天冬多糖的復合酶提取工藝優(yōu)化及其理化性質、吸濕性和抗氧化活性

王麗，羅明銳，高金雨，阮元，陳景國，張雪海，麻兵繼

（1.河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450052）（2.鄭州大學農學院，河南鄭州 450046）（3.蚌埠市食品藥品檢驗中心，安徽蚌埠 233000）

天冬為百合科植物天門冬[Asparagus cochinchinensis(Lour.) Merr.]的塊根[1]，為藥食同源的補陰中藥材，具有養(yǎng)陰潤燥，清肺生津的功效。常作為藥酒、滋補藥膳、保健飲品和蜜餞等的原料[2]，主產于廣西、四川和貴州等地。天冬最初由《神農本草經》所載[3]，并被列為上品，研究表明，天冬含有豐富的化學組成，包括多糖、皂苷、氨基酸等[4]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗炎、祛痰止咳、降血壓等藥理作用[5]。多糖作為其主要的成分之一，因其具有抗氧化、增強免疫、抗衰老等，擁有廣闊的開發(fā)前景[6-9]。目前，天冬粗多糖（Asparagus cochinchinensisCrude Polysaccharide，ACP）的提取方法有水提取法、超聲提取法、酶提取法。其中水提取法最為普遍，但其耗時長、效率低。酶可促進細胞壁的降解，釋放更多的多糖，該方法是一種綠色、環(huán)保、能耗低的工藝。曹淵等[10]采用超聲復合酶提取天冬多糖，并獲得最佳提取工藝，其多糖得率是水提取的3.7倍。然而，超聲易導致多糖的降解，不利于其結構完整性的保留[9,10]。本課題組前期通過考察不同提取方法對天冬粗多糖的影響，篩選出復合酶提取法獲得天冬粗多糖純度好、得率高，且條件溫，有利于粗多糖結構完整性的保留。因此，本實驗采用復合酶提取天冬粗多糖，考察提取時間、溫度、加酶量和緩沖液pH值與粗多糖得率的關系，并用Design-Expert軟件進行響應面實驗設計優(yōu)化工藝參數(shù)[11-14]，確定最佳提取工藝條件，并對最優(yōu)條件獲得的天冬粗多糖基本組成、吸濕性和抗氧化活性等進行研究，為ACP的綜合利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天冬（廣西省玉林市）；苯酚；濃硫酸溶液；無水碳酸鈉；無水硫酸銨；無水乙醇；變色硅膠；甘油；透明質酸鈉；木瓜蛋白酶；果膠酶；纖維素酶；FeSO4溶液；水楊酸·乙醇溶液；H2O2溶液；ABTS+試劑；DPPH溶液；鐵氰化鉀溶液。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計；旋轉蒸發(fā)儀，河南鄭州市亞榮儀器設備公司；恒溫條件水浴鍋，江蘇金壇城東光芒儀表廠；循環(huán)水式真空泵，鄭州杜甫儀表廠；離心機，安徽嘉文儀表技術裝備公司；冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 ACP提取方法

將天冬樣品置于60.0 ℃烘箱中烘干后粉碎，按料液比1:3（g/mL）加入體積分數(shù)95%乙醇浸泡12.0 h，收取濾渣；粗多糖提取兩次，稱取一定質量的復合酶（纖維素酶:果膠酶:木瓜蛋白酶=1:1:1），兩次提取均按照單因素實驗表1條件提取粗多糖。提取后在100 ℃下滅活30 min。按照單因素實驗表1條件提取粗多糖。

表1 Box-Behnken設計因素水平表Table 1 Box-Behnken design factor level

1.3.2 復合酶法提取ACP的單因素實驗

1.3.2.1 溫度對ACP得率的影響

稱取1.0 g的天冬干粉，設定保持不變的提取條件如下，提取時間為4.0 h，緩沖液pH值為5.0，酶底質量比為1.0%?？疾焯崛囟?0.0、35.0、40.0、45.0、50.0 ℃對ACP得率的影響。

1.3.2.2 緩沖液pH值對ACP得率的影響

同上，設定其余保持不變，將溫度改成最優(yōu)溫度?？疾炀彌_液pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0對ACP得率的影響。

1.3.2.3 提取時間對ACP得率的影響

同上，設定其余保持不變的實驗提取條件如下，將pH值改成最適pH值?？疾焯崛r間2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 h對ACP得率的影響。

1.3.2.4 酶底質量比對ACP得率的影響

同上，設定其余保持不變，將提取時間改成最適提取時間?？疾烀傅踪|量比0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%對ACP得率的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素實驗結果，自變量選擇提取時間（A）、提取溫度（B）、酶底質量比（C）、緩沖液pH值（D）四個因素。以復合酶法提取ACP的得率（Y）為響應值，使用響應面軟件Design-Expert 12設計4因素3水平Box-Behnken試驗，進行響應面分析試驗，優(yōu)化方案和結果見表1。

1.4 ACP物化指標

1.4.1 化學成分測定

采用苯酚-硫酸法、考馬斯亮藍法和福林酚法分別測定ACP粉末中粗多糖、蛋白質和多酚含量[5,15,16]。

1.4.2 單糖組成分析

使用高效陰離子交換色譜法和脈沖安培檢測法，檢測ACP的單糖組成。稱取5.0 mg粗多糖樣品粉末，加入5.0 mL三氟乙酸溶液，在121.0 ℃的條件下水解4.0 h。水解液用0.1 mol/L NaOH溶液稀釋20倍，過濾后注入檢測系統(tǒng)，測定樣品和標準品的單糖組成。

1.4.3 紅外光譜分析

將2.0 mg ACP粉末和干燥的KBr混合均勻，研磨并將混合物壓成顆粒，并在400～4000 cm-1的頻率范圍內觀測ACP樣品的紅外吸收光譜。

1.4.4 剛果紅分析

將1.0 mL ACP（1.0 mg/mL）溶液加入到1.0 mL剛果紅溶液（50.0 μmoL）中。在混合物中加入不同體積的NaOH溶液（1.0 mol/L，0.0～2.0 mL），逐漸將NaOH濃度增加到0.5 mol/L（0.00、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45和0.50 mol/L），采用相同體積的去離子水代替粗多糖溶液做對照。分別測定上述粗多糖樣品和對照樣品溶液在400～600 nm波長范圍內溶液的最大吸收波長。

1.5 抗氧化活性測定

體外測定ACP對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl，DPPH）、羥基和2,2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis(3-Ethylbenzothiazoline-6-Sulfonic Acid)，ABTS+）自由基的清除活性進而測定ACP抗氧化活性[5,15,16]。

1.6 吸濕性測定

鑒于我國國內城市平均濕度跨度在45.0%（烏魯木齊）和84.0%（鄭州/成都）之間，選擇相對濕度43.0%的飽和碳酸鈉溶液和相對濕度81.0%的飽和硫酸銨溶液[17]。準確稱取100 mg ACP、透明質酸鈉和甘油，分別置于飽和碳酸鈉溶液（相對濕度43.0%）和飽和硫酸銨溶液（相對濕度81.0%）的干燥器中，分別在1.0、3.0、6.0、12.0、24.0、36.0、48.0 h稱量樣品質量。按下式計算吸濕率。

式中：

R——吸濕率，%；

W2——原始樣品質量，g；

W1——吸濕后樣品質量，g。

1.7 數(shù)據(jù)分析

所有實驗數(shù)據(jù)以三次重復的平均值±標準差表示。響應面回歸模型通過Design-Expert12軟件建立與擬合；分析采用Statistical Product and Service Solutions（SPSS）統(tǒng)計軟件（18.0版本）對組間平均值的差異進行單因素方差分析（One-way Analysis of Variance，ANOVA）；0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對ACP得率的影響

提取時間對ACP得率的變化關系如圖1a。在0.0～4.0 h范圍內，ACP的得率隨著時間延長不斷增加，且在3.0～4.0 h范圍內明顯上升，在4.0 h時達到最高為19.78%。因此最適宜提取時間為4.0 h。

圖1 提取時間（a）、溫度（b）、酶底質量比（c）和緩沖液ph值（d）對ACP得率的影響Fig.1 Effect of extraction time (a), temperature (b), enzyme to substrate mass ratio (c) and buffer water solution pH (d) on the yield of ACP

2.1.2 提取溫度對ACP得率的影響

提取溫度對ACP得率的變化關系如圖1b。在30.0～60.0 ℃范圍內，ACP的得率隨著提取溫度的上升不斷增加。當提取溫度為40.0 ℃的時候，ACP的得率達到最大值，為17.78%。因此最適溫度為40.0 ℃。

2.1.3 酶底質量比對ACP得率的影響

酶底質量比對ACP得率變化關系如圖1c。在酶底質量比在0.0%～2.5%的范圍內，ACP的得率隨著酶底質量比的增加不斷增加。當酶底質量比為1.5%的時候，ACP的得率達到最大值，為19.56%。所以最適酶底質量比為1.5%。

2.1.4 緩沖液pH值對ACP得率的影響

緩沖液pH值對ACP得率變化關系如圖1d。在4.0～6.0的范圍內，ACP得率隨著緩沖液pH值的增加不斷增加。當緩沖液pH值為5.0時，得率達到最大19.12%。所以最適緩沖液pH值為5.0。

2.2 響應面優(yōu)化結果

2.2.1 Box-Behnken實驗結果分析

響應面試驗設計及試驗結果見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 響應面回歸模型的建立與擬合

通過Design-Expert 12軟件分析得到回歸方程如下：

Y=92.352+4.4725A+2.34B-1.7325C+0.3067D+0.8625AB-7.395AC+3.72AD+5.5975BC+3.57BD+8.405CD-7.3805A2-7.0793B2-12.6205C2-4.1568D2。

由表3所示，A、B、AC、BC、CD、A2、B2、C2、對ACP的得率都表現(xiàn)出極顯著性影響（P＜0.01），說明提取時間、溫度和酶底質量比是天冬復合酶法提取粗多糖的重要影響因素。該模型F=26.18，P＜0.01，極顯著，而失擬項為0.9977（P＞0.05），相對于純誤差差異無統(tǒng)計學意義，相關系數(shù)（R2=0.96）和校正絕對系數(shù)R2Adj=0.92，說明說明模型擬合良好[11,18-21]。以上可得出結論，試驗模型合理正確，可以使用該模型對復合酶法提取ACP得率進行分析和預測。

表3 Box-Behnken實驗方差分析結果Table 3 Results of variance analysis of Box-Behnken experiment

2.2.3 響應面與等高線圖分析

固定回歸方程的提取時間、提取溫度、酶底質量比、緩沖液pH值因素，分別獲得相應的曲面圖與等高線圖。如圖2～7所示，提取溫度，酶底質量比和提取時間對粗多糖得率的影響曲線較陡，說明其對ACP提取得率的影響較為顯著，而緩沖液pH值對粗多糖得率的影響曲線較緩，說明緩沖液pH值對ACP提取得率影響不顯著。

圖2 Y=f（A，B）的響應面和等高線圖（C=0，D=0）Fig.2 Response surface and contourmap of y=f (A, B) (C=0,d=0)

圖3 Y=f（A，C）的響應面和等高線圖（B=0，D=0）Fig.3 Response surface and contourmap of y=f (A, C) (B=0,D=0)

圖4 Y=f（A，D）的響應面和等高線圖（B=0，C=0）Fig.4 Response surface and contourmap of y=f (A, D) (B=0,C=0)

圖5 Y=f（B，C）的響應面和等高線圖（A=0，D=0）Fig.5 Response surface and contourmap of y=f (B, C) (A=0,D=0)

圖6 Y=f（B，D）的響應面和等高線圖（A=0，C=0）Fig.6 Response surface and contourmap of y=f (B, D) (A=0,C=0)

圖7 Y=f（C，D）的響應面和等高線圖（A=0，B=0）Fig.7 Response surface and contourmap of y=f (C, D) (A=0,B=0)

圖8 ACP單糖組成的離子色譜圖Fig.8 The ion-chromatography of ACP monosaccharide composition

2.2.4 確定最佳點與驗證

為了進一步確定最佳值的點，對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零。

求解方程組得到復合酶法提取ACP最優(yōu)提取條件為提取時間4.6 h，提取溫度42.8 ℃，酶底質量比1.5%，緩沖液pH值5.4。考慮到實際工藝的可操作性，將最優(yōu)提取工藝調整為提取時間4.5 h，提取溫度42.0 ℃，酶底質量比1.5%，緩沖液pH值5.3。為了證明Box-Behnken的正確性和合理性，使用上述得到的最優(yōu)提取條件，通過三次平行測定實驗，ACP的平均得率為18.54%。該得率與模型預測最大值相對誤差小于1.0%，說明本響應面實驗優(yōu)化ACP的提取工藝是有效的。

2.3 ACP物化指標

2.3.1 ACP化學組成

利用離子交換色譜法，測定ACP的單糖組成。結果如表4所示，ACP由8種單糖組成，分別為巖藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸。其中，葡萄糖、果糖、巖藻糖、半乳糖和木糖為主要單糖，且摩爾比為53.91:26.00:6.19:5.33:4.53。如表5所示，ACP的粗多糖、蛋白質和多酚含量分別為95.49%、1.07%和0.11%。ACP中粗多糖含量高于采用水提法提取的天冬多糖（TD-80）（63.1%）和（ARP）（93.7%）[8,9]。以上結果表明提取得到的ACP的純度較高。

表4 ACP的單糖組成Table 4 Monosaccharide composition of ACP

表5 ACP中糖、蛋白質和多酚含量Table 5 Carbohydrate, protein and polyphenolic contents of ACP

2.3.2 紅外光譜分析

紅外光譜通常用于檢測多糖的特征有機基團，3411、2933、1743、1411和1109 cm-1處的吸收峰是多糖的典型特征[22]。如圖9a所示，3400 cm-1處的強吸收峰表明O-H基團的存在[23]；3000～2800 cm-1范圍內的吸收峰歸因于C-H拉伸和彎曲振動，包括CH、CH2和CH3；約在1740和1630 cm-1處吸收峰可能由于C=O拉伸振動和不對稱拉伸引起，說明糖醛酸的存在[24]。指紋區(qū)1200～800 cm-1處吸收峰與糖苷鍵的構型有關，1036 cm-1和1109 cm-1的吸收峰由C-O-C和C-O-H拉伸振動引起，表明ACP中存在吡喃糖環(huán)，822 cm-1處的吸收峰表明ACP存在α-構型[25]。

圖9 ACP紅外(a)和剛果紅(b)分析Fig.9 FT-IR spectra (a) and Congo red (b) of ACP

圖10 ACP對DPPH、羥基和ABTS+自由基的清除能力Fig.10 DPPH, OH and ABTS+ free radical scavenging capacity of ACP

2.3.3 剛果紅分析

剛果紅法用于檢測多糖中的三螺旋構象，多糖的三螺旋結構影響其生物活性[26]。氫氧化鈉濃度對剛果紅多糖復合物λmax的影響如圖9b所示，隨著氫氧化鈉濃度的增加，剛果紅-ACP溶液的λmax相對于空白組（剛果紅溶液）發(fā)生紅移。可知，ACP具有三螺旋結構。

2.4 ACP抗氧化能力

因為多糖的大多數(shù)生物活性與其抗氧化性能有關[27]，所以本實驗通過檢測DPPH、羥基和ABTS+清除力探究ACP的抗氧化活性。

2.5 ACP的吸濕性測定

由圖11a、11b可知，在相同濃度下，相對濕度43%條件下的吸濕率從大到?。篈CP＞甘油＞透明質酸鈉；相對濕度81%條件下的吸濕率從大到?。焊视停続CP＞透明質酸鈉，吸濕率均隨著時間的增加而降低。在同一時間下，ACP在相對濕度43%條件下的吸濕率均高于相對濕度81%條件下的吸濕率。在相對濕度43%條件下，ACP的吸濕性在36.0 h達到了最大值，且在相對濕度43%和81%條件下，ACP最大吸濕率差異不顯著（P＞0.05）。這些結果說明增加相對濕度，不能增大吸濕性。該結果與黃秋葵多糖、銀耳多糖等中藥植物多糖相比，ACP具有更強的吸濕性[17,28]。

圖11 相對濕度43%（a）、81%（b）條件下的吸濕率Fig.11 Moisture absorption under relative humidity of 43% (a),81% (b)

3 討論

多糖的化學結構是其生物活性的物質基礎，且植物源多糖由于其副作用和毒性低，越來越受到人們的關注[29-31]。本研究以復合酶法得到ACP，得率為18.54%。傳統(tǒng)的水提法得到天冬多糖TD-80和ARP的主要單糖組成分別為半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸（摩爾比3.16:15.70:25.90）和半乳糖、葡萄糖和半乳糖醛酸（摩爾比4.42:12.66:4.83）[8,9]。Sun等[32]從天冬中提取得到一種新型菊粉型多糖。菊粉屬于果聚糖碳水化合物，通常由20至60個單體組成。單糖組成結果表明ACP主要由葡萄糖（53.91%）組成。由此可知，復合酶法獲得的天冬粗多糖區(qū)別于傳統(tǒng)方法獲得的多糖為新型的天冬多糖?？寡趸钚越Y果表明，ACP具有良好的清除自由基（DPPH，羥基和ABTS+）活性，與、長角豆多糖西府海棠果實多糖的研究結果一致[33-35]。在吸濕性實驗中，ACP在相對濕度43%條件下的吸濕率高于甘油和透明質酸鈉。這些結果說明天冬粗多糖具有較高的抗氧化活性和較優(yōu)的吸濕特性。

4 結論

采用復合酶法提取天冬粗多糖，通過單因素實驗選取提取時間、提取溫度、酶底質量比和緩沖液pH值作為優(yōu)化ACP得率的4個因素，通過Box-Behnken實驗和響應面優(yōu)化獲得最優(yōu)提取工藝為提取時間4.5 h，提取溫度42.0 ℃，酶底質量比1.5%，緩沖液pH值5.3，得率為18.5%。物化指標結果表明，ACP純度為95.45%，蛋白質和多酚含量分別為1.07%和0.11%；ACP主要由葡萄糖、果糖、巖藻糖、半乳糖和木糖組成，摩爾比為53.91:26.00:6.19:5.33:4.53，且具有雙螺旋結構。紅外光譜分析表明ACP為α構型的吡喃糖。另外，ACP具有較強的抗氧化活性和吸濕性能。關于ACP的精細結構、結構-特性、結構-活性的關系，以及更多的生物活性研究仍需更深入的研究。