外源CBD 緩解煙草Cd 脅迫的代謝組學(xué)分析

何怡，管嬌，郭笑維，杜玉嬌，余詩(shī)堯，周鵬，保志娟

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草學(xué)院，昆明 650201

重金屬污染影響植株的正常生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量，而鎘（Cd）是煙草最為敏感的重金屬之一[1-2]。通過對(duì)云南典型地質(zhì)高背景區(qū)土壤重金屬含量的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)表層土壤Cd 含量相對(duì)較高[3]，增加了農(nóng)用土壤重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。在重金屬脅迫下，植株中的糖類、氨基酸、有機(jī)酸等初生代謝物可作為滲透調(diào)節(jié)物提高其耐受性，同時(shí)次生代謝物激活抗氧化酶，減少重金屬積累過程的中間產(chǎn)物介導(dǎo)應(yīng)激反應(yīng)[4]，以應(yīng)對(duì)脅迫傷害。因此，研究代謝物變化已成為探索重金屬脅迫下植物響應(yīng)機(jī)制和應(yīng)對(duì)措施的重要手段[4-5]。

部分外源有機(jī)物、植物激素施用能緩解作物的重金屬毒害[6-7]。工業(yè)大麻是全球新興發(fā)展產(chǎn)業(yè)之一，大麻二酚（CBD）是工業(yè)大麻中主要的活性大麻素[8]。2018 年，世界反興奮劑機(jī)構(gòu)將CBD 排除在World Anti-Doping Code International Standard Prohibited List 2021之外[9]。云南省和黑龍江省已通過地方立法，相繼于2009 年與2017 年分別制定《云南省工業(yè)大麻種植加工許可規(guī)定》及《黑龍江省禁毒條例》等規(guī)定，允許在公安部門監(jiān)管下開展工業(yè)大麻的培育、種植、銷售和加工。2021 年《云南省“十四五”工業(yè)和信息化技術(shù)進(jìn)步規(guī)劃》將工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)列為重點(diǎn)發(fā)展產(chǎn)業(yè)[10]。CBD 具有抗痙攣、抗焦慮、抗炎等藥理活性，國(guó)外在醫(yī)療、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有應(yīng)用。CBD作為多基配體也能與金屬離子絡(luò)合形成環(huán)狀螯合物，在治理重金屬污染方面潛力巨大[11-12]。在符合管理規(guī)定的條件下，本課題組開展了CBD 在煙草農(nóng)業(yè)方面的研究。前期研究表明，CBD 對(duì)重金屬脅迫煙株的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用，但是具體的機(jī)理尚不清楚。代謝組技術(shù)可以量化植物生理生態(tài)的變化，為此本研究采用靶向和非靶向分析結(jié)合的代謝組學(xué)探討CBD對(duì)Cd 脅迫下煙草代謝物的影響，以期為降低煙草重金屬污染提供理論依據(jù)與參考措施。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2021 年在云南省昆明市進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，供試煙草品種為K326（玉溪中煙種子公司）。土壤采自云南自然背景低肥力紅壤（pH 6.84，有機(jī)質(zhì)6.97 g/kg，有效磷11.56 mg/kg，速效鉀101.33 mg/kg，堿解氮 18.91 mg/kg，全Cd 0.27 mg/kg），裝盆前過2 mm 篩，充分混勻。CBD 購(gòu)于云南漢盟制藥有限公司，純度99%。將其溶于含0.1%的二甲基亞砜和0.07%的吐溫80 混合水溶液中，配制成1 mg/L 的CBD 溶液（現(xiàn)配現(xiàn)用）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)3 個(gè)處理：正常生長(zhǎng)（CK），Cd 脅迫（60 mg/kg），Cd 脅迫煙株噴施外源CBD（Cd-CBD）。每株1 盆，每個(gè)處理6 盆。Cd 脅迫處理：將二水乙酸鎘溶解以污灌的形式施入花盆土壤中，根據(jù)土壤濕度，每盆灌注2 L，使土壤中Cd 含量為60 mg/kg，腐熟一個(gè)月之后進(jìn)行煙苗（苗齡55 d）移栽。Cd-CBD 處理：在移栽后50 d 上午，取Cd 脅迫處理煙株，第一次噴施1 mg/L CBD 液，使溶液附著于葉片正反面（濕潤(rùn)不流滴），3 d 后噴施第二次。同時(shí)，對(duì)CK 與Cd 處理以同樣的方法噴施含有二甲基亞砜和吐溫80 的空白混合水溶液。間隔3 d 后，用打孔器均勻地取總重約5 g 中部葉（自上而下第六位葉），根系部位用剪刀在主根與側(cè)根距根尖10 cm 處剪斷。每個(gè)部位均取6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本，迅速保存到液氮中。隨后將煙葉與根系冷凍真空干燥，研磨成粉末狀，-80℃保存待進(jìn)行初生代謝物、生物堿與植物激素的測(cè)定。

1.3 重金屬含量的測(cè)定

各處理選取3 株煙分部位收獲，先用自來水洗凈根、莖、葉表面，然后用0.01 mol·L-1EDTA 與去離子水將煙株清洗干凈，再用吸水紙吸干水分，于105℃下殺青30 min，65℃烘干至恒重，稱量每株煙地上、地下部分干重。將干燥后每株煙的地上部分、地下部分分別混合均勻，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法分別測(cè)定地上和地下部分的Cd 含量。

耐受系數(shù)=各處理煙株地上(下)部生物量／對(duì)照煙株地上(下)生物量

單株積累量=單株植物生物量×單株植物Cd 含量

1.4 代謝物提取及測(cè)定方法

初生代謝物及生物堿測(cè)定：準(zhǔn)確稱取50 mg 凍干煙根粉末參照Li 等[13]方法進(jìn)行初生代謝物的提取與衍生，以木糖醇做內(nèi)標(biāo)，基于GC-MS 對(duì)初生代謝物進(jìn)行非靶向測(cè)定。另分別取50 mg 凍干煙根與煙葉粉末參照鄭慶霞等[14]方法對(duì)生物堿進(jìn)行超聲萃取，以2,4’-二聯(lián)吡啶做內(nèi)標(biāo)，基于GC-MS 對(duì)8 種生物堿進(jìn)行靶向檢測(cè)。

植物激素測(cè)定：準(zhǔn)確稱取100 mg 凍干煙葉粉末，加入400 μL 甲醇/乙腈/水（1:1:1，v/v/v），勻漿后，加入600 μL 甲醇/乙腈/水（1:1:1，v/v/v），冰浴中超聲60 min，16000 g 4℃離心30 min，過濾后取上清，真空干燥。樣本復(fù)溶于80 μL 50%乙腈溶液中，20000 g離心15 min，取上清液以備LC-MS/MS 進(jìn)樣分析。

超高效液相色譜條件：樣品采用 NexeraX2 LC-30AD 超高壓液相色譜儀（Shimadzu）進(jìn)行分離。流動(dòng)相：A 液為10 mol/L 乙酸銨水溶液pH 8.0，B 液為100%乙腈。

質(zhì)譜分析：采用5500 QTRAP 質(zhì)譜儀（AB SCIEX）在正/負(fù)離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜分析。正電離電壓：5500 V，負(fù)電離電壓：4500 V。采用MRM 模式檢測(cè)待測(cè)離子對(duì)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

GC-MS 數(shù)據(jù)經(jīng)MS-DIAL 軟件的默認(rèn)參數(shù)對(duì)樣本的原始儀器數(shù)據(jù)文件進(jìn)行反卷積分析，圖片采用MetaboAnalyst 5.0、Origin 2021 進(jìn)行繪制。非靶向代謝組數(shù)據(jù)經(jīng)NIST 14 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行檢索，利用保留指數(shù)（RI 值）與Chemspider 公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)定性，最佳鑒定結(jié)果以質(zhì)譜相似度和RI 值接近度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)。生物堿與植物激素靶向代謝組數(shù)據(jù)分別采用ChemicalStation 與MultiQuant 軟件提取色譜峰面積及保留時(shí)間，并使用生物堿與植物激素標(biāo)準(zhǔn)品校正保留時(shí)間，進(jìn)行代謝物鑒定。通過方差分析（ANOVA，P＜0.05）與偏最小二乘判別分析（VIP值＞1）篩選差異代謝物，并利用MetaboAnalyst 軟件（https://www.metaboanalyst.ca/）進(jìn)行差異物的相關(guān)性分析與代謝通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源CBD 對(duì)Cd 脅迫下煙株吸收Cd 的影響

由表1 可知，在Cd 脅迫下，煙株的生物量顯著減少。添加CBD 后，生物量較單一Cd 脅迫升高了13.93%（地上）和31.63%（地下），且耐受系數(shù)較單一Cd 脅迫上升了13.75%（地上）和30.56%（地下）。原土壤中（CK）含有微量Cd，這時(shí)煙株地上部分的Cd 含量較低，主要富集在地下部分。Cd 脅迫下，煙株對(duì)Cd 的吸收量較CK 極顯著增加，且地上部分Cd的含量大于地下部分Cd 的含量。噴施CBD 后，地上部分Cd 單株積累量較單一Cd 處理下降了8.81%。

表1 Cd 在煙株體內(nèi)分布情況與各處理煙株耐受系數(shù)Tab.1 The distribution of Cd in tobacco plants and the tolerance coefficient of each treated plant

2.2 外源CBD 對(duì)Cd 脅迫下煙根初生代謝物的影響

2.2.1 初生代謝物的主成分分析

利用非靶向組學(xué)的方法進(jìn)行根部初生代謝物的測(cè)定，共檢測(cè)出103 種化合物。經(jīng)NIST 庫(kù)定性，保留匹配度大于80%的化合物，共定性出33 個(gè)化合物（表2），其中氨基酸3 種，有機(jī)酸10 種，糖7 種，烷烴7種，其它類化合物6 種；蘋果酸、蔗糖為代謝分泌物的主要成分，含量均超過了1 mg/g。利用內(nèi)標(biāo)（Xylitol）進(jìn)行歸一化后，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 分析。如圖1A，各處理樣本點(diǎn)均落于95%置信區(qū)間內(nèi)，且CK 與另外兩種處理各自聚為一類，說明數(shù)據(jù)處理結(jié)果可信。為排除初生代謝物的組內(nèi)差異的干擾，進(jìn)一步分清不同處理下初生代謝物的組間差異，作PLS-DA模型（圖1B），并進(jìn)行置換檢驗(yàn)，結(jié)果顯示R2=0.998、Q2=0.994，均大于原始R2、Q2，未發(fā)生過擬合現(xiàn)象，證明模型可靠。

圖1 PCA（A）與PLS-DA（B）Fig.1 PCA (A) and PLS-DA (B)

表2 根部初生代謝物平均含量Tab.2 Average content of primary metabolites in roots

2.2.2 初生代謝物差異分析

為了分清Cd 和CBD 對(duì)煙株的影響，利用PLS-DA模型以及ANOVA 分析篩選出VIP 值＞1 且P＜0.05 的化合物，將其作為潛在差異初生代謝物。本次實(shí)驗(yàn)3個(gè)處理共篩選出15 個(gè)含量差異的初生代謝物（表2），其中大多化合物屬于微量成分，有機(jī)酸（6 種）與烷類（5 種）數(shù)量較多，另外還包含2 種氨基酸、1 種糖類和1 種胺類。與CK 相比，Cd 脅迫下煙根中的葡萄糖酸含量下降，蘇糖酸、棕櫚酸、丁二酸、乙醇酸、肌醇半乳糖苷、丙氨酸、正二十一烷、正二十二烷、正二十三烷、正二十四烷、正二十五烷等11 個(gè)化合物的含量升高。與Cd 處理相比，施入CBD 后，煙根中肌醇半乳糖苷、蘇糖酸、棕櫚酸、丁二酸、乙醇酸、丙氨酸含量降低，正二十一烷、正二十二烷、正二十三烷、正二十四烷、正二十五烷、葡萄糖酸含量升高。

2.3 CBD 對(duì)Cd 脅迫煙草生物堿的影響

對(duì)CK、Cd、Cd-CBD 處理煙葉的生物堿進(jìn)行分析（圖2）。由圖2 可知，煙堿、降煙堿、假木賊堿、新煙草堿為煙株根、葉中的主要生物堿。煙根中的煙堿和降煙堿含量顯著高于葉部，而假木賊堿含量葉和根部差異不大，其他5 種生物堿皆是葉＞根。在Cd 脅迫下，根部煙堿顯著升高，除二烯煙堿無明顯變化外，其它6 種生物堿含量下降；葉片內(nèi)生物堿變化較根部顯著，煙堿、降煙堿、新煙草堿含量升高，其余5 種生物堿含量降低。施用CBD 后，根部降煙堿、麥斯明、N-甲基假木賊堿、假木賊堿、新煙草堿等含量均有回升；而葉片中的生物堿均呈下降趨勢(shì)，除降煙堿外，其它7 種生物堿的總含量與Cd 相比差異顯著。

圖2 不同處理下8 種生物堿在煙株葉片與根部的濃度Fig.2 The concentrations of 8 alkaloids in leaves and roots of tobacco plants under different treatments

2.4 CBD 對(duì)Cd 脅迫煙葉激素的影響

利用LC-MS/MS 技術(shù)對(duì)3 種處理煙葉中的12 種植物激素進(jìn)行測(cè)定，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品含量，并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表3 所示。與CK 相比，Cd 脅迫使葉片中脫落酸、赤霉素1、二氫茉莉酸、3-吲哚丁酸和水楊酸含量顯著降低；而3-吲哚乙酸、茉莉酸、茉莉酸-異亮氨酸、褪黑素、反式玉米素含量顯著增加。在施入CBD 后，除赤霉素3、茉莉酸和二氫茉莉酸外，上述激素含量有向CK 回調(diào)的趨勢(shì)，其中脫落酸、3-吲哚乙酸以及水楊酸的含量與CK 無顯著差異。而反式玉米素核苷在三種處理下變化不明顯。

2.5 相關(guān)性分析

本次實(shí)驗(yàn)基于GC-MS 和LC-MS/MS 的靶向和非靶向組學(xué)方法共獲得35 個(gè)差異合物（15 種初生代謝物、8 種生物堿、12 種植物激素）。利用MetaboAnalyst 5.0 對(duì)上述35 個(gè)差異化合物進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)共有1189 對(duì)呈顯著相關(guān)性的化合物對(duì)，其中有346 對(duì)呈負(fù)相關(guān)，844 對(duì)呈正相關(guān)（圖3）。呈顯著正相關(guān)的代謝物之間具有相似的生物學(xué)功能、化學(xué)成分或同屬的特征[15]。與煙堿含量正相關(guān)的化合物有27 個(gè)，其中包含6 個(gè)生物堿，3 個(gè)有機(jī)酸（葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸），1 個(gè)糖類（肌醇半乳糖苷），1 個(gè)醇類（甘油），6個(gè)烷烴類（正二十一烷、正二十二烷、正二十三烷、正二十四烷、正二十五烷、正二十六烷），10 個(gè)植物激素（茉莉酸-異亮氨酸、水楊酸、赤霉素1、赤霉素3、3-吲哚乙酸、脫落酸、3-吲哚丁酸、反式玉米素、茉莉酸、二氫茉莉酸）等，以上物質(zhì)可能是重金屬脅迫下，調(diào)控?zé)焿A積累的重要代謝物。與煙堿含量呈負(fù)相關(guān)的化合物有7 個(gè)，包括1 個(gè)胺類（酪胺）、2 個(gè)氨基酸（焦谷氨酸、丙氨酸）、3 個(gè)有機(jī)酸（硬脂酸、丁二酸、奎寧酸）、1 個(gè)植物激素（褪黑素）。

圖3 差異代謝物相關(guān)性Fig.3 Correlation of differential metabolites

2.6 CBD 及Cd 脅迫對(duì)煙株代謝通路的影響

結(jié)合CK、Cd、Cd-CBD 三種不同處理下煙草的差異代謝物進(jìn)行KEGG 富集分析。CK 與Cd 代謝通路富集分析結(jié)果表明（圖4A，表4），差異代謝物主要富集的代謝通路為半乳糖代謝、硫代謝、TCA 循環(huán)、甘油脂代謝、色氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、類胡蘿卜素生物合成等。在這7 種代謝途徑中富集了6 個(gè)差異代謝物，肌醇半乳糖苷、甘油、丁二酸、焦谷氨酸、3-吲哚乙酸與脫落酸。焦谷氨酸、丁二酸、褪黑素與煙堿呈負(fù)相關(guān)，3-吲哚乙酸、脫落酸與生物堿類化合物呈正相關(guān)。

圖4 代謝通路富集分析Fig.4 Metabolomics pathway analysis

表4 差異組分參與的代謝途徑Tab.4 Metabolic pathways involving differentially expressed metabolites.

Cd 與Cd-CBD 代謝通路富集分析結(jié)果表明（圖4B，表4），差異代謝物主要富集的代謝通路為色氨酸代謝、硫代謝、酪氨酸代謝、TCA 循環(huán)、類胡蘿卜素生物合成等。在這5 種代謝途徑中富集了5 個(gè)差異代謝物，丁二酸、酪胺、3-吲哚乙酸、褪黑素與脫落酸。由相關(guān)性分析可知丁二酸、酪胺、褪黑素與煙堿呈負(fù)相關(guān)，3-吲哚乙酸、脫落酸與生物堿合成呈正相關(guān)。

3 討論

逆境脅迫下，植株體內(nèi)代謝物質(zhì)發(fā)生重排，參與植物在非生物脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)[16-17]。當(dāng)作物受到重金屬脅迫時(shí)，有機(jī)酸作為植物抵抗非生物脅迫的一類重要代謝物大量生成[18]。研究表明，暴露于Cd 的植物會(huì)釋放更多的蘇糖酸來遷移Cd，增加植物對(duì)Cd 的吸附和積累[19]。同時(shí)，根際分泌的低分子有機(jī)酸會(huì)與Cd 螯合形成“Cd-低分子有機(jī)酸”復(fù)合物，從而調(diào)控Cd 向煙株體內(nèi)的遷移[20]。在本研究中，煙草根部共檢測(cè)出6 種有機(jī)酸類差異代謝物。其中，蘇糖酸、丁二酸、乙醇酸在Cd 脅迫下的含量較CK 均顯著升高，Cd 很有可能是通過與這3 種有機(jī)酸螯合，以達(dá)到向煙株地上部分轉(zhuǎn)移的目的。糖類物質(zhì)在植株體內(nèi)積累，在逆境中既可起滲透調(diào)節(jié)作用，也可作為能量供給、合成代謝的重要底物[21-22]。本研究結(jié)果顯示，Cd 脅迫下，煙草根中肌醇半乳糖苷含量較CK 極顯著升高。肌醇半乳糖苷的合成是棉子糖家族寡糖代謝的第一步，其作為滲透調(diào)節(jié)劑，響應(yīng)非生物脅迫[23]。氨基酸是植物體內(nèi)氮的主要形式之一，具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)、礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)吸收和重金屬解毒等多種功能，是重要的代謝產(chǎn)物[24-26]。本研究中Cd 脅迫煙草根系中丙氨酸含量較CK 極顯著升高。在施用外源CBD 后，以上發(fā)生顯著上調(diào)的有機(jī)酸、糖、氨基酸等初生代謝物含量均有所下降。

CBD 對(duì)Cd 脅迫的緩解作用，一方面可能是利用了多酚類化合物的還原性，滲透到脂質(zhì)雙分子層抑制脂質(zhì)過氧化，阻礙自由基的傳播[27]。另一方面可能是作為多羥基配體，為金屬離子提供了不同的正離子結(jié)合位點(diǎn)[28-29]，影響了重金屬的生物利用度、含量和遷移率[30]，使游離態(tài)的Cd 離子減少，煙株脅迫響應(yīng)降低。植物激素作為化學(xué)信使調(diào)節(jié)細(xì)胞間的通信，率先做出響應(yīng)[31]。研究結(jié)果顯示，褪黑素、茉莉酸-異亮氨酸、脫落酸、3-吲哚乙酸等9 種激素均在施入CBD 后含量有向CK 水平值變化的趨勢(shì)。茉莉酸類物質(zhì)與脫落酸的作用類似，與植物的抗性密切相關(guān)[32]。褪黑素、3-吲哚乙酸可與重金屬離子發(fā)生螯合作用，同時(shí)可作為內(nèi)源性自由基清除劑參與抗氧化調(diào)節(jié)，緩解重金屬對(duì)植物的傷害[33-34]。本試驗(yàn)中，在Cd 脅迫下，隨著3-吲哚乙酸、茉莉酸、茉莉酸-異亮氨酸、反式玉米素這類與煙堿呈正相關(guān)的植物激素的增加，煙堿的含量較CK 顯著升高。生物堿是煙草對(duì)外界環(huán)境長(zhǎng)期適應(yīng)過程中形成的一大類抗逆次生代謝物，在遇到環(huán)境脅迫和生物侵?jǐn)_時(shí)會(huì)瞬間大量合成[35]。在添加CBD 后，根部中大多數(shù)生物堿含量有向CK 回調(diào)的趨勢(shì)，并且使煙葉生物堿的含量整體呈下降趨勢(shì)。

初生代謝物與次生代謝物的含量變化必然引起代謝途徑的改變。通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫下，外源CBD 的施用對(duì)色氨酸代謝、硫代謝、酪氨酸代謝、TCA 循環(huán)、類胡蘿卜素生物合成這5 條代謝途徑的影響最顯著。色氨酸代謝是響應(yīng)非生物脅迫的一條重要代謝通路[36]。酪氨酸代謝途徑中的生育酚是植物中重要的抗氧化劑，且酪氨酸是植物中多種特異性次生代謝物的來源（如芐基異喹啉類生物堿）[37]。而硫代謝的恢復(fù)，有利于提高植株對(duì)養(yǎng)分的吸收利用，從而使TCA 循環(huán)等能量代謝通路趨于正常，保證了煙草中生物堿類等特異性次生化合物的穩(wěn)定合成。這對(duì)于緩解煙草鎘脅迫具有重要作用。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)煙株Cd 積累量，以及初生代謝物、生物堿和植物激素進(jìn)行非靶向與靶向測(cè)定，分析外源CBD 對(duì)煙草Cd 脅迫的緩解效應(yīng)。結(jié)果表明，CBD 能提高煙株的生物量，顯著降低煙株地上部分的Cd 積累量。煙草植株在Cd 脅迫下，各類代謝產(chǎn)物產(chǎn)生了不同的變化。在外源添加CBD 后，部分有機(jī)酸、糖類、氨基酸、生物堿與植物激素等代謝產(chǎn)物恢復(fù)至正常水平。通過KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)，CBD 主要通過調(diào)節(jié)色氨酸、酪氨酸和硫代謝過程，在一定程度上有效緩解Cd 對(duì)植株的毒害。