系統(tǒng)被激活，誘導(dǎo)POD 和CAT 活性升高，以清除煙葉內(nèi)多余的活性氧自由基，從而減輕逆境脅迫帶來的傷害[46]，而SOD 活性與植物衰老關(guān)系密切，晾制過程又是雪茄煙葉的二次衰老過程[47]，因此SOD 活性在晾制期間逐漸降低。處理間相比較，噴施不同濃度褪黑素處理的POD、CAT、SOD 活性較CK 處理顯著加強，這可能是由于褪黑素通過加強雪茄煙葉體內(nèi)抗氧化酶相關(guān)基因的表達，提高了相關(guān)酶活性，從而增強了煙葉對活性氧自由基的清除能力[48]。然而隨著褪黑素濃度的升高，3 種酶活性呈先升高后下降的變化，這是因為褪黑素濃度過低促進作用弱，濃度過高則抑制了煙葉正常代謝活動[49]。

本研究通過測定抗氧化酶活性等指標(biāo)表明了外源褪黑素處理能提高晾制期間雪茄煙葉的抗氧化能力，并且在一定程度上延緩了煙葉的衰老，但由于取樣時間的限定，以及未收集晾制期間不同處理煙葉狀態(tài)的圖片，因此噴施外源褪黑素處理能否延長雪茄煙葉的晾制時間有待進一步研究，在后續(xù)的研究中將進一步細化晾制時期，結(jié)合煙葉色差、煙葉狀態(tài)圖片，為褪黑素對延緩晾制期間雪茄煙葉衰老進程提供更為客觀的依據(jù)。

4 結(jié)論

雪茄煙葉在晾制期間，噴施不同濃度外源褪黑素處理下煙葉POD、CAT 和PPO 活性均呈先升高后下降趨勢，而SOD 活性呈下降趨勢；煙葉含水率呈降低趨勢，MDA 含量逐漸升高，脯氨酸含量呈先升高后降低的變化趨勢，在變黃后期達到峰值。處理間相比，噴施外源褪黑素處理能顯著減少MDA 的積累，提高脯氨酸和煙葉水分含量，維持了晾制期間雪茄煙葉的滲透調(diào)節(jié)平衡，同時提高了抗氧化酶活性，增強了煙葉的抗氧化能力，其中褪黑素濃度在120 μg/mL 條件下，煙葉抗氧化能力最好，煙葉多酚類物質(zhì)降解充分，晾制后煙葉化學(xué)成分更協(xié)調(diào)。