基于UPLC-MS/MS分析紅豆杉鮮葉和茶葉非揮發(fā)性差異成分

李萌，耿婉茹，龐蕾，曲鳳鳳，王培強(qiáng)，王寶怡，王潔，張斌，張新富

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山東青島 266109）（2.濟(jì)南大學(xué)研究生院，山東濟(jì)南 250000）（3.山東理工大學(xué)檔案館，山東淄博 255049）（4.山東紫科曼地亞紅豆杉有限公司，山東淄博 255049）

紅豆杉（Taxus）是紅豆杉科紅豆杉屬的一種裸子植物，常綠喬木和小灌木，有較高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是第四紀(jì)冰川遺留下來的古老樹種，被稱為“植物中的黃金”[1]。紅豆杉植物在全世界約有11種，主要分布于北半球的溫帶至亞熱帶地區(qū)[2,3]。我國有6種，分別為中國紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、南方紅豆杉和曼地亞紅豆杉[3,4]。曼地亞紅豆杉（T. media）是東北紅豆杉（T. cuspidata）為母本和歐洲紅豆杉（T. baccata）為父本的天然雜交種，也是研究最廣泛的紅豆杉之一[5]。與其他紅豆杉植物相比，曼地亞紅豆杉生長速度快，對環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)[6,7]。

自紫杉醇（一種低毒、高效、廣譜的天然抗癌藥物，用于治療卵巢癌等多種疾病[7]）被美國科學(xué)家Wall等[8]和Schiff等[9]從短葉紅豆杉樹皮中分離提取得到，紅豆杉植物受到了極大的關(guān)注。Gai等[10]研究表明，在紅豆杉的枝條和樹葉中存在有益于健康的黃酮類化合物。此外，也在紅豆杉的其他組織中鑒定出氨基酸類、酚類、生物堿、木質(zhì)素和多糖等化合物[4,6,11]。據(jù)報(bào)道，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗炎和神經(jīng)藥理等作用，而且對乳腺癌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等具有顯著的抑制作用[12-14]。我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)名錄《本草綱目》和《盛景通志》中記載紅豆杉可用于治療霍亂、傷寒等癥[15]。紅豆杉葉可以入藥，具有消炎止痛、利尿消腫、治消化不良等功效。除此之外，相關(guān)研究表明，紅豆杉茶葉能夠顯著有效地抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的形成，具有很好的抗氧化和抗糖基化作用[16]，其提取物具有減輕倦怠、乏力、調(diào)節(jié)人體血脂等作用[17]。但關(guān)于紅豆杉葉加工成茶前后非揮發(fā)性成分變化的研究鮮有報(bào)道。

代謝組學(xué)作為獲得代謝信息和顯著識(shí)別不同代謝物的常用技術(shù)，廣泛用于鑒定和量化植物和食品等的代謝物研究。超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析主要側(cè)重于鑒定和定量非揮發(fā)性成分，如氨基酸、黃酮和有機(jī)酸等初級(jí)代謝物[18-20]。本研究以紅豆杉鮮葉（T. mediaFresh Leaves，TFL）及加工而成的紅豆杉茶葉（T. mediaTea，TT）為材料，通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析曼地亞紅豆杉鮮葉加工成茶前后的非揮發(fā)性成分種類和含量的差異變化，進(jìn)一步篩選出差異成分，闡明紅豆杉茶葉的非揮發(fā)性成分含量，為曼地亞紅豆杉葉茶的加工和利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

圖1 紅豆杉鮮葉TFL(a)和紅豆杉茶葉TT(b)Fig.1 T. media fresh leaves (a) and T. media tea (b)

試驗(yàn)樣品為曼地亞紅豆杉，由山東紫科曼地亞紅豆杉有限公司提供，采摘的鮮葉一部分置于液氮中轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫硪徊糠种瞥杉t豆杉茶葉。

甲醇（色譜級(jí)）、乙腈（色譜級(jí)），德國Meker公司；標(biāo)準(zhǔn)品（色譜級(jí)，純度＞99%），美國Sigma-Aldrich公司；純凈水，中國娃哈哈集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

6CST-40型殺青機(jī)，浙江上洋機(jī)械有限公司；6CR-30型揉捻機(jī)，浙江上洋機(jī)械有限公司；6CH94型烘干機(jī)，浙江上洋機(jī)械有限公司；DF-1140型分析天平，奧豪斯國際貿(mào)易有限公司；AB4500 Q TRAP四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Nexera X2超高效液相色譜系統(tǒng)，日本島津公司；Milli-Q Advantage A10純水系統(tǒng)，德國Merck Millipore公司；Scientz-100F冷凍干燥機(jī)，中國新芝生物公司；MC京制00000246精密天平，德國Sartorius公司；5430R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；G560E渦旋振蕩器，美國Industrial Industries公司；1083型恒溫振蕩水浴器，德國GFL公司；MM400冷凍混合研磨儀，德國Retsch公司。

1.3 方法

1.3.1 紅豆杉鮮葉的處理

將鮮葉從-80 ℃超低溫冰箱取出，置于冷凍干燥機(jī)中凍干（真空度2 Pa、溫度-50 ℃），凍干后的樣品放入-80 ℃冰箱備用。

1.3.2 紅豆杉茶葉的制備

工藝流程：鮮葉攤放（4 h）；殺青（220 ℃，3 min）；揉捻（輕10 min-重10 min-輕5 min）；初烘（150 ℃，25 min）；復(fù)烘（110 ℃，50 min）；成品茶，放置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品前處理

樣品用液氮研磨成均勻粉末，稱取100 mg于2 mL離心管中，加入1.2 mLφ=70%甲醇，渦旋30 s，30 min一次，共渦旋6次。離心10 min（12000 r/min）后吸取上清液至離心管中，用0.22 μm微孔濾膜過濾于進(jìn)樣瓶中，用于UPLC-MS/MS分析。各樣本均進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)。

1.3.4 UPLC-MS/MS條件

1.3.4.1 UPLC條件

色譜柱：Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A（φ=0.1%甲酸），流動(dòng)相B（乙腈）；梯度洗脫：0～9 min（95%～5% A），9～10 min（5% A）；10～11.10 min（5%～95% A）；11.10～14 min（95% A）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量4 μL。

1.3.4.2 MS/MS條件

電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI），溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓5500 V，氣體Ⅰ（GS Ⅰ）和氣體Ⅱ（GS Ⅱ）分別設(shè)置為55 psi和60 psi，簾氣（Curtain Gas，CUR）25 psi，碰撞氣體（氮?dú)猓? psi，碰撞誘導(dǎo)電離（Collision Gas，CAD）參數(shù)設(shè)置為高。

1.4 定性定量分析

定性分析：通過保留時(shí)間和峰形信息對不同樣品中的化合物質(zhì)譜峰進(jìn)行積分校正，以確保定性和定量分析的準(zhǔn)確性。通過比對標(biāo)準(zhǔn)品，武漢邁特維爾生物技術(shù)有限公司自建數(shù)據(jù)庫（Metware Database，MWDB）和化合物信息公共數(shù)據(jù)庫KNAPSAcK（http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK）等對TFL和TT中各化合物進(jìn)行分析鑒定。

定量分析：通過峰面積歸一法對得到的各化合物進(jìn)行相對定量，計(jì)算每種組分的峰面積與峰面積總和的比值，作為各化合物的相對含量。試驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft excel繪制圖表。使用SPSS軟件進(jìn)行差異顯著性分析。使用R（MetaboAnalystR）軟件進(jìn)行正交偏最小二乘法判別分析（Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis，OPLS-DA）繪圖，R（Base Package）軟件進(jìn)行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）和Venn繪圖。使用Mev繪制熱圖。采用變量投影重要性（Variable Important In Projection，VIP）和差異倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）對差異性成分進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物分析

通過UPLC-MS/MS對TFL和TT進(jìn)行檢測，得到化合物的總離子流圖和檢測多峰圖。兩種樣品共檢測出796種化合物，包括196種黃酮、139種酚酸、95種氨基酸及衍生物（以下稱“氨基酸類”）、91種有機(jī)酸、84種脂類、55種核苷酸及衍生物（以下稱“核苷酸類”）、15種生物堿和121種其他化合物，TFL和TT的部分化合物組成和含量存在顯著差異。

從圖2a可以看出樣本化合物在種類和數(shù)量上的差異，TFL檢測到的化合物有777種，TT中的化合物為768種。如圖2b所示，根據(jù)化合物在樣品中的有無篩選特有成分，有6類28種物質(zhì)只存在于TFL中；有6類19種物質(zhì)只存在于TT中；兩樣品之間共有化合物749種，可以看出TFL和TT由較為一致的化合物組成，加工工藝主要對樣品中化合物的含量產(chǎn)生顯著影響。

圖2 TFL和TT中化合物種類的數(shù)量(a)，Veen圖(b)，相對含量(c)，聚類熱圖(d)Fig.2 Number (a), Veen diagram (b), relative content (c) and clustering heat diagram (d) of compound species in TFL and TT

由圖2c和2d可知在加工前后各化合物含量也隨之發(fā)生變化，黃酮、氨基酸類、脂質(zhì)類化合物在TFL中顯著積累，黃酮類物質(zhì)含量占化合物的43.74%，根據(jù)結(jié)構(gòu)可以分為：黃酮醇、雙黃酮、異黃酮、黃烷醇類、花青素等。此外，異鼠李素僅在鮮葉中檢測到，其作為一種有力的抗氧化劑，廣泛存在于植物果實(shí)和葉片中[21]。其次是氨基酸類，占14.16%，L-異亮氨酸、L-正亮氨酸和L-亮氨酸等是在TFL中含量較高的氨基酸類化合物。有機(jī)酸類、酚酸類、核苷酸類、生物堿類和其他成分在TT中有較高積累。黃酮類化合物占非揮發(fā)組分的41.29%，扁蓄苷是在TFL和TT相對含量均最高的黃酮類物質(zhì)，扁蓄苷具有抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖、調(diào)控細(xì)胞周期的作用[22]。有機(jī)酸在TT中的含量僅次于黃酮占13.86%，檸康酸是TT中含量最高的有機(jī)酸，檸檬酸、異檸檬酸、蘋果酸等常見有機(jī)酸也被檢測到。酚酸在TT中的含量高于TFL，可以分為單羥基苯甲酸、雙羥基苯甲酸、三羥基苯甲酸等，Elansary等[23]研究表明紅豆杉中酚類成分可能有抗癌作用。而2-羥基腺苷、5-脫氧-5-甲硫腺苷等是核苷酸類中含量較高的化合物。劉茜等[24]發(fā)現(xiàn)紅豆杉的抗氧化作用可能與生物堿類成分密切相關(guān)，而7-O-乙?；仙?jí)A A是TT中含量最高的生物堿。此外，維生素、原花青素、糖及醇類等其他類在TT中也有較大比重。

黃酮類化合物是紅豆杉中的重要成分之一，具有抗癌抗腫瘤的作用[25,26]，研究發(fā)現(xiàn)，TFL和TT中含有豐富的黃酮類物質(zhì)。Sun等[16]研究表明，兒茶素、表兒茶素、沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素等化合物是紅豆杉茶葉中有效抗氧化成分，這些成分在試驗(yàn)中均被檢測到。此外，金松雙黃酮、芹菜素等成分也均被檢測到，與之前的研究結(jié)果一致[27]。紫杉醇被公認(rèn)為世界上最有效的植物抗癌藥[28]，先前研究報(bào)道，紫杉醇主要從紅豆杉植株的樹皮中提取制備，其含量約為干重的0.005%～0.07%[29]。已有研究表明，紫杉醇在曼地亞紅豆杉的種子中的相對含量最高，其次為樹皮、鮮葉、種皮[30]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫杉醇在曼地亞紅豆杉鮮葉中的相對含量為0.28%，加工成茶后其含量上升為0.56%，表明加工過程能夠促進(jìn)紫杉醇的形成。因此，通過將紅豆杉鮮葉加工成茶的方式提取紫杉醇，避免了剝?nèi)淦ぴ斐傻闹仓晁劳?，以更好的保護(hù)紅豆杉資源。

2.2 PCA分析

主成分分析為無監(jiān)督模識(shí)別的分析方法，通過對數(shù)據(jù)“簡化和降維”對代謝譜進(jìn)行處理歸納，顯示樣本組之間是否存在差異。通過PCA分析，可以直觀的從總體反映出TFL和TT中樣本組之間的差異度大小。由圖3a可知，第1主成分（PCA）和第2主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率分別為77.85%和6.93%，總貢獻(xiàn)率為84.78%，說明TFL和TT二者之間整體區(qū)分度較好。

圖3 TFL和TT化合物的PCA圖(a)和OPLS-DA圖(b)Fig.3 The PCA diagram (a) and the OPLS-DA diagram (b) of compounds in TFL and TT

2.3 OPLS-DA分析

進(jìn)一步采用有監(jiān)督的OPLS-DA模型分析796種化合物（圖3b）。在OPLS-DA中，主要通過參數(shù)指標(biāo)對模型質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，R2X越接近1，模型越穩(wěn)定可靠；R2Y越大，模型的解釋能力越強(qiáng)；Q2大于0.9，模型為出色的模型。由圖3b可以看出，各樣本在區(qū)間和組間區(qū)分效果較好，差異明顯。R2X=0.841，R2Y=1，Q2=0.995，說明本研究建立的OPLS-DA模型具有良好的擬合參數(shù)，該模型對TFL和TT具有良好的穩(wěn)定性和較好的預(yù)測能力，可以利用VIP值篩選差異成分。

2.4 差異化合物分析

基于OPLS-DA結(jié)果獲得的VIP值篩選差異化合物，通常認(rèn)為VIP≥1.0為差異顯著，VIP值越大，差異越顯著。進(jìn)一步結(jié)合FC值判斷變化趨勢。根據(jù)VIP＞1，fold change≥2和fold change≤0.5相結(jié)合的方法篩選得到差異化合物330種，氨基酸類63種，黃酮60種，脂類59種，酚酸51種，有機(jī)酸30種，核苷酸類22種，生物堿8種和其他化合物37種。

為了更直觀的觀察變化規(guī)律，對鑒定出的330種差異化合物進(jìn)行可視化處理，如圖4a和4b所示。有225種差異化合物顯著下降，這些物質(zhì)以氨基酸、脂質(zhì)、黃酮、酚酸等化合物為主，主要包括L-甘氨酰-L-異亮氨酸、γ-亞油酸、根皮素、松柏醇等，占所有化合物的28.26%，其中苯甲醛是下調(diào)最大的差異化合物。有105種差異化合物顯著增加，這些物質(zhì)以有機(jī)酸類為主，主要包括檸康酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、L-谷氨酸-O-葡萄糖苷等，占所有化合物的13.19%，其中檸康酸是上調(diào)最大的差異化合物。無差異顯著的化合物有446種，占56.03%。

圖4 TFL和TT的差異化合物熱圖(a)，差異化合物火山圖(b)，投影重要性示意圖(c)和基于log2FC值對關(guān)鍵差異化合物篩選(d)Fig.4 The heat map of differential compounds (a), the volcano diagram of differential compounds (b), the schematic diagram of the importance of projection (c), and screening of key difference compounds based on log2FC value (d) in TFL and TT

黃酮作為茶湯苦澀味的主要貢獻(xiàn)物，與茶湯口的感緊密相關(guān)，也是茶湯中重要的著色物質(zhì)[31]。在60種黃酮差異化合物中，39種化合物下調(diào)，21種化合物上調(diào)。槲皮素、柚皮素等大部分化合物的含量在加工后顯著下降，可能是在加工過程中發(fā)生了水解、酶促和氧化反應(yīng)，導(dǎo)致加工過程中產(chǎn)生苷元和糖體[32,33]。

氨基酸不僅是茶湯鮮爽的主要基礎(chǔ)物質(zhì)，還會(huì)影響茶的香氣和品質(zhì)[34]。在本研究中鑒定出63種氨基酸差異化合物，52種化合物下調(diào)，11種化合物上調(diào)，L-瓜氨酸則是TFL和TT中差異最大的氨基酸類化合物。在加工后，L-絲氨酸、L-賴氨酸等的含量顯著降低。N-乙酰-L-亮氨酸、L-谷氨酸-O-葡萄糖苷等的含量顯著增加，這些變化對茶湯的滋味有一定的影響。這可能是由于高溫和干燥的作用促進(jìn)了氨基酸的氧化和糖基化反應(yīng)，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生脫羧或脫氨[35]。在揉捻過程中細(xì)胞破碎率增加，也使得氨基酸的浸出加快[36]。因此，在加工過程中可以合理的減輕揉捻，降低殺青溫度，增加氨基酸物質(zhì)的積累。

本文檢測的各種脂類差異化合物，主要包括游離脂肪酸、甘油酯、溶血磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺，加工后除了1種游離脂肪酸（十五烷酸）有所上調(diào)，其余的化合物均呈下降趨勢。研究表明，脂類在供氧充足的情況下會(huì)氧化分解生成烴、醇和酸等化合物[37]。之前的研究表明，溫度對植物脂類風(fēng)味物質(zhì)的形成具有顯著性影響，在熱力下作用下可引起脂類降解[38,39]，從而表明脂類降解與加工溫度有關(guān)。

有機(jī)酸作為重要的呈味物質(zhì)，是碳水化合物分解的中間產(chǎn)物，同時(shí)抑制苦味和澀味[40]。在30種有機(jī)酸差異化合物中，吡咯-2-羧酸、檸康酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、茉莉酸甲酯是在加工后形成的獨(dú)特化合物，表明加工條件促進(jìn)了這些化合物的形成。在加工過程中，琥珀酸等常見有機(jī)酸的含量顯著增加，這些呈味物質(zhì)的含量變化對調(diào)和茶湯滋味起到了重要作用。

加工后原兒茶醛、對羥基苯甲酸、阿魏酸等酚酸類化合物含量顯著上調(diào)。相比之下，龍膽酸、原兒茶酸、咖啡酸在加工后顯著上調(diào)。此外，苯甲醛具有特殊的杏仁和堅(jiān)果香氣[41]，在加工后顯著下降。1,3,5-苯三酚在加工后顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明，在加工過程中可能發(fā)生了強(qiáng)烈的氧化還原和水解反應(yīng)，以促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化[42]。

茶湯的風(fēng)味與茶葉中滋味成分的含量及比例等都有密切關(guān)系。從結(jié)果可以看出加工工藝對于化合物的轉(zhuǎn)化特別重要。因此，可以通過調(diào)整加工過程中溫度、時(shí)間和其他影響化合物轉(zhuǎn)化的一些參數(shù)，降低茶湯的苦澀味，改善茶湯口感，從而獲得優(yōu)良風(fēng)味品質(zhì)的成茶。

2.5 關(guān)鍵差異化合物分析

圖4c為差異化合物VIP貢獻(xiàn)值最大的前20種物質(zhì)，其中11種化合物為上調(diào)趨勢，包括澳大利亞紫杉?jí)A、3,4-二羥基苯乙酸、檸康酸、(2'S3'R)-5-(N,N二甲基-3'-苯基異絲氨酰)-紅豆杉三烯A、3-O-甲基沒食子酸、1,3,5-苯三酚、3-羥基吡啶、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、1-甲基胍、茉莉酸甲酯、吡咯-2-羧酸；9種化合物為下調(diào)趨勢，包括9-過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸、苯甲醛、木犀草素-7-O-(6''-咖啡酰)鼠李糖苷、1,18-十八烷二醇、13-羥基十八烷基-9,11-二烯酸、異鼠李素、2,4,6-三羥基苯甲酸甲酯、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、L-甘氨酰-L-脯氨酸。

進(jìn)一步進(jìn)行l(wèi)og2處理，比較TFL和TT化合物的差異倍數(shù)，前20種差異化合物如圖4d所示。與TFL相比，上調(diào)的前10種差異化合物包括檸康酸（23.50倍）、3,5-二羥基-3-甲基戊酸（20.73倍）、(2'S3'R)-5-(N,N二甲基-3'-苯基異絲氨酰)-紅豆杉三烯A（18.64倍）、1,3,5-苯三酚（18.33倍）、澳大利亞紫杉?jí)A（16.96倍）、L-谷氨酰胺-O-葡萄糖苷（15.16倍）、丁香醛-4-O-葡萄糖苷（14.36倍）、核酮糖-5-磷酸（14.09倍）、3-羥基吡啶（13.58倍）、吡咯-2-羧酸（13.41倍）；下調(diào)的前10種差異化合物包括苯甲醛（-18.48倍）、橙皮素-7-O-葡萄糖苷（-17.06倍）、L-瓜氨酸（-15.27倍）、9-過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸（-14.71倍）、二氫阿魏酸（-14.39倍）、L-巖藻糖（-14.23倍）、芥子酸（-13.00倍）、木犀草素-7-O-(6''-咖啡酰)鼠李糖苷（-12.94倍）、N-乙酰-D-半乳糖胺（-12.84倍）、琥珀酸半醛（-12.15倍）。

綜上所述，根據(jù)VIP值和FC值結(jié)合分析可知TFL和TT中11種關(guān)鍵差異代謝物為檸康酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、(2'S3'R)-5-(N,N二甲基-3'-苯基異絲氨酰)-紅豆杉三烯A、1,3,5-苯三酚、澳大利亞紫杉?jí)A、3-羥基吡啶、吡咯-2-羧酸在TT中含量較高；苯甲醛、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、9-過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸、木犀草素-7-O-(6''-咖啡酰)鼠李糖苷在TFL中含量較高。

2.6 差異化合物通路分析

通過KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫對差異化合物進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果（圖5a）顯示主要分布在20條代謝途徑中，差異化合物數(shù)量富集最多的前3條通路分別是①代謝產(chǎn)物的生物合成通路（Metabolic Pathways，圖5b），主要包括苯甲醛、L-巖藻糖、柚皮素、以及關(guān)鍵差異代謝物檸康酸等123種化合物，在此通路上有39種化合物上調(diào)，84種化合物下調(diào)；②次生代謝物的生物合成通路（Biosynthesis of Secondary Metabolites，圖5c），主要包括茉莉酸甲酯、根皮素、香橙素以及3,5-二羥基-3-甲基戊酸等86種化合物，在此通路上有23種化合物上調(diào)，45種化合物下調(diào)；③輔因子的生物合成通路（Biosynthesis of Cofactors，圖5d），主要包括L-酪胺、煙酰胺、視黃醇，L-酪氨酸等29種化合物，在此通路上有10種化合物上調(diào)，19種化合物下調(diào)。

圖5 TFL和TT差異化合物KEGG富集圖(a)和KEGG通路圖(b～d)Fig.5 The KEGG enrichment diagram (a) and KEGG pathway diagram (b～d) of differential compounds in TFL and TT

3 結(jié)論

本研究通過廣泛靶向代謝組學(xué)探究了紅豆杉鮮葉加工成茶前后非揮發(fā)性化合物種類和含量的差異變化。在TFL和TT中共檢測出796種化合物，兩種樣本在物質(zhì)種類和數(shù)量上的組成基本一致。根據(jù)PCA結(jié)合OPLS-DA篩選出差異化合物330種，其中氨基酸、脂質(zhì)、黃酮、酚酸等255種化合物顯著降低，有機(jī)酸等105種化合物顯著增加。TFL和TT的關(guān)鍵差異化合物有11種，檸康酸、3,5-二羥基-3-甲基戊酸、(2'S3'R)-5-(N,N二甲基-3'-苯基異絲氨酰)-紅豆杉三烯A、1,3,5-苯三酚、澳大利亞紫杉?jí)A、3-羥基吡啶、吡咯-2-羧酸在TT中含量較高；苯甲醛、橙皮素-7-O-葡萄糖苷、9-過氧-10E,12Z-十八碳二烯酸、木犀草素-7-O-(6''-咖啡酰)鼠李糖苷在TFL中含量較高。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異化合物進(jìn)行通路富集分析，找到了差異化合物數(shù)量富集最多的前3條通路，分別是①代謝產(chǎn)物的生物合成通路；②次生代謝物的生物合成通路；③輔因子的生物合成通路。本項(xiàng)研究僅對紅豆杉鮮葉加工成茶前后的非揮發(fā)性成分進(jìn)行了初步比較，所檢測到的物質(zhì)可為紅豆杉鮮葉的功能研究及開發(fā)利用提供一定的參考。未來，紅豆杉葉茶的生物利用度和體內(nèi)有益作用應(yīng)受到更多關(guān)注。