高霞,馮慶祥,胡楊,尹濤,尤娟,熊善柏,劉茹
(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心,國(guó)家大宗淡水魚(yú)加工技術(shù)研發(fā)分中心(武漢),湖北武漢 430070)
魚(yú)糜制品因高蛋白、低脂肪、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富而廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)[1,2]。商業(yè)生產(chǎn)時(shí),需加入2%~3%氯化鈉(Sodium Chloride,NaCl)使魚(yú)糜中的鹽溶性蛋白充分溶解[3]。加熱過(guò)程中,溶出的蛋白伸展并暴露部分活性基團(tuán)[4],分子間發(fā)生相互作用,形成有序結(jié)構(gòu)的彈性凝膠體[5,6]。但是,鹽含量攝入過(guò)多易引發(fā)心血管疾病,不利于人體健康。諸多學(xué)者報(bào)道了魚(yú)糜制品生產(chǎn)時(shí)的減鹽措施,包括使用鈉鹽替代物、添加外源親水膠體、使用新興高新技術(shù)等[7-9]。其中,前期實(shí)驗(yàn)室研究[10,11]發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度超聲波技術(shù)(10~1000 W/cm2,20~100 kHz)可促進(jìn)肌球蛋白溶解,提高低鹽(1%,m/m)魚(yú)糜凝膠的質(zhì)構(gòu)性能,但降低了高鹽(>3%)魚(yú)糜凝膠的質(zhì)構(gòu)性能,推測(cè)這與超聲強(qiáng)度及鹽含量等因素有關(guān)。目前,大多數(shù)研究集中于超聲強(qiáng)度或鹽含量單因素對(duì)魚(yú)糜凝膠性能的影響[12-14],然而,關(guān)于超聲功率、時(shí)間及鹽含量三者同時(shí)施加對(duì)魚(yú)糜凝膠性能的影響鮮有報(bào)道。
二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)是一種將正交與回歸融為一體的試驗(yàn)方法,可用較少的實(shí)驗(yàn)組合實(shí)現(xiàn)與完全實(shí)施實(shí)驗(yàn)相同項(xiàng)數(shù)的回歸模型,并且旋轉(zhuǎn)性使得預(yù)測(cè)值的方差處處相等[15]。應(yīng)用二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)可同時(shí)研究多個(gè)單因素水平對(duì)響應(yīng)值的影響,是一種較好的設(shè)計(jì)方案。
本實(shí)驗(yàn)以鰱魚(yú)糜為原料,采用二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)研究超聲功率、時(shí)間及鹽含量三者同時(shí)對(duì)魚(yú)糜凝膠TCA-可溶性肽的影響,同時(shí)測(cè)定魚(yú)糜凝膠色度與持水性的變化,通過(guò)建立非線性回歸方程、繪制響應(yīng)面解析三因素的貢獻(xiàn)度及因素間的交互作用,探討超聲處理對(duì)不同鹽含量魚(yú)糜中蛋白質(zhì)降解情況及凝膠品質(zhì)的影響,以期為高強(qiáng)度超聲輔助魚(yú)糜凝膠的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。
冷凍鰱魚(yú)糜[AAA級(jí),水分含量為73.26%(m/m)],由井力水產(chǎn)食品有限公司提供。福林酚、氯化鈉等均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;K600食品調(diào)理機(jī),德國(guó)博朗電器公司;TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀,美國(guó)Stable micro system公司;1750型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),日本島津公司;色度計(jì),美國(guó)Hunter Lab公司;硬度計(jì),日本Kiya Seisakusho公司。
1.3.1 高強(qiáng)度超聲波處理與魚(yú)糜凝膠樣品制備
取150 g魚(yú)糜于真空袋(160×240×0.2 mm)中并封口,將其置于超聲清洗槽中,加入4 L冰水控制超聲溫度為(15±2)℃進(jìn)行超聲處理。
魚(yú)糜凝膠的制備參考本實(shí)驗(yàn)室前期[16]的方法。將魚(yú)糜用食品調(diào)理機(jī)空斬3 min,通過(guò)添加冰水調(diào)節(jié)水分含量至78%,加入NaCl后繼續(xù)斬拌5 min。斬拌后的肉糜經(jīng)抽真空、灌腸后,于40 ℃加熱1 h、90 ℃加熱0.5 h。加熱結(jié)束后,立即將魚(yú)糜凝膠置于流動(dòng)水下冷卻,然后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰箱存放過(guò)夜,第二天進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。
研究高強(qiáng)度超聲功率單因素對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時(shí),實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為:功率0~300 W,時(shí)間10 min,鹽含量2%(m/m);研究超聲時(shí)間單因素對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時(shí),實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為:時(shí)間0~40 min,功率180 W,鹽含量2%(m/m);研究鹽含量單因素對(duì)魚(yú)糜凝膠質(zhì)構(gòu)性能的影響時(shí),實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置為:鹽含量0~2%(m/m),功率180 W,時(shí)間15 min。
1.3.2 質(zhì)構(gòu)性能測(cè)定
將魚(yú)糜凝膠于室溫中平衡0.5 h,剝?nèi)ツc衣后,切成2 cm高的圓柱體。選用P/0.25S球形探頭測(cè)定樣品的破斷力與凹陷深度,測(cè)試參數(shù)設(shè)置為:探頭運(yùn)行程序Return to start,測(cè)前速度2 mm/s,測(cè)中速度1 mm/s,測(cè)后速度2 mm/s,觸發(fā)力5 g。每個(gè)樣品測(cè)試6~10個(gè)平行。
1.3.3 TCA-可溶性肽測(cè)定
取3 g魚(yú)糜凝膠樣品,加入5%(m/V)冷的TCA溶液(27 mL),并用高速分散機(jī)于6000 r/min下均質(zhì)1 min。均質(zhì)液于4 ℃下放置1 h,10000 r/min離心10 min后保留上清液。上清液中TCA-可溶性肽含量的測(cè)定參考Lowry法[17],用酪氨酸作標(biāo)曲。
1.3.4 色度測(cè)定
將魚(yú)糜凝膠切成5 mm厚的薄片,使用色度計(jì)測(cè)定樣品的L*(亮度值)、a*(紅綠值)、b*(黃藍(lán)值)。魚(yú)糜凝膠的白度值(Whiteness,記為B)按下式計(jì)算:
式中:
B——白度;
L*——亮度值;
a*——紅綠值;
b*——黃藍(lán)值。
1.3.5 持水性測(cè)定
將樣品切成5 mm厚,記錄其質(zhì)量W1,用三層濾紙包裹薄片,使用硬度計(jì)對(duì)其施加5 kg恒力并持續(xù)3 min,去除濾紙后稱量樣品質(zhì)量,記為W2。持水性(Water Holding Capacity,WHC)按下式計(jì)算:
式中:
C——持水性(WHC),%;
W2——壓后樣品質(zhì)量,g;
W1——壓前樣品質(zhì)量,g。
根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,運(yùn)用中心組合設(shè)計(jì)原理[6],以超聲功率、時(shí)間及鹽含量為自變量,TCA-可溶性肽、色度及持水性為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn),因素水平表及組合設(shè)計(jì)表分別見(jiàn)表1、表2。采用SAS9.0軟件對(duì)二次旋轉(zhuǎn)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行非線性回歸擬合,二階多項(xiàng)式如下:
表1 二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factor level table of quadratic rotation orthogonal design
表2 二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of quadratic rotation orthogonal design
式中:
Y——響應(yīng)值;
β——方程的回歸系數(shù);
Xi、Xj——因素水平。
所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù),每次至少3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 9.0軟件作圖,SPSS 22.0軟件中的Duncan方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),P<0.05表示數(shù)據(jù)間差異顯著。
2.1.1 高強(qiáng)度超聲功率對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響
高強(qiáng)度超聲功率對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響如圖1所示。與對(duì)照組相比,超聲處理后魚(yú)糜凝膠的破斷力顯著升高(P<0.05),且隨著超聲功率增大呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在240 W時(shí)獲得最大值(452.21 g),較對(duì)照組提高了19.64%。有研究表明魚(yú)糜凝膠的破斷力與蛋白質(zhì)分子間的相互作用有關(guān)[18]。魚(yú)糜中的功能性蛋白是鹽溶性肌球蛋白[11],其良好的分散性是促進(jìn)分子間相互作用的重要前提。前期研究發(fā)現(xiàn)[10]高強(qiáng)度超聲處理顯著提高了肌球蛋白的溶解度,這有利于提高魚(yú)糜凝膠的破斷力。類(lèi)似地,尹藝霖等[19]研究表明增大超聲功率促進(jìn)了肌原纖維蛋白的分散性,從而提高了蛋白凝膠性能。此外,由圖1可知,魚(yú)糜凝膠的凹陷深度隨超聲功率增大呈現(xiàn)先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率為180、210、240 W時(shí),魚(yú)糜凝膠的破斷力與凹陷深度無(wú)顯著差異(P>0.05),故選取180 W超聲功率為二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)的零水平值。
圖1 高強(qiáng)度超聲功率對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.1 Effect of HIU power-on the breaking force and deformation of surimi gels
2.1.2 高強(qiáng)度超聲時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響
根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,固定超聲功率為180 W,研究了超聲時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響,結(jié)果見(jiàn)圖2。魚(yú)糜凝膠的破斷力隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)呈先升高后下降的趨勢(shì),在15 min時(shí)獲得最大值440.10 g,較未超聲處理提高了8.90%。高強(qiáng)度超聲處理適當(dāng)時(shí)間時(shí),其產(chǎn)生的空穴效應(yīng)及高剪切力、微射流等機(jī)械效應(yīng)能夠提高魚(yú)糜中蛋白質(zhì)分子的分散性[20],這有利于促進(jìn)熱誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白質(zhì)間發(fā)生相互作用,破斷力增大;然而,超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí),蛋白質(zhì)易發(fā)生降解[21],從而降低了魚(yú)糜凝膠的破斷力。類(lèi)似地,Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)相較于超聲時(shí)間15 min時(shí),超聲處理30 min后蝦肉糜凝膠的破斷力顯著降低(P<0.05)。此外,魚(yú)糜凝膠的凹陷深度隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著變化(P>0.05)。
圖2 高強(qiáng)度超聲時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.2 Effect of HIU time on the breaking force and deformation of surimi gels
2.1.3 鹽含量對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響
圖3為鹽含量對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響。未添加NaCl時(shí),樣品的破斷力與凹陷深度較低,僅為193.03 g、5.46 mm。隨著鹽含量升高,魚(yú)糜凝膠的破斷力與凹陷深度顯著增大(P<0.05),當(dāng)鹽含量為2.0%(m/m)時(shí),其破斷力與凹陷深度較對(duì)照組分別提高了127.16%、97.89%。魚(yú)糜膠凝過(guò)程中,蛋白質(zhì)分子(尤其鹽溶性蛋白)發(fā)生解折疊暴露出活性位點(diǎn),促進(jìn)了分子間相互作用,形成質(zhì)地良好的彈性凝膠體[2]。低鹽環(huán)境中,肌球蛋白主要以組裝體形式存在[23],溶解性較低,限制了加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)分子的變性與聚集,從而魚(yú)糜凝膠質(zhì)地較差。增加鹽含量提高了肌球蛋白的溶出與分散性[10],有利于熱誘導(dǎo)時(shí)蛋白質(zhì)分子充分伸展,從而促進(jìn)分子間發(fā)生相互作用,使得魚(yú)糜凝膠的破斷力與凹陷深度顯著增大。該結(jié)果與Cando等[24]的報(bào)道一致。
圖3 鹽含量對(duì)魚(yú)糜凝膠破斷力與凹陷深度的影響Fig.3 Effect of NaCl contents on the breaking force and deformation of surimi gels
在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,分別選取超聲功率180 W、時(shí)間15 min及鹽含量1.5%(m/m)為中心水平,設(shè)計(jì)三因素五水平的二次旋轉(zhuǎn)正交實(shí)驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表1。
2.2.1 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同含鹽量魚(yú)糜凝膠TCA-可溶性肽的影響
TCA-可溶性肽可表征蛋白質(zhì)的降解程度,其數(shù)值越大說(shuō)明小分子肽含量越多,蛋白質(zhì)降解程度越高[16]。采用二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)研究了超聲功率、時(shí)間及鹽含量對(duì)魚(yú)糜凝膠TCA-可溶性肽的影響,結(jié)果如表2所示。二次旋轉(zhuǎn)正交設(shè)計(jì)共包含23組實(shí)驗(yàn),其中9組設(shè)置為零水平的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行方差分析,結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析結(jié)果表明,回歸方程Y=0.5198-0.0015X1-0.0048X2-0.1162X3+0.000002X12+0.00002X1X2+0.00005X22+0.0003X1X3+0.0175X32具有顯著性(R2=0.93,P<0.01),說(shuō)明該模型適用于描述本實(shí)驗(yàn)條件下TCA-可溶性肽的變化。
表3 TCA-可溶性肽的回歸系數(shù)與方差分析Table 3 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for TCA-soluble peptides
根據(jù)主因素回歸系數(shù)的絕對(duì)值判斷,鹽含量對(duì)TCA-可溶性肽的影響最大,超聲時(shí)間次之,超聲功率的影響最小。觀察表3發(fā)現(xiàn),超聲功率、時(shí)間均與TCA-可溶性肽呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。魚(yú)糜中含有內(nèi)源性蛋白酶[25],可將蛋白質(zhì)水解為小分子肽。據(jù)此結(jié)果推測(cè)超聲波處理可抑制內(nèi)源性蛋白酶的活性,削弱了其水解能力。有研究表明超聲波與傳統(tǒng)加熱聯(lián)用可有效抑制過(guò)氧化氫酶的活性[26],胃蛋白酶和胰蛋白酶經(jīng)305.62 W/cm2強(qiáng)度超聲處理18 min后,活性分別下降了15%和50%[27,28],類(lèi)似地,Zhang等[29]通過(guò)研究超聲波輔助凝膠化發(fā)現(xiàn)超聲波處理抑制了羅非魚(yú)內(nèi)源性蛋白酶的活性。關(guān)于超聲處理對(duì)內(nèi)源性蛋白酶活性的影響及機(jī)理有待進(jìn)一步研究。
此外,方差分析指出鹽含量與TCA-可溶性肽呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),即TCA-可溶性肽隨鹽含量升高而降低,這可能與內(nèi)源性蛋白酶活性受離子強(qiáng)度影響有關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)[11],當(dāng)鹽含量提高至5%時(shí),魚(yú)糜中TCA-可溶性肽較1%鹽含量時(shí)下降了23.22%。相似地,Ohkubo等[30]對(duì)白魚(yú)中內(nèi)源性蛋白酶活性的研究發(fā)現(xiàn),增大鹽含量至3%即可抑制蛋白酶的活性。
由表3可知,X1X3(超聲功率-鹽含量)、X1X2(超聲功率-時(shí)間)的交互作用對(duì)TCA-可溶性肽具有顯著影響(P<0.05),因此繪制響應(yīng)面解析兩因素間的交互作用,結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4a可知,低鹽條件下(0、0.5%),TCA-可溶性肽隨超聲功率升高而降低,說(shuō)明超聲處理協(xié)同低鹽條件可抑制蛋白質(zhì)的降解,推測(cè)這與超聲處理抑制蛋白酶活有關(guān)。該結(jié)果一定程度上解釋了高強(qiáng)度超聲協(xié)同低鹽后魚(yú)糜凝膠的破斷力與凹陷深度升高[31];然而,高鹽條件下(2%、3%),TCA-可溶性肽隨超聲功率升高而升高,這不利于魚(yú)糜凝膠品質(zhì)。鹽含量增加,魚(yú)糜中肌球蛋白的溶解性提高,推測(cè)分散性良好的蛋白質(zhì)分子經(jīng)超聲處理后更易發(fā)生降解,易損害魚(yú)糜的凝膠品質(zhì)。觀察圖4b發(fā)現(xiàn),超聲功率較低(≤150 W)時(shí),隨時(shí)間延長(zhǎng),魚(yú)糜凝膠的TCA-可溶性肽含量逐漸降低;然而,當(dāng)超聲功率高達(dá)240 W時(shí),TCA-可溶性肽隨超聲時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。該結(jié)果說(shuō)明,當(dāng)超聲強(qiáng)度較低時(shí),延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于更大程度地抑制蛋白酶活性,但是當(dāng)超聲強(qiáng)度較大時(shí),長(zhǎng)時(shí)間超聲處理也會(huì)造成蛋白質(zhì)分子降解,產(chǎn)生更多TCA-可溶性肽。
圖4 超聲功率-鹽含量(a)與超聲功率-時(shí)間(b)的交互作用對(duì)TCA-可溶性肽的影響Fig.4 Effect of interactive effect of HIU power-salt contents (a)and HIU power-time (b) on the TCA-soluble peptides
2.2.2 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同含鹽量魚(yú)糜凝膠色度的影響
色度是評(píng)價(jià)魚(yú)糜制品品質(zhì)的重要指標(biāo)[32],由表4可知,色度的回歸模型均具有顯著性(P<0.01)。超聲功率與L*、b*、白度值顯著正相關(guān)(P<0.01),增大超聲功率可獲得白度較大的魚(yú)糜凝膠,推測(cè)這與超聲處理誘導(dǎo)形成了致密的凝膠結(jié)構(gòu)有關(guān)[33],從而樣品表面光反射率變大,白度值增加。此外,鹽含量與a*、b*呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01),即鹽含量降低,魚(yú)糜凝膠的紅綠值、黃藍(lán)值增大。a*取決于魚(yú)糜中肌紅蛋白的含量[34],當(dāng)鹽含量降低時(shí),魚(yú)糜在膠凝過(guò)程中易發(fā)生蒸煮損失,析出較多水分,推測(cè)肌紅蛋白的濃度因此增大,導(dǎo)致a*升高。Pietrasik和Li-Chan[6]也報(bào)道了類(lèi)似的結(jié)果。超聲時(shí)間對(duì)各指標(biāo)無(wú)顯著影響(P>0.05)。進(jìn)一步觀察表4發(fā)現(xiàn),超聲功率、時(shí)間及鹽含量間的交互作用對(duì)色度影響不顯著(P>0.05)。
表4 色度的回歸系數(shù)與方差分析Table 4 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for color values
2.2.3 高強(qiáng)度超聲處理對(duì)不同含鹽量魚(yú)糜凝膠持水性的影響
持水性可用于表征蛋白質(zhì)與水分子之間的結(jié)合能力[35]。方差分析(表5)顯示,持水性方程具有顯著性(R2=0.85,P<0.01),且魚(yú)糜凝膠的持水性與鹽含量成正比(P<0.01),即增大鹽含量,魚(yú)糜凝膠持水性隨之提升。隨鹽含量升高,由于電荷屏蔽效應(yīng)使肌原纖維蛋白之間的靜電斥力增大[10],肌球蛋白溶出增多,蛋白質(zhì)分散得更好,形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)更加致密均勻[11],提升了對(duì)水分子的截留能力。
表5 持水性的回歸系數(shù)與方差分析Table 5 Regression coefficients and analysis of variance of the regression models for WHC
觀察表5發(fā)現(xiàn),超聲功率及時(shí)間對(duì)魚(yú)糜凝膠持水性無(wú)顯著影響(P>0.05),這似乎與前期實(shí)驗(yàn)[16]相矛盾,但其實(shí)不然,本實(shí)驗(yàn)的超聲參數(shù)與文獻(xiàn)報(bào)道存在差異。另外,由表5可知,鹽含量對(duì)持水性的影響最大,其回歸系數(shù)(29.435)遠(yuǎn)大于超聲功率(0.032)與時(shí)間(0.228)的回歸系數(shù),推測(cè)鹽含量水平削弱了超聲功率及時(shí)間水平對(duì)凝膠持水性的影響。
用于評(píng)價(jià)魚(yú)糜凝膠品質(zhì)的模型均具有顯著性(P<0.01),且各因素對(duì)魚(yú)糜凝膠品質(zhì)影響的貢獻(xiàn)度依次為鹽含量>超聲時(shí)間>超聲功率。主因素分析表明鹽含量與TCA-可溶性肽呈負(fù)相關(guān),增大鹽含量可抑制蛋白質(zhì)降解,從而獲得持水性較高和紅度值較低的凝膠體。此外,交互作用分析揭示了低鹽與超聲功率間存在協(xié)同效應(yīng),增大超聲功率降低了低鹽魚(yú)糜中蛋白質(zhì)的降解程度,提高了其持水性。綜上,高強(qiáng)度超聲波的應(yīng)用可抑制低鹽環(huán)境中蛋白質(zhì)的降解,這有利于提高低鹽魚(yú)糜的凝膠性能。