蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留分析及膳食攝入風險評估

石會娟，張敏，張金振，黃京平，趙文，王鵬，胡菡，薛曉鋒，金玥

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100193）

蜂花粉是工蜂采集花粉，用唾液和花蜜混合后形成的物質(zhì)[1]，含有多種氨基酸、ω-3脂肪酸、復合維生素B、礦物質(zhì)和多酚等物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價值[2]，被認為是人類營養(yǎng)的寶庫[3]。有研究表明蜂花粉具有抗氧化[4]、抗菌[5]、抗炎[6]、抗癌[7]、保肝[8,9]、保護心臟[10]、抗過敏活性和抑制免疫反應(yīng)[11]的作用，常作為天然膳食補充劑[12-14]。然而，由于特殊的生產(chǎn)方式和暴露的生產(chǎn)環(huán)境，蜂花粉極易吸附環(huán)境中的污染物，常作為環(huán)境指示劑[2]。同時，蜜源植物種植過程施用農(nóng)藥也會造成蜂花粉污染物殘留，危害食用者健康[15]。

新煙堿農(nóng)藥是目前使用最廣泛的殺蟲劑[16]。這主要得益于其對哺乳動物低毒的特性。然而，已有報道指出新煙堿農(nóng)藥的過度使用和長期積累，會對哺乳動物產(chǎn)生慢性、累積毒性[17]，導致生育能力下降[18]，發(fā)育遲緩[19]，運動活性降低[20]，染色體畸變率增加[21]，誘發(fā)乳腺癌[22]等疾病。目前我國登記使用的新煙堿農(nóng)藥共10種，包括吡蟲啉、噻蟲嗪、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、烯啶蟲胺、氯噻啉、哌蟲啶和環(huán)氧蟲啶，其中前8種使用較廣泛，涉及作物50余種。新煙堿農(nóng)藥具有良好的滲透性和內(nèi)吸傳導性，能夠從土壤、種子、水源遷移至植物花粉和花蜜中，經(jīng)蜜蜂采集污染蜂產(chǎn)品[23]。

Tang等[24]、Wen等[25]和Xiao等[26]均在蜂花粉中檢出多種新煙堿農(nóng)藥。歐盟SANTE/11278/2021規(guī)定了啶蟲脒、吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺在蜂產(chǎn)品中的最大殘留限量（MRLs）為50 ng/g，噻蟲啉為200 ng/g[27]；日本規(guī)定啶蟲脒在蜂產(chǎn)品中的MRL為200 ng/g[28]；目前我國《GB 2763-2021食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[29]規(guī)定了新煙堿農(nóng)藥在主要糧食作物和果蔬中的MRLs為10～2000 ng/g，而未在蜂產(chǎn)品中規(guī)定其限量。因此，開展我國多地區(qū)、多種蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留分析及其膳食攝入風險評估，具有十分重要的意義。

本研究利用QuEChERS前處理方法結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法分析了我國主要養(yǎng)蜂區(qū)的66批次蜂花粉樣品中8種常用新煙堿農(nóng)藥的殘留情況，并根據(jù)殘留濃度、膳食結(jié)構(gòu)和毒理學數(shù)據(jù)進行膳食攝入風險評估，可為新煙堿農(nóng)藥在蜜粉源植物生長過程中的科學使用，以及在蜂花粉中MRLs的制定提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1290-6495 高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國Agilent公司；天平（十萬分之一天平，百分之一天平），梅特勒-托利多（上海）；TTL-DC Ⅱ水浴氮吹儀，中國同泰聯(lián)公司；CR22GⅡ高速離心機，日本日立；Vortex-Genie2渦旋混合器，美國Scientific Industries；Integral5 Mili-Q去離子水發(fā)生器，美國Mili-Q。

乙腈、甲醇（色譜級），德國Merck公司；檸檬酸鈉、檸檬酸二鈉倍半水合物、無水硫酸鎂、氯化鈉、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～60 μm）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA，40～60 μm）、石墨化碳黑（GCB，40～ 60 μm），均購于美國Agilent公司；甲酸（色譜純），美國Fisher Scientific；吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪、噻蟲胺、噻蟲啉、呋蟲胺、氯噻啉、吡蟲啉-d4、啶蟲脒-d3、噻蟲嗪-d3、呋蟲胺-d4（純度均≥98%），天津阿爾塔公司。

1.2 樣品采集

于2022年，在河南、四川、江蘇、甘肅、湖北、山東6個主要養(yǎng)蜂區(qū)分別采集16、12、9、9、6、5批次，以及其他地區(qū)9批次（安徽2批次，廣東、青海、浙江、山西、吉林、內(nèi)蒙古、江西各1批次）；采集樣品包括油菜花粉28批次，茶花粉17批次，蕎麥花粉10批次，雜花粉7批次，其他花粉4批次（荷花花粉2批次，蠶豆和玉米花粉各1批次）共計采集蜂花粉樣品66批次，每份樣品500 g，置于樣品瓶中密封，4 ℃條件下保存，備用。

1.3 樣品前處理

參考宋梓豪[30]所開發(fā)的QuEChERS前處理方法：準確稱取2 g（精確至0.01 g）蜂花粉樣品于50 mL塑料離心管中，加入10 mL水渦旋混勻1 min，加入10 mL乙腈渦旋混勻1 min。加入4 g無水硫酸鎂、1 g氯化鈉、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸二鈉倍半水合物，劇烈振蕩并渦旋10 min，于4 ℃，9000 r/min離心10 min。準確移取7 mL上清液于含有1200 mg硫酸鎂、400 mg PSA、400 mg C18和45 mg GCB的15 mL離心管中。渦旋混勻10 min，于4 ℃，9000 r/min離心10 min。吸取1 mL上清液，于40 ℃水浴氮氣吹干，1 mLφ=20%乙腈水溶液復溶，過0.22 μm微孔濾膜待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.4 儀器測定條件

色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為φ=0.1%甲酸水溶液，B為乙腈；流動相梯度洗脫：0～4 min，20% A～60% A；4～4.1 min，60% A～100% A；4.1～6 min，100% A～100 %A；6～6.1 min，100% A～20% A；6.1～9.5 min，20% A。柱溫：40 ℃；進樣量：3 μL；電離方式：電噴霧電離；掃描方式：正離子掃描，MRM模式；霧化氣：氮氣；霧化氣壓力：310 kPa；離子噴霧電壓：3500 V；干燥器溫度：250 ℃；干燥氣流速：7 L/min；離子監(jiān)測條件參照宋梓豪[30]一文。

1.5 膳食攝入風險評估

膳食攝入風險評估是以毒理學和殘留化學評估為基礎(chǔ)，根據(jù)我國居民膳食消費量，估算農(nóng)藥的膳食攝入量，計算膳食攝入風險，包括長期和短期膳食攝入風險。參考我國《食品中農(nóng)藥殘留風險評估指南》（中華人民共和國農(nóng)業(yè)部，2015）第三章，對本研究中來自蜂花粉樣品的新煙堿農(nóng)藥殘留進行膳食風險評估。

估算蜂花粉長期日均攝入量（National Estimated Daily Intake，NEDI）和短期攝入量（National Estimated Short Term Intake，NESTI），計算公式如下：

式中：

C——長期日均攝入量（NEDI），g；

D——短期攝入量（NESTI），g；

Z——蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留濃度中值（STMR），ng/g；

F1——長期食用蜂花粉人群的日均消費量，取20 g/d；

E——蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的最高殘留濃度（HR），ng/g；

F2——短期內(nèi)單次或多次食用蜂花粉的日攝入量，取40 g/d。

計算膳食攝入長期風險（RQ1，%）和短期風險（RQ2，%），計算公式如下：

式中：

Q1——長期風險（RQ1），%；

Q2——短期風險（RQ2），%；

A——每日允許攝入量（Acceptable Daily Intake，ADI），來源于GB 2763-2021《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[29]mg/(kg bw·d)；

B——急性參考劑量（Acute Reference Dose，ARfD），來源于英國赫特福德大學農(nóng)藥特性數(shù)據(jù)庫[31]，mg/(kg bw·d)；

bw——體質(zhì)量，本研究中取60 kg。

計算各新煙堿農(nóng)藥的膳食攝入風險商，評估風險值大小。RQ值越小風險越小，當某種農(nóng)藥在蜂花粉中的殘留水平導致RQ1＞100%時，表示居民長期攝食該蜂花粉可能帶來不可接受的健康風險；當某種農(nóng)藥殘留導致RQ2＞100%時，表示偶爾、短期攝入該蜂花粉也可能造成健康危害。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 26.0和Excel完成數(shù)據(jù)計算，Origin完成圖形繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢出限、定量限、線性范圍、回收率及精密度

本研究中8種新煙堿農(nóng)藥的檢出限為0.3 ng/g，定量限為1.0 ng/g，分別以3倍和10倍信噪比計算獲得。在0.15～50 μg/L范圍內(nèi)具有較好的線性相關(guān)性，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999。對空白蜂花粉樣品進行加標回收實驗，加標的水平分別為1、2、10、50 ng/g，制備6份，按上述方法連續(xù)三天進行測定，考察精密度。結(jié)果表明分析物的平均回收率在83.1%～119%之間，日內(nèi)和日間相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）均小于16.1%。實驗證明，本實驗方法的定性、定量分析、線性關(guān)系、回收率能夠保證檢測結(jié)果的準確性和再現(xiàn)性。

2.2 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的殘留水平

2.2.1 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的總體情況

如表1所示，在66批次蜂花粉樣品中，共檢出5種新煙堿農(nóng)藥，檢出率最高的是噻蟲嗪（31.8%），其次是吡蟲啉（22.7%）、噻蟲胺（19.7%），啶蟲脒（16.7%）、檢出率最低的是呋蟲胺（12.1%）。平均殘留濃度從高到低依次是啶蟲脒（20.1 ng/g）、呋蟲胺（9.2 ng/g）、吡蟲啉（8.3 ng/g）、噻蟲嗪（8.1 ng/g）和噻蟲胺（1.8 ng/g）。檢出濃度最高的是啶蟲脒（195.1 ng/g），其次是吡蟲啉（59.9 ng/g），僅啶蟲脒和吡蟲啉的最大殘留濃度超過了歐盟規(guī)定的MRLs（50 ng/g）[27]。除啶蟲脒檢出濃度較高外，其余幾種新煙堿農(nóng)藥的檢出濃度范圍與Colding等[32]報道的結(jié)果相似。啶蟲脒是我國主要使用的新煙堿農(nóng)藥之一，已在我國蜂蜜、蜂花粉和蜂糧樣品中檢出，在Wang等[33]的研究中啶蟲脒是我國蜂蜜中檢出率最高的新煙堿農(nóng)藥。蜂花粉中啶蟲脒的高殘留率和殘留濃度，與其在我國農(nóng)作物上廣泛施用有關(guān)。

表1 蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況Table 1 The detection rate and residue concentration of neonicotinoids in different bee pollen samples

50.0 %的蜂花粉樣品中檢出一種及以上的新煙堿農(nóng)藥，檢出率與Tao等[24]和Wen等[25]的在我國油菜花粉中的檢出結(jié)果相似，低于Mitchell等[34]報道的蜂蜜樣品中新煙堿農(nóng)藥的檢出率。檢出1種藥物的樣品占比16.7%，檢出多種藥物殘留的樣品占比33.3%（其中檢出2種農(nóng)藥的占21.2%，檢出3種的占4.6%，檢出4種的占7.6%）。茶花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率最高，達82.4%，其次為油菜花粉（50.0%）、雜花粉（28.6%）和蕎麥粉（20.0%）。除蕎麥花粉外，其余蜂花粉樣品中均存在多種藥物殘留現(xiàn)象，多殘留比例在茶花粉、雜花粉和油菜花粉中分別為64.6%、28.6%和25.0%，并且只在茶花粉中同時檢出3～4種新煙堿農(nóng)藥（圖1）。結(jié)果表明，我國蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥呈現(xiàn)多殘留特征，說明在蜜粉源植物種植期有多種藥物混合施用的現(xiàn)象。檢出的33批次蜂花粉樣品中，平均殘留濃度從高到低依次是雜花粉（102.3 ng/g）、蕎麥粉（31.5 ng/g）、茶花粉（14.8 ng/g）、油菜花粉（9.1 ng/g）和其他花粉（5.5 ng/g）。蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的最高殘留濃度為200.7 ng/g（雜花粉），其次為59.9 ng/g（蕎麥粉）。所有陽性樣品中新煙堿農(nóng)藥的平均檢出濃度為18.9 ng/g，中位檢出濃度9.8 ng/g，殘留濃度的中位值均不高于平均值，這表明蜂花粉樣品中的新煙堿農(nóng)藥主要是低濃度殘留。

圖1 不同植物源蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率Fig.1 The detection rate of neonicotinoids in different bee pollen samples

2.2.2 新煙堿農(nóng)藥在不同植物源蜂花粉樣品中的殘留情況

通過對不同植物源花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留特征的統(tǒng)計分析，經(jīng)卡方檢驗分析表明茶花粉中新煙堿農(nóng)藥的檢出率，顯著高于油菜花粉、雜花粉和蕎麥花粉；并且茶花粉的多殘留比例，也顯著高于其他三種花粉（P＜0.05）。在我國吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪和呋蟲胺等新煙堿農(nóng)藥已登記用于茶樹防治茶小綠葉蟬等蟲害。在茶樹種植期間，預防性用藥，以及高頻率和多種藥物混合施用，是導致茶花粉中新煙堿農(nóng)藥多殘留和高殘留率的主要原因。同時值得注意的是，新煙堿農(nóng)藥中僅噻蟲嗪登記用于油菜的蚜蟲等病蟲害防治，但在油菜花粉中，檢出4種新煙堿農(nóng)藥，說明在油菜種植期存在混用、濫用以及外界環(huán)境污染現(xiàn)象。

檢出的33批次蜂花粉樣品中，雜花粉中新煙堿農(nóng)藥的總平均檢出濃度（102.3 ng/g）以及啶蟲脒平均殘留濃度（98.4 ng/g），均顯著高于茶花粉（14.8 ng/g，2.6 ng/g）和油菜花粉（9.1 ng/g，3.1 ng/g）（t檢驗，P＜0.05）。雜花粉的高濃度殘留，主要來自于甘肅單一樣品的高濃度檢出，這可能與單一地區(qū)或單一種植區(qū)域農(nóng)藥大量施用有關(guān)。

2.2.3 不同地區(qū)蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況

如圖2所示，不同地區(qū)的蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況有較大差異，其中來自甘肅省的蜂花粉樣品檢出率和殘留濃度均高于其他省份。檢出率從高到低依次是甘肅省（77.8%）、江蘇省（55.6%）、河南?。?3.8%）、山東?。?0.0%）、四川?。?3.3%）和湖北?。?6.7%）；平均檢出濃度從高到低依次是甘肅?。?4.3 ng/g）、山東?。?1.4 ng/g）、河南?。?5.4 ng/g）、江蘇?。?.5 ng/g）、四川?。?.2 ng/g）和湖北?。?.5 ng/g）。甘肅地區(qū)的新煙堿農(nóng)藥主要來自于該地區(qū)的雜花粉樣品，而江蘇地區(qū)陽性樣品均為茶花粉。這說明新煙堿農(nóng)藥殘留區(qū)域性差異可能與不同地區(qū)作物種類、種植方式（輪作）、農(nóng)藥施用情況和施藥方式有關(guān)。

圖2 不同地區(qū)蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留情況Fig.2 The different residue of neonicotinoids in bee pollen samples of different provinces

2.3 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥的膳食攝入風險

近年來，風險評估已廣泛應(yīng)用于人類膳食中農(nóng)藥殘留的暴露風險，為保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供了理論依據(jù)[33]。通過計算RQ值來反映蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥殘留的膳食風險，分別取殘留濃度的中位值和最大值計算其長期膳食風險值和短期膳食風險值，結(jié)果見表2。蜂花粉樣品中5種新煙堿農(nóng)藥的長期膳食風險值（RQ1）在0.0006%～0.0021%之間，短期膳食風險值（RQ2）在0.0021%～0.1858%之間，均遠低于1%，啶蟲脒的RQ2最高，為0.1858%。與譚陽等[15]對蜂蜜中農(nóng)藥殘留風險評估的結(jié)果相近，均遠低于100%的判定標準，說明蜂花粉中的新煙堿農(nóng)藥殘留風險較低，可以接受。

表2 蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的膳食攝入風險評估Table 2 The dietary risk assessment of neonicotinoids residues in bee pollen samples

膳食風險評估結(jié)果顯示本研究中66批次蜂花粉樣品中新煙堿農(nóng)藥的殘留風險均可接受，僅有2批次樣品中的新煙堿農(nóng)藥殘留濃度超過歐盟規(guī)定的MRLs，但均低于日本MRL，整體殘留濃度較低。由于國內(nèi)外蜂花粉植物源存在一定差異，且膳食結(jié)構(gòu)不同，因此可以參照歐盟和日本等國的MRLs，并結(jié)合我國蜜粉源作物種植期間新煙堿農(nóng)藥田間施用量，以及主要人群膳食攝入蜂花粉情況，研制我國蜂產(chǎn)品中的新煙堿農(nóng)藥的MRLs。

農(nóng)藥殘留的風險評估過程中常存在一些不確定因素影響結(jié)果，導致無法完全依據(jù)現(xiàn)實情況測定風險，如蜂花粉一般作為沖調(diào)食品稀釋飲用，實際食用的農(nóng)藥濃度比蜂花粉中的殘留濃度要低；本研究中采用的蜂花粉日均攝入量可能與居民實際食用量存在一定差異，同時蜂花粉樣品中存在新煙堿農(nóng)藥多殘留的情況，需要進一步研究多殘留農(nóng)藥之間的毒性作用是否存在協(xié)同或拮抗。

3 結(jié)論

在檢測的66個蜂花粉樣品中，50.0%的樣品檢出新煙堿農(nóng)藥殘留，樣品最高檢出濃度200.7 ng/g，啶蟲脒和吡蟲啉的最高檢出濃度超出歐盟的最高限量標準。不同植物來源和地理來源的蜂花粉樣品間，新煙堿農(nóng)藥的殘留水平存在一定差異，這可能與新煙堿農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)施用行為有關(guān)。蜂花粉中新煙堿農(nóng)藥殘留的長期膳食和短期膳食攝入風險的評估結(jié)果均為低風險，在可接受范圍內(nèi)。本研究發(fā)現(xiàn)蜂花粉樣品中普遍存在多種藥物殘留的現(xiàn)象，但累積風險和協(xié)同作用尚不清楚，需要進一步研究。