細(xì)柱西番蓮高效再生體系的建立

解貽龍，陳巧玲，吳菁華*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002；2.福州綠榕園林工程有限公司，福建福州 350000）

西番蓮科（Passifloraceae）有18 個(gè)屬630 多種植物，西番蓮屬（Passiflora）約有500 多種，多分布在北美和南美，擁有超過95%的西番蓮科植物[1]。西番蓮花5 瓣，兩性花，輻射對(duì)稱，花被明顯，花萼和花瓣形狀和大小不同?；ò晖ǔＪ悄べ|(zhì)的，在花萼管的邊緣發(fā)育，西番蓮花都有一個(gè)雌雄蕊柄，將5 個(gè)融合的雄蕊提升到基部，并與由3 個(gè)融合心皮組成的雌蕊群相[2-3]。不同西番蓮屬植物在葉、果實(shí)和花等形態(tài)特征上差異較大，用途也各不相同。部分西番蓮屬植物的果實(shí)可以作為水果食用；一部分西番蓮植物的葉或花的提取物也可以用在醫(yī)藥、化妝品等產(chǎn)品中；有一部分類型具有很高的觀賞價(jià)值，被開發(fā)作為園林觀賞植物[2]。

細(xì)柱西番蓮（Passiflora suberosa L.）廣泛分布于西印度群島、墨西哥和南美洲中部地區(qū)[2]。在我國(guó)臺(tái)灣、云南、福建等地有分布[4]，常作為觀賞植物，也可用作鎮(zhèn)靜劑，用于治療高血壓、糖尿病和皮膚病[4-5]。植物高效再生體系是植物快繁、誘變、倍性及基因工程育種的基礎(chǔ)。西番蓮屬植物組織培養(yǎng)的報(bào)道較多[6]，國(guó)內(nèi)主要以食用西番蓮為主[7-9]。該文以福建省野生細(xì)柱西番蓮為材料，探索高效再生體系，為細(xì)柱西番蓮的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

將細(xì)柱西番蓮種子消毒后播種在MS 培養(yǎng)基中，待苗高約4 cm 時(shí)，選取真葉、葉柄和帶節(jié)的莖段用于組織培養(yǎng)。

1.2 愈傷組織與不定芽誘導(dǎo)

將葉片剪切至直徑為1 cm 左右大小的三角形，葉柄切至1 cm 長(zhǎng)，用于誘導(dǎo)愈傷和誘導(dǎo)叢生芽。誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基和誘導(dǎo)叢生芽的培養(yǎng)基為MS+ 蔗糖30 g/L+ 瓊脂7 g/L+6-BA（0、0.5、1.0、2.0 mg/L）。每瓶接種2 個(gè)外植體，每次接種10 瓶，重復(fù)3 次。接種后7 d 統(tǒng)計(jì)污染率，15 d統(tǒng)計(jì)死亡率、褐化率，30 d 統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率，繼代培養(yǎng)30 d 統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)。

死亡率（%）=死亡數(shù)/接種總數(shù)×100；

愈傷組織誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100；

不定芽誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100；

芽增殖系數(shù)=分化出芽的數(shù)量/誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)。

1.3 帶芽莖段誘導(dǎo)不定芽

每個(gè)莖段保留1 個(gè)芽點(diǎn)，水平接至培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基使用MS+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L+6-BA（0、1.0、2.0 mg/L），30 d 統(tǒng)計(jì)存活率、增殖率。

死亡率（%）=死亡數(shù)/接種總數(shù)×100；

增殖率（%）=分化出芽的數(shù)量/接種總數(shù)×100。

1.4 壯苗生根

將誘導(dǎo)出的小芽分別接種在添加不同濃度的IBA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和1 g/L 活性炭的1/2MS 培養(yǎng)基中。為比較MS 和1/2MS 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)柱西番蓮生根的影響，也將小芽接種在MS+活性炭1 g/L+IBA 1.0 mg/L 的培養(yǎng)基中。每處理接種5 瓶，每瓶3 個(gè)小芽。每隔3 d 統(tǒng)計(jì)生根情況，30 d 時(shí)觀察植株表現(xiàn)并統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率（%）=生根植株數(shù)/接種總數(shù)×100。

1.5 煉苗移栽

待組培苗長(zhǎng)至3～4 cm 高時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)健壯、根系發(fā)達(dá)的再生苗進(jìn)行煉苗移栽。先在組培室中打開瓶蓋放置2～3 d。從組培瓶中取出組培苗后用自來水將根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至草炭土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1 的基質(zhì)中。移栽后澆透水，適當(dāng)通風(fēng)并保持空氣濕度，每天對(duì)葉面噴水保濕，待有新芽生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)至戶外正常管理，統(tǒng)一水肥管理。每次移栽10 棵，重復(fù)3 次。

成活率（%）=成活數(shù)/煉苗總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)柱西番蓮愈傷組織及不定芽誘導(dǎo)

2 種外植體在不加激素的培養(yǎng)基中表現(xiàn)相似，沒有誘導(dǎo)出愈傷組織，外植體逐漸死亡（圖1A），葉柄的褐化及死亡率較真葉小。從表1 可以看出，加入6-BA 后促進(jìn)了細(xì)柱西番蓮愈傷組織和不定芽的分化，1 mg/L 6-BA 促進(jìn)愈傷組織分化的效果較好，真葉和葉柄的分化率分別達(dá)到93.33%和95%。葉柄的傷口部位產(chǎn)生大量愈傷，且在培養(yǎng)的第30 d 產(chǎn)生肉眼可見的不定芽（圖1B），而真葉則在第25 d 分化出小芽（圖1C）。當(dāng)6-BA 提高到2 mg/L 時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率與1 mg/L 相近，但是愈傷組織生長(zhǎng)減緩，30 d 統(tǒng)計(jì)時(shí)未見不定芽的分化。

表1 不同濃度6-BA 對(duì)真葉和葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表2 可以看出，愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)30 d 后發(fā)現(xiàn)除沒有添加激素的MS 培養(yǎng)基外，其他培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽，接種在添加6-BA 培養(yǎng)基中的外植體均有不定芽產(chǎn)生。當(dāng)6-BA 濃度在1 mg/L 時(shí)，葉柄（圖2A）和真葉（圖2B）分化率最高，分別為33.33%和51.67%，增殖系數(shù)分別為2.86 和5.10。隨著6-BA 濃度的上升，真葉及葉柄的分化率下降，增殖系數(shù)也顯著下降。

圖2 葉柄和真葉誘導(dǎo)的愈傷組織分化不定芽

表2 不同部位在不同培養(yǎng)基中分化結(jié)果

2.2 帶芽莖段誘導(dǎo)不定芽

將帶芽莖段分別接種在不添加6-BA 的培養(yǎng)基中，芽點(diǎn)正常生長(zhǎng)，葉片綠色加深，植株生長(zhǎng)健壯，但幾乎不會(huì)發(fā)生增殖，也沒有生根（圖3A）。芽點(diǎn)在添加1 mg/L 6-BA的MS 培養(yǎng)基中分化出大量新芽，并能正常伸長(zhǎng)，在帶芽莖段兩端分化愈傷組織（圖3B），此時(shí)帶芽莖段的增殖率也最高，達(dá)5.99%。當(dāng)6-BA 濃度增加到2 mg/L 時(shí)，帶芽莖段也能分化出不定芽，但植株葉片偏小，生長(zhǎng)勢(shì)偏弱，節(jié)間短，并出現(xiàn)部分新枝條死亡的現(xiàn)象（圖3C）。

圖3 帶芽莖段在不同培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽

2.3 生根培養(yǎng)

從表3 可以看出，將大小一致的不定芽接種到生根培養(yǎng)基后定期觀察，小苗大約在16 d 后開始長(zhǎng)根，培養(yǎng)30 d 后對(duì)根和植株的生長(zhǎng)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。比較1/2 MS 和MS 培養(yǎng)基對(duì)細(xì)柱西番蓮生根的影響，發(fā)現(xiàn)MS 培養(yǎng)基較1/2MS 好，生根率高，根的發(fā)育也更好。將分化的不定芽接種在含有不同濃度IBA 的MS 培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)添加1 mg/L IBA 培養(yǎng)基的細(xì)柱西番蓮的生根率最高，植株和根的生長(zhǎng)狀態(tài)也最好（圖4）。因此，MS+1 mg/L IBA 適合細(xì)柱西番蓮的生根培養(yǎng)。

圖4 細(xì)柱西番蓮生根培養(yǎng)

表3 不同培養(yǎng)基對(duì)生根的影響

2.4 煉苗移栽

將株高約3～4 cm 的再生小植株先在培養(yǎng)室中根據(jù)扦插時(shí)進(jìn)行的基質(zhì)篩選，細(xì)柱西番蓮在草炭土∶珍珠巖=3∶1 的基質(zhì)中移栽，表現(xiàn)較好，移栽成活率達(dá)到83.33%（圖5）。

圖5 移栽

3 結(jié)論與討論

目前已經(jīng)利用西番蓮不同類型的外植體，如葉片、根、下胚軸、莖節(jié)、節(jié)間節(jié)、葉柄和卷須建立再生體系，葉片、下胚軸、根段、子葉和胚乳均可以誘導(dǎo)形成不定芽[10-12]。不同外植體誘導(dǎo)不定芽需要的激素不同：下胚軸和子葉在添加1.0 mg/L BA 的MS 培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)形成不定芽的頻率最高；真葉和胚乳的最佳濃度為2.0 mg/L BA；根段需要1.0 mg/L KIN 才能較好地誘導(dǎo)不定芽[13]。Guzzo 等人對(duì)62種西番蓮合子胚進(jìn)行培養(yǎng)，有29 種產(chǎn)生了愈傷組織，13種西番蓮的愈傷組織成功地再生了植株[14]。該試驗(yàn)利用細(xì)柱西番蓮的真葉和帶芽莖段都能誘導(dǎo)不定芽，這與其他西番蓮的研究結(jié)果比較類似，表明西番蓮屬植物不同外植體都具有較好的脫分化和再分化能力。

在組織培養(yǎng)中，獲得不定芽的途徑主要有2 條：直接器官發(fā)生型和間接器官發(fā)生型。在西番蓮屬植物的組織培養(yǎng)中利用這2 條途徑均可以獲得不定芽。西雙版納西番蓮在添加6-BA 和NAA 和1/2 MS 培養(yǎng)基上，可誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)和不定芽[15]。龍珠果在低濃度的6-BA 和NAA 的MS 培養(yǎng)基上有利于誘導(dǎo)叢生芽并促進(jìn)芽的生長(zhǎng)，而在高濃度的6-BA 和NAA 的MS 培養(yǎng)基上有利于誘導(dǎo)愈傷組織[16]。

西番蓮的再生還可以通過體胚發(fā)生途徑產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn)西番蓮的根和成熟合子胚均可以作為體細(xì)胞胚胎發(fā)生的外植體，但成熟合子胚誘導(dǎo)的研究較根多，已在多種西番蓮中獲得成功[17-18]。P. foetida、P. giberti 和P.cincinnata的成熟合子胚都可以誘導(dǎo)體胚產(chǎn)生[19]。P. cincinnata 體細(xì)胞胚胎發(fā)生需要有較高濃度的2，4-D 和6-BA。然而，P. suberosa 的合子胚在相同的條件下培養(yǎng)僅觀察到不定芽的形成[19]。因此，不同西番蓮的體胚再生體系還需要更多的研究。

激素類型和濃度是影響植物組織培養(yǎng)的主要因素之一。在西番蓮屬植物的組織培養(yǎng)中，常用到的細(xì)胞分裂素有6-BA、2，4-D、TDZ 和KIN，生長(zhǎng)素有IAA 和NAA，有一些種類還用到了GA3[6]。在西番蓮屬的組織培養(yǎng)中，有多種類型只用6-BA 或者6-BA 與TDZ 或KIN 組合，就能誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽，如P.caerulea 的帶芽莖段和P.cincinnata的根在添加4.44 μM 6-BA 的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)不定芽，可作為后續(xù)試驗(yàn)的參考[20-21]。