手工雪茄主要霉菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

朱貝貝，黃闊，薛芳，安泓汋，葉長(zhǎng)文，李棟，李東亮*

1 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司雪茄煙技術(shù)創(chuàng)新中心，成都市龍泉驛區(qū)成龍大道二段 610066；

2 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

雪茄是以發(fā)酵醇化的煙葉為原料卷制而成的特殊煙草制品[1]。由于發(fā)酵后的煙葉富含有機(jī)酸、糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此更適宜霉菌生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而引發(fā)霉變[2-3]。手工雪茄近年來發(fā)展迅猛，但雪茄煙支在養(yǎng)護(hù)、運(yùn)輸和儲(chǔ)存等過程中，受環(huán)境溫濕度影響造成的霉變現(xiàn)象日益突出。生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，手工雪茄因特殊的加工過程面臨更大的霉變風(fēng)險(xiǎn)。霉菌在高溫、潮濕或無氧等條件下發(fā)酵，可導(dǎo)致煙葉腐爛，產(chǎn)生雜氣[4]，對(duì)雪茄的內(nèi)在感官及質(zhì)量安全性產(chǎn)生不利影響[5-6]。據(jù)報(bào)道，自然界引起商品變質(zhì)腐敗的霉菌有130 屬231 種[7]，其中引起煙葉霉變的優(yōu)勢(shì)霉菌主要為曲霉屬和青霉屬[8-10]，也有少量的毛霉、根霉等[11-12]。霉菌生長(zhǎng)繁殖的最適條件受自身生物學(xué)特性及氣候條件影響有很大差異[13]。Welty 等[14]研究表明美國(guó)烤煙霉變煙葉81%樣品中檢測(cè)出了匍匐曲霉。Tamayo 等[15]研究表明引起西班牙煙葉霉變的微生物主要為芽孢桿菌和球菌。引起我國(guó)煙葉霉變的微生物主要有黑曲霉、煙曲霉、溜曲霉、孔曲霉等[16-19]。引起我國(guó)卷煙煙支霉變的主要微生物有黃曲霉、桔青霉和米曲霉等[20-21]。

目前對(duì)煙草霉變的研究多集中于烤煙煙葉儲(chǔ)存、卷煙加工和儲(chǔ)存中霉菌等方面，缺乏對(duì)手工雪茄煙支中主要霉菌種類及其生物學(xué)特性的研究。為此，本研究通過對(duì)市場(chǎng)反饋易霉變的手工雪茄煙支中霉菌含量及種類進(jìn)行研究，旨在明確引起手工雪茄煙支霉變的主要霉菌及其生物學(xué)特性，為雪茄霉變防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料：收集市場(chǎng)反饋的易霉變手工雪茄煙支，共9 種，分別命名為A-I。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基；高鹽察氏培養(yǎng)基；察氏培養(yǎng)基；氯硝胺18%甘油瓊脂（DG18）培養(yǎng)基按照說明書配制；10%煙汁培養(yǎng)基的制備：1000 mL 蒸餾水中加入100 g發(fā)酵前雪茄煙葉，煮沸后過濾，加水補(bǔ)足到1000 mL，加18 g 瓊脂，121℃消毒20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 手工雪茄煙支中霉菌含量的測(cè)定

在無菌條件下將手工雪茄煙支樣品剪碎、混勻，稱取25 g 樣品，裝入無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 無菌磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)器12 m/s 均質(zhì)3 min，制成原始菌懸液，配制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度梯度的菌懸液。參考GB 4789.15—2016 中霉菌計(jì)數(shù)方法并進(jìn)行改進(jìn)，將0.333 mL 稀釋液涂布接種于孟加拉紅培養(yǎng)基，每組樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。28℃恒溫培養(yǎng)5 d，最終以霉菌含量在10～100 CFU/平板的稀釋度平板進(jìn)行霉菌含量計(jì)算。

1.2.2 手工雪茄煙支中霉菌的分離和純化

選取培養(yǎng)基上菌落形態(tài)不同的霉菌，在無菌條件下將不同的霉菌接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行純化，后置于（28±1）℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d，直至形成單一菌落。

1.2.3 手工雪茄煙支中霉菌的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察：通過觀察單菌落在生長(zhǎng)初期、中期和后期的生長(zhǎng)速度、大小、高度、色澤、質(zhì)地、結(jié)構(gòu)、邊緣形狀、培養(yǎng)基顏色變化和滲出物等特征，對(duì)霉菌菌落形態(tài)特征進(jìn)行初步鑒定。

產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征分析：將菌落邊緣帶孢子的菌絲置于載玻片上的乳酸石碳酸液中，菌絲分散均勻后蓋上蓋玻片通過鏡檢對(duì)霉菌菌絲及霉菌孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征進(jìn)行鑒定。

ITS 分子生物學(xué)鑒定：稱取20 mg 干燥的菌絲并用液氮研磨成粉末，使用Ezup 柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行 DNA 提取。 利用 ITS1（ 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ） 和 ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）真菌通用引物對(duì)霉菌ITS 區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)總體系為25 μL：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol /L）0.5 μL，上下游引物（5 μmol /L）各1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL（5 U /μL），無菌水19 μL，DNA 0.5 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5 min；30 個(gè)循環(huán)（變性94℃ 30 s，退火57℃ 30 s，延伸72℃ 90 s）；總延伸72℃ 10 min。將測(cè)序結(jié)果在GenBank 上進(jìn)行Blast 比對(duì)，找出與檢測(cè)菌株序列同源性最高的菌株。運(yùn)用MEGA 6.06軟件，以Kimura 雙參數(shù)模型和鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4 手工雪茄煙支中主要霉菌的生物學(xué)特性

不同培養(yǎng)基對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：選取PDA 培養(yǎng)基；高鹽察氏培養(yǎng)基；孟加拉紅培養(yǎng)基；察氏培養(yǎng)基；DG18 培養(yǎng)基；10%煙汁培養(yǎng)基對(duì)兩種主要霉菌進(jìn)行培養(yǎng)。菌株在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d 后，在菌落邊緣用內(nèi)徑為5 mm 的打孔器取菌餅，將菌餅移入相應(yīng)的培養(yǎng)基平板中央，于28℃、75%濕度培養(yǎng)5～7 d 后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。實(shí)際生長(zhǎng)的菌落直徑=菌落直徑平均值－5 mm。

不同溫度條件對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：在無菌條件下，將直徑為5 mm 的菌餅移入生長(zhǎng)狀況良好的培養(yǎng)基平板中央，分別在25℃、30℃、35℃和40℃條件下培養(yǎng)，濕度均設(shè)置為75%，5～7 d 后測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

不同熱處理?xiàng)l件對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：分別設(shè)40℃、50℃和60℃ 3 個(gè)恒溫水浴，制備聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉孢子懸浮液各2 mL 于無菌試管中，將試管置于相應(yīng)溫度條件下水浴10 min，未進(jìn)行恒溫水浴的孢子懸浮液于室溫放置10 min 并作為CK 對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)，將水浴后的孢子懸浮液均勻涂抹至相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5～7 d，計(jì)算霉菌含量。

不同紫外線照射時(shí)間對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：制備聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉孢子懸浮液，將孢子懸浮液進(jìn)行梯度稀釋至10-7，隨后將稀釋過的孢子懸浮液均勻涂抹至相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基平板上，置于生物安全柜中紫外燈下分別照射10 min、20 min、30 min、60 min、120 min，并以紫外光照0 min 為CK 對(duì)照。培養(yǎng)5～7 d，計(jì)算霉菌含量。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

不同濕度條件對(duì)霉菌生長(zhǎng)的影響：在無菌條件下，將直徑為5 mm 的菌餅移入生長(zhǎng)狀況良好的培養(yǎng)基平板中央，分別在濕度為50%、70%和90%下培養(yǎng)，溫度均設(shè)置為28℃，5～7 d 后測(cè)量菌落直徑。每個(gè)處理設(shè)3 次重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 手工雪茄煙支中霉菌含量

對(duì)9 種手工雪茄煙支樣品的霉菌含量進(jìn)行測(cè)定，將所得檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，如圖1 所示。每組樣品的平行性較好，檢測(cè)結(jié)果可靠。A～I(xiàn) 手工雪茄煙支中霉菌的含量范圍為0～2.10×104CFU/g。B、C 和G 樣品的霉菌含量較高，均大于104CFU/g。

圖1 雪茄煙支樣品中霉菌含量Fig.1 Mold content in cigar samples

2.2 手工雪茄煙支中霉菌的分離與鑒定

2.2.1 手工雪茄煙中主要霉菌種類及數(shù)量占比

根據(jù)9 種樣品在選擇性培養(yǎng)基平板上的霉菌生長(zhǎng)情況，將各樣品中不同霉菌種類進(jìn)行編號(hào)，根據(jù)霉菌菌落的形態(tài)學(xué)特征對(duì)其種類進(jìn)行到屬水平的初步鑒定，并對(duì)其含量占比進(jìn)行分析，結(jié)果如表1 和圖2 所示：手工雪茄樣品中的菌落按照生長(zhǎng)形態(tài)特征劃分共有6 種曲霉屬，1 種擬青霉屬和1 種青霉屬。其中A-1、B-1、C-1、D-1 和I-3 形態(tài)學(xué)特征相同，為曲霉屬同一種霉菌；A-2、B-2、C-2、E-2、H-1 和I-1 形態(tài)學(xué)特征相同，為青霉屬同一種霉菌。為方便后續(xù)研究將前者命名為#1，后者命名為#2。其中#1 和#2 在多個(gè)樣品中有檢出，且含量占比較高，為手工雪茄煙中的主要霉菌。

表1 樣品主要霉菌種類及含量占比Tab.1 Types and proportion of main molds in cigar samples

圖2 雪茄煙樣品中主要霉菌種類及形態(tài)圖Fig.2 The main mold species in cigar samples and their morphological images

2.2.2 雪茄煙支中主要霉菌鑒定

2.2.2.1 主要霉菌形態(tài)學(xué)特征

#1 型菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 后，菌落形態(tài)如圖3 所示：菌落直徑5～10 mm，棕色，緊密，表面絨狀，菌落反面淡褐色，無色素，菌落上無滲出物。#2 在PDA 培養(yǎng)基上菌落形態(tài)：正面呈綠色、灰綠色，菌落表面呈不規(guī)則形狀，菌落反面呈白色、淡黃色。

圖3 #1 和#2 在PDA 培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)形態(tài)Fig.3 Colony morphology of #1 and #2 strains on PDA medium

2.2.2.2 主要霉菌產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)

從圖4 可以看出#1 型菌株的分生孢子穗為黑色、褐黑色或紫褐色，部分發(fā)生淺色的突變；分生孢子梗光滑；頂囊大的呈球形或近球形，小的稍膨大，產(chǎn)生小梗；小梗單層或雙層；分生孢子粗糙，具有褐黑色的條紋。

圖4 #1 和#2 型菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)Fig.4 Spore structure of #1 and #2 strains

#2 型菌株菌絲呈淡綠色，菌絲和分生孢子梗均有橫隔，光滑或粗糙；分生孢子梗經(jīng)過多次分枝，產(chǎn)生幾輪對(duì)稱或不對(duì)稱的小梗，為掃帚狀；分生孢子為球形、橢圓形或短柱形，光滑或粗糙。

2.2.2.3 主要霉菌的分子生物學(xué)鑒定

菌株鑒定的ITS 序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果如圖5、6所示，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)特征分析，最終確定#1 為聚多曲霉（Aspergillus sydowii），#2 為產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）。

圖5 #1 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree of type 1 strain

圖6 #2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of type 2 strain

2.3 手工雪茄煙支中主要霉菌的生物學(xué)特性

2.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)主要霉菌生長(zhǎng)的影響

如表2 所示，聚多曲霉在DG18 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在察氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢；產(chǎn)黃青霉在DG18 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在煙汁培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢。不同霉菌種類對(duì)培養(yǎng)基的選擇不同，選擇不同培養(yǎng)基對(duì)霉菌生長(zhǎng)速率有重要影響。

表2 培養(yǎng)基對(duì)霉菌生長(zhǎng)狀況的影響Tab.2 Growth status of molds in different culture mediums

2.3.2 不同溫度對(duì)主要霉菌生長(zhǎng)的影響

如表3 所示，聚多曲霉的最適生長(zhǎng)溫度為30℃，25～35℃均能生長(zhǎng)，40℃時(shí)未生長(zhǎng)。產(chǎn)黃青霉的最適生長(zhǎng)溫度為25℃，25～35℃均能生長(zhǎng)，在40℃時(shí)未生長(zhǎng)。

表3 培養(yǎng)溫度對(duì)霉菌生長(zhǎng)狀況的影響Tab.3 Effects of temperature on the growth of molds

2.3.3 不同熱處理對(duì)主要霉菌生長(zhǎng)的影響

如表4 所示，聚多曲霉在40℃加熱10 min 時(shí)霉菌含量高于空白對(duì)照，在加熱50℃時(shí)，霉菌含量從107數(shù)量級(jí)驟減至103，60℃時(shí)霉菌已全部死亡。產(chǎn)黃青霉隨著溫度的升高，霉菌含量呈現(xiàn)遞減的現(xiàn)象，當(dāng)溫度為60℃時(shí)，霉菌已全部死亡。

表4 熱處理對(duì)霉菌孢子濃度的影響Tab.4 Effects of heat treatment on the mold spore concentration

2.3.4 紫外線對(duì)主要霉菌生長(zhǎng)的影響

如表5 所示，聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉對(duì)紫外線不敏感。聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉經(jīng)紫外線處理10 min、20 min、30 min、1 h、2 h，霉菌數(shù)量沒有明顯變化。

表5 不同紫外線照射時(shí)間對(duì)霉菌孢子濃度的影響Tab.5 Effects of different ultraviolet irradiation time on the concentration of mold spores CFU/mL

2.3.5 不同濕度對(duì)主要霉菌生長(zhǎng)的影響

不同濕度下聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)直徑如表6所示，濕度的增加，有利于聚多曲霉的生長(zhǎng)，當(dāng)濕度為90%時(shí)，聚多曲霉生長(zhǎng)最快。產(chǎn)黃青霉生長(zhǎng)速度隨著濕度的增加先增加后減少，當(dāng)濕度為70%時(shí)，產(chǎn)黃青霉的生長(zhǎng)速度最快。

表6 培養(yǎng)濕度對(duì)霉菌生長(zhǎng)狀況的影響Tab.6 Effects of humidity on the growth of molds

3 討論

本研究從9種手工雪茄煙支中分離得到8種霉菌，主要為曲霉屬、青霉屬和擬青霉屬。相關(guān)研究表明，曲霉屬和青霉屬是報(bào)道較多的導(dǎo)致卷煙及煙葉霉變的主要霉菌，其中數(shù)量最多的是黑曲霉、匍匐曲霉、紅曲霉、產(chǎn)黃青霉等[12,22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致手工雪茄霉變的主要霉菌為聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉，其中產(chǎn)黃青霉被報(bào)道是誘發(fā)云南、山東存儲(chǔ)片煙霉變的主要霉菌[17-18,24]，而由聚多曲霉引起雪茄霉變的研究尚未見報(bào)道。與卷煙及煙葉相比，雪茄煙總氮和生物堿的含量較高，糖含量較低，微生物生長(zhǎng)基質(zhì)不同，優(yōu)勢(shì)霉變菌群也不盡相同，而目前國(guó)內(nèi)外尚未見關(guān)于手工雪茄霉變微生物的研究。

霉菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30℃[12]，不同霉菌之間存在差異。聚多曲霉、產(chǎn)黃青霉在DG18 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，在溫度40℃時(shí)生長(zhǎng)最慢甚至不生長(zhǎng)，孢子懸浮液在60℃熱處理下失活，紫外照射對(duì)其無顯著影響；聚多曲霉在濕度為90%時(shí)，產(chǎn)黃青霉在濕度為70%時(shí)，生長(zhǎng)速度最快。因此，在雪茄生產(chǎn)過程中可以通過控制溫度或熱處理等方式抑制主要霉菌的生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而控制霉變發(fā)生。但本研究未能全面了解主要霉菌在雪茄煙支上的生長(zhǎng)規(guī)律，后續(xù)將通過以手工雪茄煙支為介質(zhì)，研究主要霉菌在雪茄煙支上的生長(zhǎng)情況，為手工雪茄霉變的防治提供更具參考價(jià)值的技術(shù)依據(jù)。

4 結(jié)論

曲霉屬、青霉屬和擬青霉屬是引起手工雪茄煙霉變的主要霉菌菌屬，其中聚多曲霉和產(chǎn)黃青霉是導(dǎo)致手工雪茄霉變的主要霉菌菌株。聚多曲霉和產(chǎn)黃曲霉適宜生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為DG18，其孢子懸浮液在60℃失活，對(duì)紫外照射不敏感。聚多曲霉最適生長(zhǎng)溫度30℃、濕度90%。產(chǎn)黃曲霉最適生長(zhǎng)溫度25℃、濕度70%。